一种激光图案化PDMS表面快速提高生物附着性的方法与流程

本发明涉及一种提高PDMS表面的生物附着性技术，尤其涉及一种激光图案化PDMS表面快速提高生物附着性的方法，属于激光表面改性领域。

背景技术：

PDMS(聚二甲基硅氧烷)，具有良好的易注塑成形性、生物兼容性、透光性、透气性、热稳定性和无毒等特性，不但用于加工常规的微流控芯片，也逐渐用作空间细胞培养芯片的结构材料。但是，未经改性处理的PDMS易非特异性吸附蛋白质或小疏水性分子，不利于细胞的粘附和增殖。所以需要对PDMS进行表面改性，才能更好的被用作细胞表面附着培养和细胞增殖的研究。

目前，生物分子修饰是PDMS表面改性的一种手段。材料表面的生物分子修饰是指在分子生物学的基础上，利用各种表面修饰方法将蛋白质、细胞生长因子、酶及核酸等生物分子固定在特定材料的表面，构建所需的分子生物材料，特异性地识别并检测相应的分子。生物分子修饰的材料在提高材料的生物相容性的同时，又添加了新的生物活性，具有广泛的应用前景。

PDMS生物分子修饰的表面改性方法主要是通过物理吸附、表面活化和化学接枝改性以及两者相结合的方法来实现的。物理吸附包括非离子表面活性剂、聚电解质吸附等；表面活化法包括等离子体处理、紫外臭氧辐射、化学气相沉积和层层自组装等，化学接枝改性主要包括等离子体接枝、紫外表面引发聚合、本体化学接枝改性、硅烷化、硅氢加成、生物活性分子修饰等。

物理吸附：物理吸附或涂层是较为简单方便的表面改性方法之一，它一般是通过分子间的氢键、离子电荷等作用将具有生物相容性的聚合物或共聚物吸附在材料表面，从而改善材料表面的生物相容性。如PDMS表面吸附带有大量阳离子的PLL(聚赖氨酸)，可以有效地促进表面带有正电荷的哺乳动物细胞黏附和生长。

表面活化：通过等离子处理，紫外臭氧辐射等使PDMS表面产生羟基、羧基、氨基等反应性基团，表面含有羟基可以通过磺酰氯法、二酰亚氨法和二异氰酸酯法活化，然后将蛋白固定。表面羧基的活化可以通过羟基丁二酰亚胺和碳化二亚胺等进行。表面氨基可以通过含双官能团的偶联剂如二异氰酸酯、二元醛、环氧树脂等与蛋白偶联。从而到达促进细胞粘附生长的目的。Kim等人先通过UV照射的方法处理PDMS表面，然后将多聚D-赖氨酸(Poly-D-Lysin)涂层固定在其表面之上，细胞实验结果表明，改性后的表面有利于间叶干细胞的神经元细胞的分化与增殖。

如图2所示，化学接枝改性：

等离子体接枝和紫外表面引发聚合都是经过等离子体或紫外辐射进行表面活化,再进一步进行接枝所需要具有改性功能的聚合物。Tatsuro等人以苯丙酮为光学引发剂，用紫外光照射PDMS表面，使其活化，进而引发2-甲基-丙烯酰氧乙基磷脂酰胆碱(MPC)在表面的聚合，形成刷状结构，如图1。研究表明，增加光照时间和单体浓度可以控制聚合物的接枝密度。改性后的表面显示出很好的抗蛋白吸附和细胞黏附的性能。

本体化学接枝改性是通过化学反应，在PDMS本体里引入特定的基团或聚合物，即PDMS固化时在PDMS预聚物和固化剂中加入其他的单体或者化合物进行共聚，从而在表面形成特定的功能基团或改变表面特性。

表面硅烷化可以在含羟基的各种材料表面进行，这是因为羟基可以和硅氧烷在表面上形成Si-O-Si键。用氨基、硫醇、羟基终止的硅氧烷与表面的硅烷化反应，将各种功能基团带入表面，从而引发表面接枝聚合。

生物活性分子修饰，通过吸附、离子键或者共价键等方式在PDMS表面接枝具有良好生物相容性的活性分子，可以有效地改善材料的生物相容性。一般常用的生物活性分子包括肝素(Heparin)、氨基酸、磷脂等。

