一种高光效稀土纳米荧光材料及其制备方法和在造影剂中的应用

本发明属于纳米生物医学显像，具体而言，涉及一种核-壳-壳结构的高光效稀土纳米荧光材料及其制备方法和在造影剂中的应用。

背景技术：

1、心血管疾病具有患病率高、致残率高和死亡率高的特点。目前，已有大量研究证实动脉粥样硬化是脑血管病、冠心病和外周动脉疾病等缺血性心脑血管病的共同病理学基础。一般来说，动脉粥样硬化在初期会缓慢形成斑块，随着斑块的生长或者破裂将会引起血管栓塞，最终导致严重的血管病变及器官缺血，对患者的生命健康造成严重的危害。尽管动脉粥样硬化听起来危害性很高，但其形成需要一段较长的时间，为患者的诊断治疗提供了重要的时间窗口。

2、动脉粥样硬化最早发病于青春期，但是早期一般不会出现相应的临床症状，这阻碍了对患者的早期筛查与预防，并且现阶段筛查心脑血管疾病的早期指标如脂蛋白、血糖、血压和体重，都只是监测动脉粥样硬化的危险因素，并不能准确反应早期动脉粥样硬化的微小病灶，具有一定的滞后性，灵敏度较差。目前，主要的解决办法是从分子层面灵敏地检测易损斑块成分，更准确地诊断斑块，但是，易损斑块的标志物(如血管细胞黏附因子-1)很难通过常规血清检测判断其组织来源，且无法获得其分子层面的生物学信息，难以真正达到早期精确筛查的目的。

3、荧光成像因具有背景信号干扰小、空间分辨率和成像灵敏度高等优点，可以实时成像，也能同时分辨和定位细小斑块的位置，成为心脑血管疾病的早期筛查诊断领域的研究热点。稀土掺杂无机纳米荧光材料作为新一代生物成像荧光探针，由于其生物毒性低、稳定性好、成像分辨率高等特点在非侵入性的分子影像领域具有重要应用前景。另外，稀土无机纳米荧光材料能发射出400-1700nm波段的光，兼具可见波段和近红外波段，可以实现活体内深层次、高质量的成像，从而大大弥补了可见光和nir-i区域单波段荧光成像存在的不足。但是其临床应用最大的掣肘之处在于亮度不够高、量子效率低。

4、因此，开发一种高光效的稀土纳米医学造影剂对动脉粥样硬化的早期诊断具有重要实际的意义和临床价值。

技术实现思路

1、为改善上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

2、一种稀土纳米荧光材料，所述稀土纳米荧光材料具有核-壳-壳晶体结构，所述核-壳-壳晶体结构包括稀土离子内核、稀土离子壳层、稀土离子惰性保护层；

3、所述稀土纳米荧光材料还包括稀土发光离子、功能性生物分子层。

4、根据本发明的实施方案，所述稀土离子内核、稀土离子壳层和稀土离子惰性保护层的组成可以相同或不相同，彼此独立的含有narf4纳米晶，其中r选自gd、y、yb、lu、eu、tb中的至少一种。

5、根据本发明的实施方案，所述narf4纳米晶具有晶体结构，例如包括α相和/或β相的晶体结构，优选为β相的晶体结构。

6、根据本发明的实施方案，所述稀土离子内核的粒径为1-50nm，优选为5-10nm。

7、根据本发明的优选方案，所述稀土离子内核选自nagdf4纳米晶、nayf4纳米晶中的至少一种或两种。

8、根据本发明的实施方案，所述稀土离子壳层的厚度为0-30nm，优选为2-20nm。

9、根据本发明的优选方案，所述稀土离子壳层具有最大吸收截面，可以最大程度的捕获外界能量。示例性地，所述稀土离子壳层包括naybf4纳米晶。

10、根据本发明的实施方案，所述稀土离子惰性保护层的厚度为1-50nm，优选为1-10nm。

11、根据本发明的优选方案，所述稀土离子惰性保护层选自nayf4纳米晶、naeuf4纳米晶中的至少一种或两种。

12、根据本发明的实施方案，所述稀土发光离子选自er、ho、tm、nd、ce中的至少一种或多种，示例为er和/或ce。

13、根据本发明的实施方案，所述稀土发光离子分布在所述核-壳-壳结构晶体结构的内部，所述稀土发光离子可以分布在稀土离子内核、稀土离子壳层中的至少一处，例如所述稀土发光离子可以单独分布在稀土离子内核、稀土离子壳层中、或同时分布在稀土离子内核和稀土离子壳层中。

