一种检测H2S的FRET荧光探针及制备方法和应用

一种检测h2s的fret荧光探针及制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及生物传感领域，具体涉及一种检测h2s的fret荧光探针及制备方法和应用。


背景技术：

2.目前越来越多的证据证明，内源性h2s的正常产生与多种生物过程的调控有关，包括胰岛素释放的调控，血管生成的刺激，神经元传递的调控，以及代谢率的降低。h2s在人体内主要以hs-形式存在。hs-浓度异常导致许多疾病，例如阿尔茨海默氏病，糖尿病，唐氏综合症，肝硬化和高血压。因此，对生物系统中的hs-的精确灵敏检测具有重要意义。
3.尽管目前已经设计了许多用于h2s检测的小分子荧光探针，但是与纳米材料联合构建fret平台并用于细胞及动物水平的探针却鲜有报道，开发一种高灵敏的、可用于细胞及动物水平的探针仍然具有挑战性。本发明设计了一种与荧光碳点结合且具有红色荧光发射的fret型探针cds@nnch，该探针最大发射波长处于红光区600nm处，对h2s具有高度的特异性响应。此外，由于其突出的生物相容性，cds@nnch已成功应用于人肺泡腺癌基底上皮细胞(a549)、斑马鱼及裸鼠中h2s的检测，在相关疾病的诊断中具有显著的生物、医学应用潜力。


技术实现要素：

4.针对上述问题本发明提供一种检测h2s的fret荧光探针及制备方法和应用。该探针是由荧光碳点及红色荧光小分子nnch制备而成。该探针由于具有优异的fret性质，正常情况下cds的荧光较弱，主要表现为nnch的红色荧光；而加入hs-(h2s体内存在的一种形式)后，由于nnch与hs-结合，抑制了fret途径，使cds的535nm处的荧光明显增强，而nnch在600nm处的荧光减弱，通过荧光的比率变化，灵敏的检测h2s。此外，该探针具有较强的选择性和特异性及突出的细胞相容性，可被应用于细胞及动物水平h2s的检测。
5.为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：
6.一种检测h2s的fret荧光探针，所述探针是由绿色荧光碳点cds和h2s响应分子nnch合成而成，所述h2s响应分子nnch的化学结构式为：
[0007][0008]
一种检测h2s的fret荧光探针的制备方法，包括以下步骤
[0009]
(1)以对氨基水杨酸和邻苯二胺为原料合成绿色荧光碳点cds；
[0010]
(2)利用2,3,3-三甲基吲哚、4-溴甲基苯甲酸和对二胺基苯乙醛合成h2s响应分子nnch；
[0011]
(3)通过绿色荧光碳点cds和h2s响应分子nnch的静电结合，得到检测h2s的fret荧光探针cds@nnch。
[0012]
进一步，所述步骤(1)中的合成是将邻苯二胺和对氨基水杨酸溶于超纯水中，待完全溶解后将混合溶液转移至聚四氟乙烯反应釜中，然后将反应釜置于烘箱中反应，待反应完成，将反应釜转移至室温自然冷却，反应混合液离心，上清液通过滤膜过滤，将得到的棕色溶液透析，透析完成后的液体冷冻干燥，得到的粉末即为绿色荧光碳点cds；
[0013]
所述步骤(2)中的合成是将2,3,3-三甲基吲哚和4-溴甲基苯甲酸溶解于乙腈中，混合溶液回流反应过夜，过滤收集所得固体，乙腈洗涤，得到粉棕色固体；将粉棕色固体和对二胺基苯乙醛溶于乙酸，搅拌回流，然后减压旋除溶剂，粗产物使用柱色谱进行分离纯化，收集产物，减压浓缩，得到紫色粉末状固体即h2s响应分子nnch(反应式如图2所示)；
[0014]
所述步骤(3)中的静电结合是将绿色荧光碳点cds和h2s响应分子nnch配制成溶液，各取100μl，充分震荡，得到检测h2s的fret荧光探针。
[0015]
更进一步，步骤(1)中所述邻苯二胺和对氨基水杨酸的用量分别为0.340g和0.820g；
[0016]
步骤(2)中所述的2,3,3-三甲基吲哚、4-溴甲基苯甲酸、粉棕色固体和对二胺基苯乙醛的投药量分别为11.0mmol、13.0mmol、1.00mmol和3.00mmol；
[0017]
步骤(3)中所述的绿色荧光碳点cds溶液的浓度为0.50mg/ml，h2s响应分子nnch溶液为浓度为0.200mmol/l。
