专利名称：嗪草酮降解菌和基于该菌的土壤生物修复菌剂及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种嗪草酮农药降解菌及基于该菌制备的土壤生物修复菌剂，其是利用微生物的技术降解化学农药残留，适用于现代农业生产中绿色无公害农产品的生产与加工。
背景技术：
嗪草酮是德国拜耳公司于1971年开发的三氮苯类除草剂，主要用于大豆田等防除阔叶和禾本科杂草。这类除草剂具有除草速度快、对人畜低毒等优点，但由于长期使用或使用不当，对敏感作物容易产生药害，不仅影响高等植物生长，而且会对地表、地下水、土壤和动物等产生一定的危害。其中有些品种如嗪草酮在土壤中的残留时间较长，对后茬甜菜、 蔬菜等作物易产生药害。同时嗪草酮是一种内分泌干扰物质，对高等动物具有异常的生理效应，当嗪草酮进入生物体内残留、富集到一定程度时就会产生生物毒性。因此，研究解决嗪草酮残留毒害问题对扩大它在生产上应用，减少对后茬作物及环境造成的污染具有重要意义。目前大量研究证明利用微生物的代谢途径可以消除农药残留，而且是一种很好的环境生物修复技术，其中投加高效降解菌株是生物修复中最常见最有效的一种方法。嗪草酮在土壤中的消解是由于迁移和降解两个过程结合所致，微生物降解农药残留依靠自然力量，不产生二次污染。通过筛选高效嗪草酮降解菌株，将其经过发酵加工成菌剂，应用于农药残留降解，从而达到消除土壤、水体、农产品中嗪草酮残留。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种嗪草酮农药残留降解菌，其分类命名为蜡样芽孢杆菌NI (Bacillus cereus NI),该菌株是一株革兰氏染色反应阳性菌,在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)(地址是中国湖北省武汉市武昌珞珈山，邮编430072)的保藏编号是 CCTCC NO M2011163o 保藏日期2011 年 5 月 9 日。该降解菌菌株在平板培养基上生长的菌落形态为直径5 7mm，圆形，表面粗糙， 扁平，不规则稍有光泽，白色，半透明，细菌细胞体为杆状，末端方，成短或长链，氧化酶试验为阳性，V. P试验为阳性，葡萄糖发酵试验为阳性，该菌株16SrDNA的Genbank登陆号为 HQ451884。所述平板培养基的配方是NaCl 5g、蛋白胨10g、牛肉膏5g、琼脂15 20g，NaHP04
I.50g，加IOOOmL蒸馏水，调pH为7。本发明的另一个目的是提供一种基于上述NI菌株的土壤生物修复菌剂，其由如下步骤制备I)在前面所述的嗪草酮降解菌NI的斜面试管菌种中，用接种环沾少许菌体接种于平板培养基上，30°C培养48h后；然后再用接种环沾少许菌体接种于LB培养基中，30°C振荡培养至对数期；所述LB培养基是将IOg NaCl、5g酵母粉和5g胰蛋白胨，加入到IOOOmL蒸馏水配制而成，调pH为7. O;2)将上述步骤培养好的菌种接入种子瓶，用量为10 15mL菌种/IOOOmL种子瓶培养基，振荡培养至对数期，每IOOmL种子瓶培养基组成按重量百分比是蔗糖O. 3 O. 5%, MgSO4 · 7H20 O. 04 O. 08 %、K2HPO4 O. 15 O. 2 %、NaCl O. 08 O. I %、KH2PO4 O. 05 O. 07%、酵母膏O. 015 O. 02%，余量为水，调ρΗ7· O ；3)将上述步骤培养好的菌种，加入到由豆柏、麦麸、木屑、稳定剂硅藻土组成的发酵培养基中，用量为15 20mL菌种/IOOOg发酵培养基，同时把15 20mL的营养液加入到IOOOg发酵培养基中，在30°C下进行通风发酵48h，并将发酵物在30°C下进行通风干燥， 粉碎后进行包装，即得到降解菌NI菌株的土壤生物修复菌剂；每IOOg发酵培养基的组成按重量百分比是豆柏55 60%、麦麸15 20%、木屑10 15%、稳定剂娃藻土 4 8% ;每IOOmL营养液组成按重量百分比是鹿糖O. 