施鏐佳等人比较了在PDMS表面自聚合聚多巴胺(PDA-PDMS)、涂覆聚赖氨酸(PLL-PDMS)、包被胶原蛋白I型(COL-PDMS)和氧等离子体处理(ox-PDMS)四种处理方法的MG-63细胞的粘附效果。处理过的PDMS表面均能较好地黏附和铺展，如图3所示。

细胞图案化技术。细胞图案化最重要的应用就是研究细胞图案化后其生物特性和基础机制，在二维表面控制细胞的大小、形状和空间排列，为细胞生物学研究提供了新的工具。其根本是将细胞限定在特定形状的图案上，在这个过程当中，如何让细胞粘附在该图案上并且良好的铺展是这种技术的主要难点。这种技术主要包括两种方法，一种是通过表面修饰的方法构建一层能够让细胞粘附的有图案的区域，其他部分通过表面修饰让细胞不容易粘附，最终让细胞选择性的粘附在设计的图案上；第二种是给细胞提供一层能够粘附的图案化的物理阻隔层，该物理阻隔层能够让细胞粘附后再取走，同时又不让细胞受到损伤。常规的细胞图案化方法主要有光刻法，软刻蚀法，以及喷墨打印等其他一些方法。

干锦波等人以PDMS(聚二甲基硅氧烷)为基材,通过硅氢加成反应在其表面接枝PEG(烯丙基聚乙二醇),利用紫外光刻蚀技术在上述表面(PEG-PDMS)制备出化学组分异质的图案化表面拓扑结构。即曝光区域的PEG被高能量的准分子紫外光刻蚀除去并暴露出底层的基材,而未曝光部分的则得以保留,从而实现细胞图案化分布，如图4和图5所示。需要注意的是，PEG对细胞粘附和蛋白质吸附具有排斥作用，而曝光去除PEG后暴露基材表面(PDMS)，并且暴露的基材表面经过紫外光的高能光子进一步刻蚀，使其细胞能够在曝光区域生长，而无法在未曝光区域附着生长，实现细胞图案化。

李宙等人通过软刻蚀技术制作出具有图案结构的弹性印章，如图6，并将图案区域经过氧等离子处理，再进行涂覆PEI(聚赖氨酸),从而使细胞能够沿着涂覆了PEI的图案进行附着生长。

在生物表面修饰方面，上述技术主要以等离子处理、紫外光辐射、化学接枝改性等化学手段改性为主，具有一定的洁净空间需求，且均需要与PDMS表面接触进行相关的复杂化学反应，容易破坏PDMS非修饰区域的表面化学结构性质。

在图案化技术方面，光刻技术对室内条件要求极高，并且所使用的设备昂贵。在光刻之前需要对整片PDMS表面进行相关化学改性，同时光刻过程中用到的具有图案结构的掩膜，以及控制光的衍射影响，这都导致了图案制作周期长，工艺复杂的特点。

软刻蚀技术源自于光刻技术，在这个基础上，又利用到了弹性印章，所以叫做软刻蚀技术。软刻蚀其本质是，利用昂贵的光刻设备和掩模等制备出我们需要的微图案，之后通过中间介质的作用，进行简单并且精确的复制和转移，用于提高微加工的效率，降低加工成本。但其制作周期长，需要具有图案的掩膜，以及光刻后的硅板作为模板，浇注PDMS，再进行脱模，最后还要进行相关的表面改性处理，工艺十分复杂。

技术实现要素：

本发明的目的在于提出一种激光图案化PDMS表面快速提高生物附着性的方法，具体为利用激光作用材料表面改性或形成表面微结构，在不影响非修饰区域表面结构或化学性质的情况下，简化PDMS表面改性步骤，图案化PDMS表面，大大提高制备效率。

本发明所采用的技术方案：一种激光图案化PDMS表面快速提高生物附着性的方法，通过激光作用后的PDMS表面会形成微结构，为细胞附着生长提供了一个良好的环境；或通过激光作用后的PDMS表面发生化学改性或结构改性，从而提高生物附着性。

优选的，所述微结构可以固定蛋白质、细胞生长因子、酶及核酸。

优选的，激光器产生高能脉冲激光光束，所述高能脉冲激光光束经过反射镜后，通过凸透镜进行聚焦至PDMS表面，在所述高能脉冲激光光束辐射带来的高能量和冲击力作用下，PDMS表面发生光热作用和光化作用，并瞬间汽化或迸溅，从而在PDMS表面形成微结构。

