一种罗丹明类衍生物的gsh荧光传感器、制备方法及应用
【专利摘要】本发明公开了一种罗丹明类衍生物的GSH荧光传感器、制备方法及应用，以罗丹明B为前体，通过两步反应合成目标产物1?（2?（3’,6’?双（二乙氨基）?3?异吲哚啉?1,9’?[呫吨]?2?基）乙基?1H?吡咯?2,5?二酮。本发明通过将目标产物对GSH进行检测，发现其对GSH具有很好的检测效果，同时，本发明采用的原料易得，合成步骤简单，后处理亦很方便，较易实现大规模生产。
【专利说明】
一种罗丹明类衍生物的GSH荧光传感器、制备方法及应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物化学领域，具体涉及一种基于罗丹明B的GSH荧光传感器的制备及 应用。
【背景技术】
[0002] 谷光胱甘肽(GSH)是一种由三种氨基酸缩合而成的小分子肽，在调节细胞的各种 功能方面发挥着至关重要的作用。它的主要生理作用是能够清除掉人体内的自由基，作为 体内一种重要的抗氧化剂，保护许多蛋白质和酶等分子中的巯基。当GSH的含量异常时，则 会带来许多健康方面的问题。例如：当体内GSH的含量偏低时，可能会引起肝损伤、艾滋病等 疾病。另一方面，当GSH的含量高于正常值时，则会引起心血管疾病与阿尔茨海默病。鉴于 GSH对人体如此至关重要，研究一种能够快速方便检测GSH的方法具有十分重要的意义。
[0003] 目前，检测GSH的方法主要有:分光光度法、焚光法、高效液相色谱(HPLC)法、高效 毛细管电泳法(HPCE)、流式细胞仪法等，然而这些方法存在很多缺点，如所需仪器价格较为 昂贵费时，携带不便，敏感性差，所测定的GSH浓度范围不大，对于含GSH量较小的细胞中测 量则更是困难等。与此相反，由于化学发光不需要任何光源，因而在对荧光探针进行化学发 光成像检测时，不存在荧光检测或者荧光成像时不可避免的光学背景的干扰，从而可以获 得更低的检出限。
[0004] 罗丹明类染料由于其摩尔吸光系数较大，荧光量子产率高、光谱性能优越、结构简 单、易于修饰、吸收波长范围广等优势，已经被广泛应用与分子探针设计，目前，罗丹明类分 子探针多用于检测Al 3+，Cr3+，GSH等。
[0005] 文献l(Liu X，Zhang W，Li C，et al .Nanomolar detection of Hey，GSH and Cys in aqueous solution,test paper and living cells[J].Rsc Advances,2014,7:4941-4946.)报道了一种利用萘酰亚胺类衍生物和磺酰氯进行缩合，合成出一种新型的GSH传感 器的方法，产率54.8%，但是，其选择性不是特别好，对Hey、Cys也有响应，而且效果和GSH相 当。
[0006] 文南犬2(Kim G J，Lee K,Kwon H,et al .Ratiometric Fluorescence Imaging of Cellular Glutathione[J] ·Organic Letters, 2011,13( 11): 2799-2801 ·)报道了一种1， Γ -联萘衍生物和马来酸酐进行缩合，合成出一种新型的GSH传感器的方法，产率39%，由于 缓冲溶液浓度过低，只有〇. ImM，很难保在中性条件下进行测试。
【发明内容】
[0007] 本发明目的是提供一种罗丹明类衍生物的GSH荧光传感器、制备方法及应用。
[0008] 实现本发明目的的技术解决方案是：
[0009] -种基于罗丹明B的GSH焚光传感器，该焚光传感器的结构如下：
[0011]本发明中基于罗丹明B的GSH焚光传感器的制备方法，包括以下步骤：
[0012]第一步，将马来酸酐加入到含有化合物1的三氯甲烷体系中，回流反应，反应结束 后，冷却至于室温，减压除去溶剂，萃取，硅胶柱分离、真空干燥得到化合物2;其中，化合物1 的结构如下：
[0014]第二步，将化合物2加入到含有乙酸钠的乙酸酐体系中，升温至100± 10°C反应，反 应结束后冷却至室温，减压除去溶剂，萃取，硅胶柱分离最后得到所述GSH荧光传感器;其 中，化合物2的结构如下： ，
