吡咯并吡咯二酮类化合物/四苯乙烯类化合物复合纳米粒子在次氯酸根离子检测中的应用的制作方法

本发明涉及一种具备荧光能量转移纳米粒子，特别涉及一种由吡咯并吡咯二酮类化合物和四苯乙烯类化合物组装而成的具备荧光共振能量转移效应(fret)的复合纳米粒子，用于水体中clo^-检测或细胞内环境成像，实现clo^-高效检测的方法，属于生物检测领域。

背景技术

生物活性氧化物小分子在生理和病理方面具有重要作用，其浓度水平反映了细胞的生理病理状态，其中次氯酸根作为生物体内一种重要的活性氧化物参与生物体内的许多生理过程对身体健康具有很重要的作用，但是过量的次氯酸会引起各种组织损伤和疾病包括心血管疾病和肺损伤等。由于生物体内的次氯酸成弱酸性(pka＝7.63)，生理环境中活性高并且存在时间短。因此设计出一种高选择性识别次氯酸根的荧光探针具有很重要的意义。目前检测次氯酸根的荧光探针主要基于次氯酸的强氧化性进行设计，包括次氯酸诱导的硫/硒氧化、肟氧化、富电子基团氧化、双键氧化和螺内酰胺氧化等，但是大多数探针具有量子效率低、抗光漂白性差、自体荧光强、水溶性差及选择性差等不足，因此迫切需要设计出响应速度快、选择性好的次氯酸荧光探针。

不同于单分子荧光探针，荧光纳米探针具有抗光漂白性好，荧光量子效率高，水溶性好以及易于功能化等优点逐渐受到研究人员的青睐。其中，具有荧光共振能量转移(fret)效应的荧光纳米探针可实现对被分析物的比率型检测，可有效地较小生物环境背景荧光的干扰，是一种具有良好应用前景的探针构建形式。目前，fret纳米探针的制备多用到无机重金属材料，其潜在的安全威胁是一个不可避免的问题。纯有机fret纳米探针的制备则受到有机荧光材料的聚集荧光淬灭(acq)效应的桎梏。

技术实现要素：

针对现有技术存在的缺陷，本发明的目的是在于提供一种吡咯并吡咯二酮类化合物/四苯乙烯类化合物复合纳米粒子作为clo^-检测的fret比率型探针的应用。吡咯并吡咯二酮类化合物/四苯乙烯类化合物复合纳米粒子利用吡咯并吡咯二酮类分子具有对clo^-的专一性识别能力，同时具有强的荧光发射以及双光子诱导荧光发射的特点，而四苯乙烯类分子可以作为fret纳米粒子的能量给体的特点，实现clo^-的高灵敏性和选择性比率型检测或比率型双通道细胞成像。

为了实现上述技术目的，本发明提供了一种吡咯并吡咯二酮类化合物/四苯乙烯类化合物复合纳米粒子的应用，其作为荧光探针应用于次氯酸根离子的检测或成像。

优选的方案，所述吡咯并吡咯二酮类化合物/四苯乙烯类化合物复合纳米粒子由吡咯并吡咯二酮类化合物和四苯乙烯类化合物通过分子自组装形成；

所述四苯乙烯类化合物具有式1结构：

所述吡咯并吡咯二酮类化合物具有式2结构：

其中，

r和r1独立选自亲水基团；

r2和r3独立选自噻吩基、噻吩衍生物基团、呋喃基、呋喃衍生物基团、苯基、苯衍生物基团、吡啶基及吡啶衍生物基团。

优选的方案，r和r1独立选自烷氧链、糖类基团或其他水溶性基团，r2和r3为噻吩基、呋喃基、苯基或吡啶基。r和r1主要作用是增加吡咯并吡咯二酮类化合物和四苯乙烯类化合物的亲水性，理论上来说，所有的亲水基团均满足要求，上述例举的是本领域常见的亲水基团。

本发明的吡咯并吡咯二酮类化合物中r2和r3主要是增加分子的共轭体系，因此一般的芳基或芳杂环基均满足要求，上述例举了几种常见的，易于获得的取代基团。

本发明的吡咯并吡咯二酮类化合物和四苯乙烯类化合物均按照现有文献报道的常规方法合成获得购买得到。

本发明的吡咯并吡咯二酮类化合物/四苯乙烯类化合物复合纳米粒子中吡咯二酮类化合物作为能量给体，四苯乙烯类化合物作为能量受体。本发明的吡咯并吡咯二酮衍生物易于被次氯酸根氧化分解，而四苯乙烯类化合物荧光分子(fret能量给体)不发生变化。