优选的，激光器产生高能脉冲激光光束，所述高能脉冲激光光束经过反射镜后，通过凸透镜进行聚焦至PDMS表面，在所述高能脉冲激光光束辐射带来的高能量和冲击力作用下，PDMS表面发生化学改性或结构改性，从而提高生物附着性。

优选的，将PDMS放置于三维微细工作平台上，通过计算机及运动控制系统控制三维微细工作平台的垂直方向运动以调整PDMS表面与激光焦点之间的距离；通过计算机及运动控制系统以速度可调的方式控制三维微细工作平台的水平方向的二维运动，制备出PDMS表面所需修饰的区域图案，从而在不影响非修饰区域的情况下，图案化PDMS表面，并提高其生物附着性。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：(1)本发明激光作用在PDMS表面改性或形成微结构，提高PDMS表面生物附着性；(2)本发明三维微细工作平台垂直方向的运动调整PDMS表面与聚焦激光之间的距离；三维微细工作平台，水平方向的二维运动，可以图案化所需提高生物附着性的PDMS表面；(3)本发明利用激光直接作用PDMS表面，通过控制激光的能量、脉冲重复频率以及焦平面等工艺参数使其表面改性或形成表面微结构，可以不同程度的提高PDMS表面的生物附着性。并且通过三维平台的控制，可在表面复杂的局部区域进行图案化改性处理。相比现有技术，本发明更简便快速，更具加工适应性；现有技术主要以化学方式来改变PDMS表面的生物附着性。通过PDMS表面发生相关的化学反应或以接枝的方式，使其表面形成极性基团，或在表面吸附相关生物修饰分子，模拟细胞外基质粘附蛋白作用，促进细胞在PDMS表面的粘附。并且如果要在PDMS表面图案化改性，还需要增加掩模的方式来避免非修饰区域受到影响；(4)本发明利用激光作用PDMS表面，使PDMS表面局部区域形成凹凸不平的微结构，或者在对应激光单光子能量足以破坏PDMS化学键能的条件下，使其化学键裂解后，重新反应生成新的能够促进细胞附着的官能团，即表面发生化学改性。激光作用PDMS表面提高生物附着性，可根据不同的脉冲能量、脉冲重叠率以及离焦量等激光工艺参数变量产生不同程度的变化，使表面处理效率大大提高；(5)三维微细工作平台的垂直方向的运动可调整PDMS表面与激光焦点之间的距离，三维微细工作平台做水平方向的二维运动，以扫描的方式，制备出所需提高细胞附着性的图案，从而在不影响非修饰区域的情况下，提高PDMS表面所需修饰区域的生物附着性。可见，对于复杂的局部区域，加工适应性较好。(6)本发明利用激光与PDMS相互作用，可直接在空气中进行，不会产生有害气体或有害废料，是一个科学环保，可持续发展的表面改性技术；(7)本发明不需要复杂的化学改性处理步骤，效率高、图案化简便，可操控性好并且环保。

附图说明

图1为本发明一种激光图案化PDMS表面快速提高生物附着性的方法原理图；

图2为PMPC在PDMS表面的光化学接枝的示意图；

图3为培养24h后的MG-63细胞铺展显微镜照片；

图4为PDMS膜片表面接枝聚乙二醇示意图；

图5为紫外光刻蚀制备PDMS-PEG图案化表面示意图；

图6为软刻蚀中弹性印章的制作的示意图；

图7为实施例三中，经激光作用PDMS表面路径轨迹图；

图8为实施例三中，细胞培养72小时后，左侧未改性PDMS表面和右侧激光改性后PDMS表面生物附着性效果图；

图9为实施例三中，细胞培养72小时后，激光改性后表面生物附着性效果放大图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。

实施例一

如图1所示，一种激光图案化PDMS表面快速提高生物附着性的方法，通过激光作用后的PDMS表面会形成微结构，为细胞附着生长提供了一个良好的环境；

所述微结构可以固定蛋白质、细胞生长因子、酶及核酸。

激光器(1)产生高能脉冲激光光束，所述高能脉冲激光光束经过反射镜(4)后，通过凸透镜(6)进行聚焦至PDMS(7)表面，在所述高能脉冲激光光束辐射带来的高能量和冲击力作用下，PDMS(7)表面发生光热作用和光化作用，并瞬间汽化或迸溅，从而在PDMS(7)表面形成微结构。