5 O. 7 %，KH2PO4 O. 08 O. I %， MgSO4 · 7H20 O. 08 O. I %, K2HPO4 O. 18 O. 2%, NaClO. I I. 2%，余量为水，pH 自然;本发明的另一个方面，是提供一种包含嗪草酮农药残留降解菌NI (Bacillus cereus NI)的固体菌剂在土壤生物修复中的应用。具体实验如下，首先称取土壤lOOOg，加入由嗪草酮原药制成的水溶液，使土壤中嗪草酮的浓度为20mg/kg (即配制成被嗪草酮污染的土壤)，将含有NI菌株的土壤生物修复菌剂按重量百分比为10%施于土壤中，充分混匀，放于30°C的黑暗培养箱中恒温培养，定时取样测定嗪草酮在土壤中的残留。结果参见图I。选取甜菜种子为供试作物。分别配制含嗪草酮浓度为lmg/kg、10mg/kg、20mg/kg 的含药土壤(每盆IOOOg 土壤)，使含水量为20%左右，将NI菌株的土壤生物修复菌剂按重量百分比为10%比例散施在土壤中充分混合，同时分别设不加菌、不加嗪草酮做为对照处理，取清水浸种催芽萌发一致的甜菜种子，播种于不同处理土壤中，每盆10粒，置于25°C 光照培养箱中培养7d，适时喷水保湿，测量不同处理甜菜的株高、根长。结果参见图2、图3。本发明的有益效果如下I、本发明提供了一种嗪草酮的降解菌，土壤降解实验表明，对嗪草酮降解率可达 68.19%。该菌剂具有生产成本低、降解效果好、使用方便等优点。适合于消除土壤中的农药残留，对保护生态环境和食品安全具有重要意义。2、生物修复实验表明，以甜菜做为供试作物，嗪草酮浓度为lmg/kg、10mg/kg、 20mg/kg的含药土壤中分别施加该菌剂后，根长分别提高15%、18^^21%,株高分别提高 8%、25%、39%。
图I :N1菌剂对土壤中嗪草酮降解的影响曲线；
图2 N1菌剂对甜菜苗高的影响曲线；
图3 N1菌剂对甜菜根长的影响曲线；
图4 :不同pH条件下NI菌株对嗪草酮的降解曲线； 图5 :不同温度条件下NI菌株对嗪草酮的降解曲线； 图6 :不同初始浓度下NI菌株对嗪草酮的降解曲线；
图7 :氯喃磺隆诱导作用对菌株NI对嗪草酮的影响。
具体实施例方式实施例I :嗪草酮降解菌的富集、分离、纯化及菌悬液的制备取5g 土壤样品(吉林农业大学农业科学试验站多年使用嗪草酮试验田)加入盛有IOOmL无机盐培养基的三角瓶中，从配制的浓度为1000mg/L的嗪草酮溶液中取2mL直接加到三角瓶中作为微生物生长的唯一氮源(20mg/L)，在摇床上培养2d(30°C，160r/min)后转接至含嗪草酮50mg/L的无机盐培养基中培养2d后,然后在含浓度为100mg/L的嗪草酮平板培养基上接入上述培养2d的无机盐培养基0. lmL，涂布后于30°C培养箱中培养2d，挑出单菌落在平板培养基上重复移种划线3 4次进行纯化，将纯化后NI菌株用接种环沾取少许接种于50mL的LB液体培养基中，30°C、160r/min的摇床中震荡培养28h，取适量菌液离心，弃去上清液，用等量磷酸缓冲溶液洗涤沉淀，用50mL的磷酸缓冲溶液悬浮，得NI菌悬液备用。所述的无机盐培养基配方按重量百分比是蔗糖3g，KH2PO4 0. 5g，MgSO4 · 7H20