[0018]
更进一步，步骤(1)中所述反应温度为200℃，反应时间为5h；所述离心的速率为10000rpm，时间为10min；所述的透析的时间为27h；
[0019]
步骤(2)中所述的柱色谱用洗脱剂是体积比为10:1的二氯甲烷与甲醇的混合物。
[0020]
一种检测h2s的fret荧光探针的应用，所述探针用于细胞层面上内源性和外源性h2s的检测。
[0021]
一种检测h2s的fret荧光探针的应用，所述探针用于斑马鱼和裸鼠中外源性h2s的检测。
[0022]
一种检测h2s的fret荧光探针的应用，所述探针用于动物体荧光成像。
[0023]
与现有技术相比本发明具有以下优点：
[0024]
1.本发明的h2s的fret荧光检测探针以荧光碳点作为能量供体，原料易得，合成步骤简单，具有极佳的生物相容性。
[0025]
2.红色荧光探针nnch合成步骤简单，合成条件温和，具有更长的发射波长，组织穿透能力强，检测背景低，且该材料与碳点结合后，复合物呈现良好的生物相容性，体内外可对h2s进行快速、高选择性响应。
[0026]
3.该探针的荧光性质不受其他阴离子、活性硫、氨基酸的影响，具有较好的特异性和稳定性，且对于h2s可快速响应，在生理条件下响应最明显，具有极佳的生物应用潜力。
[0027]
4.由于良好的生物相容性好，可应用于细胞、斑马鱼和小鼠体内的h2s灵敏检测。
附图说明
[0028]
图1为本发明所涉及化合物nnch的化学结构式；
[0029]
图2为本发明所涉及化合物nnch的反应式；
[0030]
图3为本发明所涉及化合物nnch的1h nmr谱图；
[0031]
图4为本发明所涉及化合物nnch的
13
c nmr谱图；
[0032]
图5为本发明荧光探针cds@nnch离子选择性结果；
[0033]
图6(a)为本发明荧光探针cds@nnch对不同浓度hs-的响应时间测定，(b)荧光探针cds@nnch对hs-最佳响应的ph范围；
[0034]
图7为本发明荧光探针cds@nnch对hs-的检测灵敏性及检测线性图；
[0035]
图8为本发明荧光探针cds@nnch对a549细胞毒性测试图；
[0036]
图9为本发明荧光探针cds@nnch在a549细胞内检测外源性hs-；
[0037]
图10为本发明荧光探针cds@nnch在a549细胞内检测内源性hs-；
[0038]
图11为本发明荧光探针cds@nnch在斑马鱼中检测hs-的荧光成像图；
[0039]
图12为本发明荧光探针cds@nnch在裸鼠中检测hs-的活体荧光成像图。
具体实施方式
[0040]
实施例1
[0041]
一种检测h2s的fret荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0042]
新型绿色荧光碳点的合成：称取0.340g邻苯二胺和0.820g对氨基水杨酸溶于25.0ml超纯水中，待完全溶解后将混合液转移至聚四氟乙烯反应釜中，然后将反应釜置于200℃的烘箱中反应5h。待反应完成，将反应釜转移至室温自然冷却，反应混合液离心(10000rpm，10min)除去较大的固体颗粒，上清液通过0.220μm水系微孔滤膜过滤。将得到的棕色溶液透析24h(透析袋截留量分子为1000da)。透析完成后的液体冷冻干燥，得到的粉末即为绿色荧光碳点cds。
[0043]
(2)h2s响应分子nnch的合成：将2,3,3-三甲基吲哚(1.75g，11.0mmol)和4-溴甲基苯甲酸(2.80g，13.0mmol)溶解在含有20.0ml乙腈的圆底烧瓶中。混合溶液回流反应过夜，过滤收集所得固体。乙腈洗涤，得到粉棕色固体。无需进一步的提纯，直接取上述的粉棕色固体(0.360g，1.00mmol)和对二胺基苯乙醛(0.530g，3.00mmol)加入含有20.0ml乙酸的圆
底烧瓶中，在50℃下搅拌回流12h，然后减压旋除溶剂。粗产物使用柱色谱进行分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝10:1，v/v)，收集产物，减压浓缩，得到紫色粉末状固体即nnch。