14、根据本发明的实施方案，在所述稀土纳米荧光材料中，所述稀土发光离子为各层中narf4纳米晶的摩尔和的0.1-10mol％，例如为1-5mol％。

15、根据本发明的实施方案，所述核-壳-壳晶体结构的尺寸为10～200nm，优选为10-40nm，例如10nm，20nm，25nm，30nm，35nm，40nm，45nm，50nm，55nm，60nm，65nm，70nm，75nm，80nm，85nm，90nm，95nm，100nm，200nm或者上述任意数值之间的任一范围。

16、根据本发明的实施方案，所述核-壳-壳结构晶体结构中还任选的包括或不包括溶剂配体。优选地，当包括所述溶剂配体时，所述溶剂配体分布在所述核-壳-壳结构晶体结构的表面。

17、优选地，所述溶剂配体可选用本领域已知的配体，例如选自油酸、硬脂酸、亚油酸、棕榈酸中的至少一种。

18、根据本发明的实施方案，所述功能性生物分子层位于所述核-壳-壳晶体结构的表面，例如部分包覆或全部包覆在所述晶体结构的表面。

19、根据本发明的实施方案，所述功能性生物分子层含有功能性生物分子。

20、优选地，所述功能性生物分子选自有机材料(例如有机配体)、无机材料(例如二氧化硅)、有机/无机杂化材料(例如硅基杂化胶束)中的至少一种，示例为有机配体。本领域技术人员可以理解，所述功能性生物分子层可根据不同成像需求进行选择功能性生物分子。本发明中，所述功能性生物分子层可以增强所述稀土纳米荧光材料的生物相容性。

21、根据本发明的实施方案，所述有机配体可以选自水溶性的功能配体、油溶性的功能性配体、两亲性的功能性配体，示例选自两亲性的功能性配体。

22、根据本发明的实施方案，所述水溶性的功能配体选自聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、环糊精。

23、根据本发明的实施方案，所述油溶性的功能配体选自油酸、油胺、辛胺。

24、根据本发明的实施方案，所述两亲性的功能性配体选自脂质体，所述脂质体是指将磷脂酰乙醇胺和聚乙二醇聚合得到。

25、根据本发明的实施方案，所述磷脂酰乙醇胺选自二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺、二月桂酰基磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺中的至少一种或多种。

26、根据本发明的实施方案，所述聚乙二醇的数均分子量优选为300-50000，更优选为500-10000，例如300，500，1000，2000，3000，4000，5000，5500，6000，6500，7000，7500，8000，8500，9000，9500，10000，20000，25000，30000，40000，50000或任意两个数值之间的任一范围。

27、根据本发明示例性的方案，所述脂质体例如为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(dspe-peg)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(dppe-peg)、二月桂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(dlpe-peg)、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(dmpe-peg)、二油酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(dope-peg)中的至少一种或多种。

28、根据本发明的实施方案，所述功能性生物分子层的厚度为1-100nm，优选为5-50nm，例如1nm，5nm，10nm，20nm，25nm，30nm，35nm，40nm，45nm，50nm，55nm，60nm，65nm，70nm，75nm，80nm，85nm，90nm，95nm，100nm或者上述任意数值之间的任一范围。

29、根据本发明的实施方案，所述稀土纳米荧光材料为纳米颗粒。

30、根据本发明的实施方案，所述稀土纳米荧光材料的粒径为10～300nm，优选为10-100nm。例如10nm，20nm，25nm，30nm，35nm，40nm，45nm，50nm，55nm，60nm，65nm，70nm，75nm，80nm，85nm，90nm，95nm，100nm，200nm，300nm或者上述任意数值之间的任一范围。

31、根据本发明示例性的方案，所述核-壳-壳晶体结构包括稀土离子内核、稀土离子壳层、稀土离子惰性保护层，其中，所述稀土离子内核选自nagdf4纳米晶、nayf4纳米晶中的至少一种或两种；所述稀土离子壳层包括naybf4纳米晶；所述稀土离子惰性保护层选自nayf4纳米晶、naeuf4纳米晶中的至少一种或两种。