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[0016] 进一步的，第一步中，化合物1是将罗丹明B与过量的乙二胺在无水乙醇中加热回 流过夜，反应结束后，减压除去溶剂，萃取，硅胶柱分离后得到。
[0017] 进一步的，第一步中，化合物1与马来酸酐的摩尔比为1:1.5-2.5,反应时间为10h 以上。
[0018] 进一步的，第一步中，硅胶柱分离中的洗脱液为MeOH: CH2C12 = 1:100。
[0019]进一步的，第二步中，乙酸钠的添加量为化合物2的0.3-leq.。
[0020] 进一步的，第二步中，硅胶柱分离中的洗脱液为MeOH:CH2C12 = 1:49。
[0021] 本发明中所述的基于罗丹明B的荧光传感器用于检测细胞的谷光胱甘肽。
[0022] 本发明与现有技术相比，其显著优点是：（1)本发明以罗丹明为主体合成了一种新 型GSH荧光传感器，具有良好的光稳定性，长波长发射以及量子产率高等优点。（2)本发明所 选用原料成本低，合成步骤简单，后处理亦很方便，较易实现大规模生产。（3)本发明采用酸 酐与伯胺缩合反应方式，合成方法简单，反应条件温和，且产率较高。（4)本发明所涉及传感 器能选择性检测GSH，且敏感度较高，在检测细胞内的GSH方面具有很大的应用前景。
【附图说明】
[0023]图1为本发明的化合物1? NMR。
[0024] 图2为本发明的化合物113C NMR。
[0025] 图3为本发明的化合物2? NMR。
[0026] 图4为本发明的化合物213C NMR。
[0027] 图5为本发明的目标化合物1H NMR。
[0028] 图6为本发明的目标化合物13C NMR。
[0029] 图7为本发明的目标化合物的紫外选择性测试图。
[0030]图8为本发明的目标化合物的荧光选择性测试图。
【具体实施方式】
[0031](一)传感器化合物的合成
[0032]本发明提供了目标产物在GSH检测中的应用，发现其对GSH有很好的检测效果。本 发明合成路线如下：
[0034](二)焚光性能测试
[0035]将65!1、078、!1(^、1^8,617等不同氨基酸加入目标化合物的溶液中，进行荧光响应 测试。
[0036](三)紫外性能测试
[0037]将65!1、078、!1(^、1^8,617等不同氨基酸加入目标化合物的溶液中，吸光度光响应 测试。
[0038]下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。
[0039]实施例1荧光化学传感器的合成 [0040] 1.化合物1的合成
[0041 ] 将罗丹明13(96〇11^，2_31)与乙二胺（1.31111，20_31)在无水乙醇(4〇1111)中，控制反 应温度在80°C，反应时间为12h，反应完成之后，减压除去溶剂，萃取，经硅胶柱分离得到淡 黄色固体即化合物l(880mg，92%)。化合物1? NMR，13C NMR分别如图1，图2所示。
[0042] 2.化合物2的合成
[0043] 将97.0211^(0.99_〇1)的马来酸酐加入到311^含有319.6211^(0.66_〇1)化合物1的 三氯甲烷体系中，回流反应20h，反应结束后，冷却至于室温，减压除去溶剂，萃取，经硅胶柱 分离得到淡黄色固体即化合物1得到淡黄色的固体即化合物2 (365mg，95 % )。化合物14 NMR，13C NMR分别如图3,图4所示。
[0044] 3.目标化合物的合成
[0045] 将化合物2再次加入到溶有21.73mmg(0.26mmol)乙酸钠的乙酸酐体系中，升温至 100°C反应2h，反应结束后冷却至室温，真空旋干溶剂。产物通过柱层析提纯得到293.28mg (78.79% )淡黄色产物即目标化合物。目标化合物咕NMR，13C NMR分别如图5,图6所示。 [0046]实施例2紫外选择性能测试
