用于缓解三七连作障碍的组合物及其应用方法

1.本发明涉及一种用于缓解三七连作障碍的组合物及其应用方法，属于中药种植领域。


背景技术：

2.云南是中药材三七的主产区，三七喜阴暖、潮湿的生长环境，连作障碍是限制三七产业健康发展的关键因素，严重影响了三七的产量和品质。目前用于缓解三七连作障碍的主要手段包括土壤熏蒸、作物轮作和生物防治等。土壤熏蒸往往使用一些高毒的化学熏蒸剂，其对环境的危害限制了其在实际生产中的应用；而作物轮作周期长，且适宜的用于缓解三七连作障碍的作物目前还未见在生产中的应用。利用有益微生物来缓解三七连作障碍具有低毒、无污染、环境友好等优点，是三七绿色生态防控的有效途径。
3.伯克氏菌b36是前期分离自三七根际土壤，既能降解三七生长过程中分泌到根际土壤中的自毒皂苷，又能明显拮抗根腐病菌的有益微生物，能明显缓解三七的连作障碍。例如，中国专利cn 202110087107公开了一种伯克氏菌及其在防治三七根腐病主要病原菌中的应用，其对3年左右的三七连作土壤障碍具有较好的缓解效果。
4.肉桂酸是从肉桂皮或安息香分离出的有机酸。无色针状晶体或白色结晶粉末，微溶于水，溶于乙醇、甲醇、石油醚、氯仿，易溶于苯、乙醚、丙酮、冰醋酸、二硫化碳及油类。主要用于制备酯类、香料、医药的原料。但伯克氏菌和肉桂酸联合应用于三七种植中尚未见相关报道。