[0044]
如图3所示，化合物nnch的1h nmr谱，1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.37(d,j＝15.6hz,2h),8.07(d,j＝8.0hz,2h),7.86(d,j＝8.0hz,2h),7.70(d,j＝5.6hz,1h),7.41-7.49(m,4h),7.18(d,j＝15.2hz,1h),6.90(d,j＝8.8hz,2h),5.79(s,2h),3.58
–
3.63(m,4h),1.88(s,6h),1.28(t,j＝14.0hz,6h)。如图4所示，化合物nnch的
13
c nmr谱，
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ179.81,167.65,155.70,154.08,142.17,141.57,138.96,130.34,128.85,127.29,126.34,122.52,122.44,112.75,112.42,102.95,50.99,48.45,48.24,48.03,47.82,47.60,47.39,47.18,46.96,44.87,26.34,11.51。
[0045]
(3)检测h2s的fret荧光探针cds@nnch的合成：配制母液浓度为1.00g/l的cds溶液和母液浓度为0.200mmol/l的nnch溶液。各取100μl，充分振荡，得到cds@nnch。
[0046]
实施例2
[0047]
荧光探针的离子选择性探究：
[0048]
将实施例1中制备的荧光探针cds@nnch配制成母液，实验分为19组，各加入2.00ml超纯水，再加入100μl的cds@nnch(10.0μmol/l)并混合均匀，然后分别加入配制好相近浓度的离子溶液，混合均匀后室温下放置3min，测量荧光强度。如图5所示，只有hs-的加入使cds@nnch的荧光强度比值明显升高，而其它阴离子对其几乎没有影响，说明合成的cds@nnch对hs-具有高度选择性。
[0049]
实施例3
[0050]
荧光探针cds@nnch对hs-的响应时间及最佳响应的ph范围测定：
[0051]
实验分五组，各加入2.00ml超纯水，再加入100μl的cds@nnch并混合均匀，然后分别加入0，15，25，50，75μmol/l的hs-溶液，在8个时间段测试五组含有不同浓度hs-的cds@nnch荧光强度。结果如图6(a)所示，在不同浓度时，cds@nn与hs-的反应在90s时到达平台期，可见cds@nnch在该反应体系中性质稳定，与hs-反应灵敏且在短时间内即可响应hs-。
[0052]
将荧光探针cds@nnch(10.0μmol/l)置于不同ph值的pbs中，再加入150μl hs-(对照组不加hs-)，将上述溶液充分混合均匀并在室温条件下放置3min，然后用荧光光谱仪进行测定，记录荧光强度并观察ph对cds@nnch荧光强度的影响。结果如图6(b)所示，对照组中cds@nnch在(f535/f600)处的荧光强度比在不同ph值下没有明显变化，表明探针cds@nnch的良好的稳定性。而添加hs-后导致荧光强度比值增强，且在ph为7.5的时候荧光强度比值增强最大。这为cds@nnch应用于生理条件(ph7.4)下检测hs-奠定了基础。
[0053]
实施例4
[0054]
荧光探针对hs-的灵敏性测试：
[0055]
取100μl配制好的cds@nnch溶液于2.00ml的超纯水中，测量含有0，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70和75μmol/l的hs-溶液的荧光光谱。测试条件：室温环境，ph为7.4，反应时间3min。结果如图7所示，hs-浓度在0-25μmol/l范围内荧光强度比(f535/f600)与hs-浓度具有良好的线性关系，检出限为1.495μmol/l。检出限低，可以灵敏的检测hs-。
[0056]
实施例5
[0057]
荧光探针对细胞存活率的影响：
[0058]