优选的方案，所述吡咯并吡咯二酮类化合物/四苯乙烯类化合物复合纳米粒子由吡咯并吡咯二酮类化合物和四苯乙烯类化合物按摩尔比1:3～5通过分子自组装形成。

优选的方案，吡咯并吡咯二酮类化合物/四苯乙烯类化合物复合纳米粒子应用于水体系中次氯酸根离子的比率型检测或细胞内环境中次氯酸根离子的比率型成像分析。

本发明的吡咯并吡咯二酮类化合物/四苯乙烯类化合物复合纳米粒子具有双荧光发射功能。

本发明的吡咯并吡咯二酮类化合物/四苯乙烯类化合物复合纳米粒子的制备方法，该方法是将吡咯并吡咯二酮类化合物和四苯乙烯类化合物加入水中，超声处理，即得。

优选的方案，吡咯并吡咯二酮类化合物和四苯乙烯类化合物按摩尔比1:3～5。

优选的方案，吡咯并吡咯二酮类化合物和四苯乙烯类化合物在水中的总浓度为30～60μm/l。

本发明的技术方案将亲水修饰的四苯乙烯类分子与亲水修饰的吡咯并吡咯二酮类分子通过自组装获得稳定的fret荧光纳米颗粒。四苯乙烯类分子其本身是一种典型的聚集诱导发光(aie)分子，将其fret能量给体，同时引入一种吡咯并吡咯二酮类荧光分子作为clo^-的识别单元，从而构建一种比率型的纳米传感器，可以用于clo^-的比率型检测。

相对现有技术，本发明的技术方案带来的有益技术效果：

本发明的吡咯并吡咯二酮类化合物/四苯乙烯类化合物复合纳米粒子中的吡咯并吡咯二酮类分子具有对clo^-的专一性识别能力，易于被clo^-选择性氧化分解，同时具有强的荧光发射以及双光子诱导荧光发射，而四苯乙烯类分子作为fret纳米粒子的能量给体，从而可以实现clo^-的高选择性和灵敏性比率型检测以及比率型双通道细胞成像。

本发明的fret纳米粒子中四苯乙烯类分子和吡咯并吡咯二酮类分子共组装形成胶束，四苯乙烯类分子起到维持纳米胶束的稳定结构的作用，能保持多功能纳米粒子的稳定性。

本发明的吡咯并吡咯二酮类化合物/四苯乙烯类化合物复合纳米粒子制备方法简单、低成本，有利于大规模生产应用。

附图说明

【图1】为吡咯并吡咯二酮类化合物和四苯乙烯类化合物自组装成fret纳米粒子的示意图；

【图2】为fret纳米粒子的粒径以及荧光图谱；

【图3】为随着不同浓度clo^-的加入，fret纳米粒子的荧光发射光谱图；

【图4】为fret纳米粒子对不同活性氧的荧光响应柱状图；

【图5】为fret纳米粒子用于海拉细胞中的clo^-荧光成像。

具体实施方式

为了更好地理解本发明专利的内容，下面通过具体的实例和图例来进一步说明本发明的技术方案。但这些实施实例并不限制本发明。

实施例1

基于噻吩基吡咯并吡咯二酮衍生物的fret纳米粒子的制备。如图1所示，此实施例以两种烷氧基(低聚聚乙二醇)修饰的荧光分子(ndpp和tpe1，两者分子式如图1所示)为原料来制备fret纳米粒子。在水中，按ndpp:tpe1为1:4的比例加入两种荧光化合物，使其总浓度为50μm/l。超声1分钟后制备成所需复合纳米颗粒。如图2所示，左图所示为透射电镜(tem)测量的fret纳米粒子粒径形貌，说明ndpp和tpe1共组装可获得球形的规整颗粒。图2中右图为纳米颗粒的荧光发射图。通过对比可知，与ndpp混合后，tpe1颗粒的荧光强度相比于之前较少了约87％，这说明了两分子之间存在强烈的fret效应。

实施例2

fret纳米粒子对clo^-响应的荧光发射光谱如图3所示。在水溶液中，fret纳米粒子fret纳米粒子在490nm和554nm均有发射峰，分别对应于tpe1和ndpp的特征荧光发射。随着clo^-的加入，tpe1的荧光逐渐增强，而ndpp的荧光强度逐渐减弱。通过图3中右图所得拟合曲线的斜率可计算出，该fret纳米粒子在水中fret纳米粒子对clo^-的检测限能达到92nm，可用于水环境中clo^-的实时监控。

实施例3

fret纳米粒子对clo^-响应的专一性考察如图4所示。用pbs缓冲液配制8份fret纳米粒子的水溶液，编号1-8。然后往1-8样品中分别加入水，h2o2,^·oh,¹o2,no^·,onoo^-,t-buooh和clo^-。图谱表明：除clo^-外，其他活性氧对溶液的荧光发射几乎没有影响。该对比试验说明本发明中的fret纳米粒子在clo^-检测中具有良好的选择性。

实施例4

fret纳米粒子对细胞中clo^-荧光成像的应用如图5所示。在培养好的具有适宜细胞浓度的培养皿中，加入50μm/l的fret纳米粒子dpbs溶液孵育0.5小时。用dpbs溶液洗去培养皿中的fret纳米粒子后，采用共聚焦荧光显微镜对细胞进行成像。如图5所示，fret纳米粒子可以很好地进入海拉细胞，两种通道所得荧光图片均可清晰显示细胞质和细胞核。随着次氯酸钠溶液浓度的增加，细胞内蓝色通道(420-520nm)的荧光信号逐渐增强，而绿色通道(530-650nm)的荧光信号逐渐减弱。这可基本实现细胞内clo^-的比率型荧光成像。