0.4g，K2HPO4 I. 5g，NaCl lg，加 IOOOmL 蒸馏水，pH 自然。从上述纯化好的菌株中获得一株嗪草酮降解菌，该降解菌为蜡样芽孢杆菌 NKBacillus cereus NI)的菌株。其保藏编号是CCTCC NO :M2011163。该降解菌菌株革兰氏阳性，在平板培养基上生长的菌落形态为直径5 7_，圆形，表面粗糙，扁平，不规则，稍有光泽，白色，半透明，细菌细胞体为杆状，末端方，成短或长链，氧化酶试验是为阳性，V. P 试验为阳性，葡萄糖发酵试验为阳性。该菌株16SrDNA的Genbank登陆号为HQ451884。实施例2:降解条件I、pH对菌株NI降解嗪草酮的影响按体积百分比为5%接菌量，将实施例I制备的NI菌悬液接入嗪草酮浓度为 20mg/L的无机盐培养基中，分别调节培养基的pH值为5. 0,6. 0,6. 5,7,7. 5,8. 0,9. O,在 30 V、160rpm摇床振荡培养，分别在24、48、72、96、120h测定嗪草酮的含量。所述无机盐培养基配方按重量百分比是鹿糖3g，KH2PO4 0. 5g, MgSO4 ·7Η20 0. 4g， K2HPO4 I. 5g，NaCl lg，加 IOOOmL 蒸馏水，pH 自然。pH对菌株降解嗪草酮的实验结果表明，当pH为7.0时，120h降解率最高达到 78. 43%，随着pH值升高或降低，嗪草酮降解效率逐渐下降。表明该菌能适应中性的培养基。结果参照图4。2、温度对菌株NI降解嗪草酮的影响温度实验中，选用五种不同温度20、25、30、35、401，在嗪草酮浓度为20mg/L无机盐培养基中，按体积百分比为5%接入实施例I制备的NI菌悬液，160rpm摇床震荡培养，分别在24、48、72、96、120小时取样测定嗪草酮的含量。所述无机盐培养基配方按重量百分比是鹿糖3g，KH2PO4 0. 5g, MgSO4 ·7Η20 0. 4g， K2HPO4 I. 5g，NaCl lg，加 IOOOmL 蒸馏水，pH 自然。在20_40°C培养条件下，分别测定菌株NI对嗪草酮的降解率。菌株NI降解嗪草酮的最适温度为30°C，120h降解率可达到79. 48%。但是20°C的时候，菌株N80对嗪草酮降解率只有51. 73%，40°C时降解率为59. 68%。表明低温或高温影响菌株对嗪草酮的降解能力。结果参照图5。3、嗪草酮的初始浓度对菌株NI降解嗪草酮的影响在无机盐培养基中加入嗪草酮溶液，使其终浓度分别为5mg/L、10mg/L、20mg/L、 50mg/L、80mg/L、100mg/L，以体积百分比为5%的接菌量接入实施例I制备的NI菌悬液， 30°〇、160印111摇床震荡培养，分别在24、48、72、96、12011取样，测定嗪草酮的降解率。结果参见图6和表I。表I :N1菌株降解嗪草酮一级动力学方程
初始浓度 (mg/L)一级动力学方程半衰期(d)相关系数(r)降解速率常数5LnC = 0.2444t+ 1.82523.70.98210.244410LnC = 0.3556t +2.65302.90.98780.355620LnC = 0.3919t +3.37362.70.99550.391950LnC =0.2204 t +4.13274.10.99170.2204实验结果表明，嗪草酮初始浓度5mg/L时，嗪草酮降解率达到61. 2% ;嗪草酮初始浓度20mg/L时，嗪草酮降解率达到73. 49% ;嗪草酮初始浓度高于50mg/L时，生物降解速度随嗪草酮浓度的提高而有所下降，当浓度是100mg/L时，降解率只有45%。