32、根据本发明的实施方案，所述稀土纳米荧光材料量子产率高。

33、根据本发明示例性的方案，所述稀土纳米荧光材料具有2％以上的可见光量子产率。本发明中，所述可见光量子产率是指400-750nm的荧光发射峰积分面积和970-990nm吸收峰积分面积的比值。

34、根据本发明示例性的方案，所述稀土纳米荧光材料具有20％以上的近红外量子产率。本发明中，所述近红外量子产率是指1400-1700nm的荧光发射峰积分面积和970-990nm吸收峰积分面积的比值。

35、根据本发明的实施方案，所述稀土纳米荧光材料具有良好的生物相容性和生物安全性。

36、本发明还提供上述稀土纳米荧光材料的制备方法，所述制备方法包括：

37、s1、制备稀土离子内核；

38、s2、采用逐层外延生长法在所述稀土离子内核表面依次生长稀土离子壳层、稀土离子惰性保护层；

39、s3、在所述稀土离子惰性保护层表面负载功能性生物分子层，得到所述稀土纳米荧光材料。

40、根据本发明的实施方案，所述稀土离子内核、稀土离子壳层和稀土离子惰性保护层可以选用本领域已知的方法制备得到，例如采用高温共沉淀法、高温热分解法、水热法或溶胶-凝胶法制备得到，优选为高温热分解法。

41、根据本发明的实施方案，所述稀土离子内核、稀土离子壳层和稀土离子惰性保护层在惰性气氛下制备得到，所述惰性气氛可选用本领域已知的惰性气体，例如氮气和/或氩气。

42、根据本发明的实施方案，所述稀土纳米荧光材料的制备方法包括以下步骤：

43、(a)将第一反应原料混合至溶解，升温至反应温度，反应一段时间后自然冷却到室温，得到稀土离子内核；

44、(b)将步骤(a)中所述的稀土离子内核和第二反应原料混合至溶解，升温至反应温度，反应一段时间后，自然冷却到室温，得到核-壳结构纳米晶；

45、(c)将步骤(b)中所述的核-壳结构纳米晶和第三反应原料混合至溶解，继续升温至反应温度，反应一段时间，自然冷却到室温，得到核-壳-壳晶体结构，作为稀土纳米荧光材料的前驱体；

46、(d)在步骤(c)得到的前驱体的表面修饰功能性生物分子层，得到所述稀土纳米荧光材料；

47、其中，在步骤(a)和/或(b)中溶解时，还加入稀土发光离子，所述稀土发光离子具有如上文所述的含义。

48、根据本发明的实施方案，所述第一反应原料、第二反应原料和第三反应原料可以相同或不相同，彼此独立的选自稀土盐、钠盐和溶剂。优选地，所述第一反应原料、第二反应原料和第三反应原料中的稀土盐可以相同或不相同，例如为不相同。

49、根据本发明的实施方案，所述稀土盐选自r的三氟乙酸盐，r选自gd、y、yb、lu、eu、tb中的至少一种。

50、根据本发明的实施方案，所述钠盐选自易分解的钠盐，例如选自三氟乙酸钠。

51、根据本发明的实施方案，所述溶剂选自溶剂配体和长链烯烃。优选地，所述溶剂配体具有如上文所述的含义，例如选自油酸、硬脂酸、亚油酸、棕榈酸中的至少一种。优选地，所述长链烯烃例如选自1-十八烯。

52、根据本发明的实施方案，步骤(a)-(c)中，所述第一反应原料、第二反应原料和第三反应原料的用量不做具体限定，只要能得到所述稀土纳米荧光材料的前驱体即可。

53、根据本发明的实施方案，步骤(a)-(c)中，所述第一反应原料、第二反应原料和第三反应原料中的稀土盐的摩尔总量与钠盐和溶剂的用量比为(0.1～1)mmol:(0.1～1)mmol:(1～40)ml；优选为(0.1～0.5)mmol:(0.1～0.5)mmol:(2～20)ml。

54、优选地，所述溶剂包括油酸和1-十八烯，其体积比为(1～20):(1～20)，优选为(2～10):(2～10)。

55、根据本发明的实施方案，步骤(a)、步骤(b)和步骤(c)中，反应温度为280～340℃，例如为300℃；反应时间为0.1～2小时，例如为0.5小时、1小时。