待细胞生长密度达到80％后，接种在96孔板中。24h后，加入等量含有不同浓度的cds@nnch(0，5，10，20，40，60，80，100，120和150μg/ml)，继续孵育24h后，向每孔中各加入mtt，继续孵育4h。弃去mtt溶液，加入dmso溶液，室温下在摇床上振荡20min后用酶标仪测定490nm处的吸光度。计算存活率。结果如图8所示，当cds@nnch的浓度高达150μg/ml时，细胞存活率仍在80％以上，由此证明cds@nnch具有低毒性。
[0059]
实施例6
[0060]
荧光探针cds@nnch在细胞层面上检测外源性hs-：
[0061]
将细胞接种于共聚焦皿中孵育培养。待细胞贴壁以后，分为三组，在各组加入100μl cds@nnch(10.0μmol/l)，继续孵育3h，然后分别在第二组和第三组加入25.0μl和75.0μl hs-(1.00mmol/l)，继续孵育30min，吸去加药的培养液，pbs清洗，用4％的多聚甲醛固定，利用激光共聚焦扫描显微镜进行成像。结果如图9所示，单独cds@nnch进入细胞时，绿色通道荧光弱而红色通道荧光强，这是因为单独cds@nnch发生fret效应。随着加入hs-浓度的增大，绿色通道荧光逐渐增强而红色通道荧光逐渐减弱，因为加入hs-后会破坏fret效应，恢复cds的荧光。综上所述，该荧光探针cds@nnch可以在细胞层面上检测外源性hs-。
[0062]
实施例7
[0063]
荧光探针cds@nnch在细胞层面上检测内源性hs-：
[0064]
设置三组实验，在三组中都加入含有100μl cds@nnch(10.0μmol/l)的培养基，继续孵育3h，吸去加药的培养液，pbs清洗，然后在第二组加入100μl hs-内源性刺激剂snp(5.0μmol/l)，继续孵育2h；在第三组加入100μl hs-内源性抑制剂ppg(20.0μmol/l)，继续孵育30min，吸去加药的培养液，pbs清洗，利用激光共聚焦扫描显微镜进行成像。结果如图10所示，单独cds@nnch进入细胞时，绿色通道荧光弱而红色通道荧光强，这是因为单独cds@nnch发生fret效应。加入snp，刺激细胞产生hs-，绿色荧光增强而红色荧光减弱。加入ppg，抑制细胞产生hs-，绿色荧光减弱而红色通道荧光增强，与体外结果相符合。表明cds@nnch可以在细胞层面上检测内源性hs-。
[0065]
实施例8
[0066]
荧光探针cds@nnch在斑马鱼水平检测外源性hs-：
[0067]
将斑马鱼胚胎在养殖水中培养3-5天，进行实验操作。设置三组实验，首先在养殖水都滴加100μl cds@nnch(10.0μmol/l)，孵育3h，pbs清洗，然后分别在第二组和第三组加入25.0μl和75.0μl hs-(1.00mmol/l)，继续孵育30min，pbs清洗，在荧光显微镜下观察拍照。结果如图11所示，随着加入hs-浓度的增大，斑马鱼中cds荧光(绿色荧光)逐渐增强而nnch荧光(红色荧光)逐渐减弱。与体外及细胞水平结果一致，表明cds@nnch可以在斑马鱼水平上成像并且成功检测外源性hs-。
[0068]
实施例9
[0069]
荧光探针cds@nnch在裸鼠水平检测外源性hs-：
[0070]
实验所用的balb/c裸鼠幼龄为5周龄，体重在15g
±
1g/只，所有动物都在无菌的环境下饲养。设置三组实验，每组皮下注射100μl cds@nnch(10.0μmol/l)，然后分别在第二组和第三组皮下注射25.0μl和75.0μlhs-(1.00mmol/l)，30mim后，通过小动物活体成像系统观察荧光变化，如图12所示，在裸鼠皮下注射单独cds@nnch时，cds的绿色荧光弱而nnch的红色荧光强，随着加入hs-浓度的增大，cds荧光逐渐增强而nnch的红色荧光逐渐减弱，表明
cds@nnch荧光探针可以在裸鼠水平上成像并且成功检测外源性hs-。
[0071]
本发明说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。尽管上面对本发明说明性的具体实施方式进行了描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。