具体为：将PDMS放置于三维微细工作平台上，通过计算机(3)及运动控制系统(2)控制三维微细工作平台(8)的垂直方向运动以调整PDMS(7)表面与激光焦点之间的距离；通过计算机(3)及运动控制系统(2)以速度可调的方式控制三维微细工作平台(8)的水平方向的二维运动，制备出PDMS(7)表面所需修饰的区域图案，从而在不影响非修饰区域的情况下，图案化PDMS(7)表面，并提高其生物附着性。

实施例二

如图1所示，一种激光图案化PDMS表面快速提高生物附着性的方法，通过激光作用后的PDMS表面发生化学改性或结构改性，从而提高生物附着性；

激光器(1)产生高能脉冲激光光束，所述高能脉冲激光光束经过反射镜(4)后，通过凸透镜(6)进行聚焦至PDMS(7)表面，在所述高能脉冲激光光束辐射带来的高能量和冲击力作用下，PDMS(7)表面发生化学改性或结构改性，从而提高生物附着性。

具体为：将PDMS放置于三维微细工作平台上，通过计算机(3)及运动控制系统(2)控制三维微细工作平台(8)的垂直方向运动以调整PDMS(7)表面与激光焦点之间的距离；通过计算机(3)及运动控制系统(2)以速度可调的方式控制三维微细工作平台(8)的水平方向的二维运动，制备出PDMS(7)表面所需修饰的区域图案，从而在不影响非修饰区域的情况下，图案化PDMS(7)表面，并提高其生物附着性。

实施例三

如图1所示，一种激光图案化PDMS表面快速提高生物附着性的方法，

(一)PDMS基片制作：PDMS预聚物与固化剂以10:1的比例混合，充分搅匀10分钟；将混合物倒入模具；因搅匀时混入较多的空气，需用抽真空机进行真空抽气半小时；再将混合物放入水平的烘干箱，设置温度65摄氏度，加速固化4小时得到PDMS基片；取出PDMS基片并封存。

(二)激光器为355nm波长的紫外脉冲激光器，开启激光器，激光器(1)产生高能脉冲激光光束，所述高能脉冲激光光束经过反射镜(4)后，通过凸透镜(6)进行聚焦至PDMS(7)表面，在所述高能脉冲激光光束辐射带来的高能量和冲击力作用下，PDMS(7)表面发生光热作用和光化作用，并瞬间汽化或迸溅，从而在PDMS(7)表面形成微结构；具体为调节Z轴使激光焦点位于PDMS(7)表面，激光能量密度设定为11.8J/cm2，脉宽设定为10μs，重复频率设定为30kHz，XY平台运动速度设定为160mm/s。通过计算机(3)及运动控制系统(2)控制三维微细工作平台(8)的垂直方向运动以调整PDMS(7)表面与激光焦点之间的距离；通过计算机(3)及运动控制系统(2)以速度可调的方式控制三维微细工作平台(8)的水平方向的二维运动制备出PDMS(7)表面所需修饰的区域图案，从而在不影响非修饰区域的情况下，图案化PDMS(7)表面，并提高其生物附着性；具体为通过X水平方向划一条线，再往Y方向间隔10μm，然后X水平反方向划线，再Y方向间隔10μm，X水平方向划线……一直循环从而形成一个经过激光改性的平面图案，如图7，此图案仅用作测试激光改性后表面附着性效果，后续图案可根据研究需要进行变化，其他激光参数也是可变的

测试其改性后的生物附着性，附着性实验用的细胞为293t老鼠肾上皮细胞，观察装置为倒置显微镜，观察如图8。

从图8可以看出，经过激光改性后的表面明显提高了生物附着性，细胞趋向于激光改性后的PDMS表面附着生长。左侧未改性表面的细胞较少，且处于聚集状态，大部分已经死亡，无法铺展生长。而右侧激光改性后表面细胞有聚集的趋势，但大部分仍保持独立个体，伸出触角在表面铺展附着生长。为更能看清楚细胞附着样貌，放大倒置显微镜倍率，如图9。

对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。