技术实现要素：

5.本发明的第一方面是提供一种用于缓解三七连作障碍的组合物，其包括肉桂酸和伯克氏菌。
6.在一种实施方案中，所述肉桂酸是10μg/ml的肉桂酸水溶液；所述伯克氏菌是106cfu/ml的伯克氏菌的水悬浮液。
7.在另一种实施方案中，所述肉桂酸水溶液和伯克氏菌水悬浮液的体积比为1:0.1-10。在优选的实施方案中，所述肉桂酸水溶液和伯克氏菌水悬浮液的体积比为1:0.5-2；在进一步地实施方案中，所述肉桂酸水溶液和伯克氏菌水悬浮液的体积比为1:1。
8.在又一种实施方案中，所述伯克氏菌为伯克氏菌b36。所述伯克氏菌b36已在申请号为2021100871074一种伯克氏菌及其在防治三七根腐病主要病原菌中的应用的中国专利中公开。
9.本发明的第二方面是提供一种所述组合物用于缓解三七连作障碍的方法，具体包括：
10.1)配置相应浓度的肉桂酸水溶液和伯克氏菌悬浮液，按比例混合；
11.2)在种植三七前，按0.1ml/cm3浇灌三七连作土壤，3d后移栽三七植株。
12.在一种实施方案中，所述三七连作土壤是指3年及以上的三七连作土壤。
13.本发明的第三方面是提供所述组合物在三七种植中的应用。
14.在一种实施方案中，所述三七种植是指缓解三七土壤连作障碍。
15.本发明通过伯克氏菌和肉桂酸联用有效的缓解了三七土壤连作障碍，尤其是针对3年及以上的三七连作土壤障碍具有明显的缓解效果，并且发现两者在缓解三七土壤连作障碍方面产生了明显作用。
16.下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
17.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
18.图1：肉桂酸和伯克氏菌b36协同处理对连作土中三七存苗率以及根腐病发生的影响；
19.图2：伯克氏菌b36对肉桂酸的趋化效应测定，其中a、b、c、d代表经duncan氏新复极差法检验在p《0.05水平差异显著。
20.图3：肉桂酸对伯克氏菌b36在土壤中定殖能力的影响测定，其中a、b代表经duncan氏新复极差法检验在p《0.05水平差异显著。；
21.图4：肉桂酸对伯克氏菌b36生物膜形成的影响测定，其中a、b、c、d代表经duncan氏新复极差法检验在p《0.05水平差异显著。
具体实施方式
22.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
23.实施例1肉桂酸协同伯克氏菌b36缓解三七连作障碍
24.将伯克氏菌b36单菌落至lb液体培养基中，摇培2d后使其菌浓度od
590
值达到0.6。在装有种植过五年三七的连作土花盆中分别浇灌：
①
浓度为106cfu/ml的伯克霍尔德氏菌b36菌株水悬浮液；
②
10μg/ml的肉桂酸；
③
按1:1比例混合的伯克氏菌b36和肉桂酸混合液，按0.1ml/cm3浇灌三七连作土壤，以加入相同体积的0.1％甲醇作为对照，处理3d后移栽一年生健康三七植株，每个处理6盆，每盆种植8株。25d后调查三七的存苗数，按照以下公式计算存苗率；调查出现明显根部腐烂症状的植株，按照以下公式计算根腐病发病率。
25.存苗率(％)＝存苗株数/总株数
×
100
26.根腐病发病率(％)＝根腐病株数/总株数
×
100
27.试验结果：
28.1)存苗率和根腐病发病率如图1所示，与对照相比，肉桂酸和伯克氏菌b36协同后能显著增加三七植株的存苗，明显降低根腐病发生。表明肉桂酸与伯克氏菌协同处理有利于降低根腐病发生，缓解三七连作障碍。
29.2)肉桂酸和伯克氏菌b36协同指数计算：采用burgi方法，具体设计原理和计算方法参见非专利文献：戴体俊.合并用药的定量分析[j].中国药理学通报,1998,14(5):2.；计算公式为：
[0030]
q＝e(a/2+b/2)/ea(或eb)
[0031]
e(a/2+b/2)是指两种药物半剂量组合物的生物学效果
[0032]
ea或eb是单独计量下单味药的生物学效果。
[0033]
当q》1时，说明两者产生协同作用，q＝1说明两者叠加，q《1说明两者拮抗。
[0034]
结果如下：
[0035][0036][0037]
上表结果表明，在存苗率方面，组合物与单味药相比的q值远大于1，说明两种药物在存苗率方面取得了极明显的协同作用。在抗根腐病发病率方面，组合物相对于肉桂酸产生了明显的协同作用，相对于伯克氏菌仅是叠加作用。
[0038]
实施例2肉桂酸与伯克氏菌b36组合物的协同作用机理考察
[0039]
1)伯克氏菌b36对肉桂酸的趋化效应
[0040]
取100μl的菌液到900μl lb液体培养基中培养菌株2天，使其细菌浓度od
590
值达到0.6，准备无菌黄枪头，1ml注射器，lb平板培养基。将肉桂酸配制成不同浓度溶液(1μg/ml，10μg/ml，50μg/ml，100μg/ml，1000μg/ml)，超净工作台无菌条件下，用移液枪移取100μl菌液于黄枪头中，注射器中吸取100μl溶液，然后将注射器针头插入黄枪头中，平放在工作台上静置40min后，将注射器里液体转至无菌干净2ml小管里，用无菌水进行稀释10倍，100倍，1000倍，后取100μl进行涂板，28℃培养1天后观察并计数其菌落数。
[0041]
2)肉桂酸促进伯克氏菌b36在根际土中的定殖
[0042]
筛选氯霉素和利福平抗性标记的伯克氏菌b36，培养2d后使其菌浓度od590值达到0.6。每个组培瓶中装入三七根际土，添加17ml溶液(5ml b36菌液+7ml肉桂酸+5ml水/抗生素)，搅拌均匀后盖上盖子培养10d。在培养期间的第5天取5g土加入50ml灭菌水，在摇床上摇培30min，稀释10倍，100倍，1000倍后用移液枪吸取100μl并在添加了抗生素的tsa培养基上涂板，28℃下过夜培养后，记录菌落形成数量，评价伯克氏菌b36在土壤中的定殖效果。
[0043]
3)肉桂酸促进伯克氏菌b36的生物膜形成
[0044]
取100μl的菌液到900μl lb液体培养基中，28℃过夜培养，使其细菌菌浓度od
590
值达到0.4，取20μl菌液添加到96孔板180μl的不同浓度(1μg/ml，10μg/ml，50μg/ml，100μg/ml，1000μg/ml)肉桂酸1/10lb溶液中，28℃静置培养52h，在培养52h后，用结晶紫法测定菌株在不同浓度代谢物下生物膜的形成情况。
[0045]
试验结果：
[0046]
1)伯克氏菌b36对肉桂酸的趋化效应：结果如图2所示，菌株b36对浓度为1μg/ml，10μg/ml，50μg/ml的肉桂酸存在显著的趋化效应，但是高浓度(100μg/ml，1000μg/ml)会显
著降低菌株的趋化活性。说明菌株b36对肉桂酸的趋化效果表现为低促高抑的现象，即低浓度表现为促进，高浓度表现为抑制。
[0047]
2)肉桂酸促进伯克氏菌b36在根际土中的定殖：结果如图3所示，与空白对照相比，有肉桂酸存在的条件下，伯克氏菌b36在土壤中的定殖菌落数均显著增加，表明1-10μg/ml肉桂酸的协同添加有利于促进伯克氏菌在三七根际的定殖。
[0048]
3)肉桂酸促进伯克氏菌b36的生物膜形成：结果如图4所示，培养52h后，1-1000μg/ml肉桂酸均能促进菌株生物膜的形成，其中10、100μg/ml浓度具有显著的促进作用。
[0049]
以上结果表明，肉桂酸和伯克氏菌在缓解三七土壤连作障碍中产生的协同作用，其作用机理可能与伯克氏菌对肉桂酸的趋化效应以及肉桂酸促进伯克氏菌在三七根际土中定殖和生物膜形成相关，具体明确的协同作用机理有待进一步研究。