56、根据本发明的实施方案，步骤(a)、步骤(b)和步骤(c)中，反应为恒温反应，且反应温度的波动在±5℃以内。

57、根据本发明的实施方案，步骤(a)、步骤(b)和步骤(c)中升温速率为1～20℃/min，例如为10℃/min。

58、根据本发明的实施方案，所述稀土发光离子的加入量为第一反应原料、第二反应原料和第三反应原料中稀土盐的摩尔总量的0.1-10mol％，优选为1-5mol％。

59、根据本发明的实施方案，所述稀土发光离子由含稀土发光离子的盐提供。

60、根据本发明的实施方案，所述含稀土发光离子的盐例如选自稀土发光离子的三氟乙酸盐，例如为三氟乙酸铒和三氟乙酸铈。

61、根据本发明的实施方案，所述稀土发光离子优选在步骤(b)中加入。

62、根据本发明的实施方案，步骤(c)中，所述前驱体的表面包覆有溶剂配体(例如为油酸配体)，这有利于增强前驱体的稳定性。

63、根据本发明的实施方案，所述步骤(d)中，修饰功能性生物分子层的步骤具体包括：将所述高光效稀土纳米荧光材料前驱体分散于有机溶剂中，加入功能性生物分子搅拌一段时间使得所述纳米晶由油溶性转变成水溶性，有机溶剂自然挥发得到所述稀土纳米荧光材料。优选地，当有机溶剂自然挥发后，可加入适量的水超声混合。

64、根据本发明的实施方案，所述有机溶剂为环己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃和n,n-二甲基甲酰胺中的一种或多种。

65、根据本发明的实施方案，所述前驱体、功能性生物分子、有机溶剂的摩尔体积比为(0.01～0.1)mmol:(0.2～0.8)mmol:(1～20)ml，优选摩尔体积比为(0.05～0.1)mmol:(0.3～0.5)mmol:(5～15)ml。

66、根据本发明示例性的方案，有机溶剂选自环己烷和三氯甲烷，其体积比为(1～10):(2.5～10)，优选为(1～3):(8～10)。

67、根据本发明的实施方案，所述步骤(d)中，修饰功能性生物分子层后，还包括后处理，所述后处理包括沉淀和/或洗涤，或任选地无菌处理。

68、优选地，所述沉淀可选用本领域已知的方法进行，例如通过高速离心进行。

69、优选地，所述洗涤可选用本领域已知的方法进行，例如通过超纯水超声洗涤。

70、优选地，所述无菌处理包括重新分散至无菌剂中，并进行无菌过滤和/或辐照灭菌。示例性地，无菌剂例如生理盐水。示例性地，将产物分散于生理盐水中，并进行无菌过滤。本发明中，无菌过滤可选用本领域已知的方法进行。

71、本发明还提供一种造影剂，所述造影剂包括上述稀土纳米荧光材料。

72、本发明还提供上述稀土纳米荧光材料和/或造影剂的应用，优选应用于生物活体成像领域。

73、示例性地，所述造影剂例如作为心脑血管疾病造影剂、细微血管显像造影剂、脑部深层血管显像造影剂、动脉粥样硬化显像造影剂或骨显像造影剂。

74、根据本发明的实施方案，采用所述稀土纳米荧光材料和/或造影剂用于生物活体成像时，获得的影像具有高分辨率、高信噪比。

75、本发明的有益效果

76、(1)本发明所设计具有核-壳-壳晶体结构的高光效稀土纳米荧光材料以惰性六方相的稀土离子内核，为中间层和外层的稀土离子的逐层外延生长提供模板，得到的稀土纳米荧光材料具有比立方相更强的发光；中间层稀土离子壳层选用吸收截面最大的yb3+作为基质可以最大程度的捕获外界能量；外层稀土离子惰性保护层能够有效减少纳米颗粒的表面荧光猝灭影响，最终使得该荧光材料具有高效发光的特点。

77、(2)本发明具有核-壳-壳晶体结构的高光效稀土纳米荧光材料在可见光区、近红外光区均有良好的发光，尤其是在近红外ⅱb区1400-1700nm波段具有较强发光，这有益于其在深组织穿透生物活体实时荧光成像方面的应用，能够得到具有高分辨率、高信噪比的心脑血管医学影像。

78、(3)本发明具有核-壳-壳晶体结构的高光效稀土纳米荧光材料还表现出了良好的生物相容性和生物安全性，在生物活体成像领域具有良好的应用前景。