[0047]目标化合物在甲醇中具有很好的溶解性，经验证，目标化合物可以溶解在MeOH: HEPES( lmM，pH=7.4) = 1:2混合液中，配制500ml该溶液作为储备液(pH=7.2)。
[0048] 精确配置目标化合物为1 X l(T3mol/LMe0H-H20混合液（1/2，V/V)，氨基酸GSH、Cys、 Hcy、Lys、Gly 等浓度为 5X10-3mol/L 水溶液，以及用 Me0H:HEPES(lmM，pH = 7.4，l/2，V/V)溶 液。
[0049]紫外选择性实验如图7所示，取3ml储备液置于液体池中，加入30uL目标化合物，测 其初始吸光度，然后分别加入配置好的各种氨基酸30uL，测量其稳定时的吸光度。观察图7 可知，目标化合物对GSH有明显响应效果，在562nm处出现一个新峰，也即目标化合物对GSH 有很好的选择性。
[0050]实施例3荧光选择性能测试
[00511目标化合物在甲醇中具有很好的溶解性，经验证，目标化合物可以溶解在MeOH: HEPES( lmM，pH=7.4) = 1:2混合液中，配制500ml该溶液作为储备液(pH=7.2)。
[0052] 精确配置目标化合物为1 X 10-3mol/LMe0H-H20混合液（1/2，V/V)，氨基酸GSH、Cys、 Hcy、Lys、Gly 等浓度为 5X10-3mol/L 水溶液，以及用 Me0H:HEPES(lmM，pH = 7.4，l/2，V/V)溶 液。
[0053]荧光选择性实验如图8所示，取3ml储备液置于液体池中，加入30uL目标化合物，测 其初始荧光强度值，然后分别加入配置好的各种氨基酸30uL，测量其稳定时的荧光强度。观 察图8可知，目标化合物对GSH有明显响应效果，并且在580nm处荧光强度达到最大值，也即 目标化合物对GSH有很好的选择性。
【主权项】
1. 一种基于罗丹明B的G甜巧光传感器，其特征在于，该巧光传感器的结构如下：2. 如权利要求1所述的基于罗丹明B的GSH巧光传感器的制备方法，其特征在于，包括W 下步骤： 第一步，将马来酸酢加入到含有化合物1的Ξ氯甲烧体系中，回流反应，反应结束后，冷 却至于室溫，减压除去溶剂，萃取，硅胶柱分离、真空干燥得到化合物2;其中，化合物1的结 构如下：第二步，将化合物2加入到含有乙酸钢的乙酸酢体系中，升溫至100± 10°C反应，反应结 束后冷却至室溫，减压除去溶剂，萃取，硅胶柱分离最后得到所述G細巧光传感器;其中，化 合物2的结构如下：3. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，第一步中，化合物1是将罗丹明B与过量 的乙二胺在无水乙醇中加热回流过夜，反应结束后，减压除去溶剂，萃取，硅胶柱分离后得 到。4. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，第一步中，化合物1与马来酸酢的摩尔比 为1:1.5-2.5,反应时间为lOhW上。5. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，第一步中，硅胶柱分离中的洗脱液为 MeOH:CH2Cl2 = 1:100。6. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，第二步中，乙酸钢的添加量为化合物2的 0.3-leq.〇7. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，第二步中，硅胶柱分离中的洗脱液为 MeOH:CH2Cl2 = l:49。8. 如权利要求1-7任一所述的巧光传感器在检测谷光脫甘肤上的应用。
【文档编号】C09K11/06GK105969337SQ201610320134
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月13日
【发明人】包晓峰, 陈海浪, 舒海, 吴小磊, 李峰
【申请人】南京理工大学