当嗪草酮初始浓度为5mg/L、10mg/L、20mg/L、50mg/L时,符合农药降解动力学方程。从表I中可以看出， 当嗪草酮浓度为20mg/L时降解速率常数是O. 3919。半衰期是2. 7天，所以20mg/L是最佳降解浓度。所述无机盐培养基配方按重量百分比是蔗糖3g，KH2PO4 O. 5g, MgSO4 ·7Η20 O. 4g， K2HPO4 I. 5g，NaCl lg，加 IOOOmL 蒸馏水，pH 自然。4、诱导作用对嗪草酮降解的影响将菌株NI分别接种在硝酸铵浓度为20mg/L、嗪草酮浓度为20mg/L的无机盐培养基上培养48h，分别将培养48h的菌液按体积百分比为5%定量接种于嗪草酮浓度为20mg/ L无机盐培养基中，30°C、160rpm摇床振荡培养，分别在24、48、72、96小时后取样，测定嗪草酮浓度。所述无机盐培养基配方按重量百分比是蔗糖3g，KH2PO4 O. 5g, MgSO4 ·7Η20 O. 4g， K2HPO4 I. 5g，NaCl lg，加 IOOOmL 蒸馏水，pH 自然。菌株NI在在含有硝酸铵的培养基上培养后，将其分别接种到含有嗪草酮的无机盐培养液中培养48小时，嗪草酮的降解能力显著下降，仅为15.7%，而经过嗪草酮诱导后菌株培养48，嗪草酮降解率达到79. I %。这说明底物嗪草酮对其菌株NI降解活性具有诱导作用，在不含有嗪草酮的环境中长期培养，所获得的菌株则可能会丧失其对嗪草酮的降解代谢活性，说明降解菌NI以嗪草酮为唯一氮源。结果参照图7。综上研究表明，环境温度和pH值对NI菌株的降解特性影响较大，当pH值为7. O、 温度为30°C时，NI菌株对嗪草酮的降解率最高，超过这个范围，降解率明显下降。研究发现，NI菌株的降解能力由嗪草酮诱导而产生,嗪草酮诱导的最适合浓度为20mg/L。在此条件下，48h降解率可达79. I %。当氯嘧磺隆初始浓度达到50mg/L以上时，菌株降解嗪草酮能力逐渐下降。这是由于嗪草酮降解达到一定浓度后会强烈抑制菌体生长或是对底物的代谢，也是由菌株的生理结构及特性所决定。当嗪草酮初始浓度为5mg/L、10mg/L、20mg/L、 50mg/L时,符合农药降解动力学方程。菌株NI对嗪草酮的降解能力是符合一级动力学方程。实施例3 :菌剂制备试验在嗪草酮降解菌NI的斜面试管菌种中用接种环沾少许菌体接种于平板培养基上，30°C培养48h后，再用接种环沾少许菌体接种于LB培养基中，30°C振荡培养至对数期。所述平板培养基的配方按重量百分含量是NaCl 5g、蛋白胨10g、牛肉膏5g、琼脂 15g，NaHPO4 I. 50g，加入IOOOmL蒸馏水；所述LB培养基是=NaCl 10g、酵母粉5g、胰蛋白胨 5g，加入IOOOmL蒸馏水，pH为7. O ;将培养好的菌种IOmL接入种子瓶，振荡培养至对数期； IOOOmL 的种子瓶培养基为蔗糖 5g、MgSO4 · 7H20 O. 8g、K2HPO4 2g、NaCl lg、KH2PO4 0. 5g、 酵母膏0. 2g，加入IOOOmL水，培养基的ρΗ7· O ；将上述培养好的菌种15mL加入到由豆柏、麦麸、木屑、稳定剂(娃藻土)组成的 IOOOg的发酵培养基中，同时加入15mL的营养液，在30°C下进行通风发酵48h，将发酵物在 30°C下进行通风干燥，粉碎后进行包装，包装制成产品，即得到基于上述NI菌株的土壤生物修复菌剂。IOOOg发酵培养基配方是豆柏600g、麦麸200g、木屑150g、稳定剂(硅藻土)50g ； IOOOmL 营养液配方是蔗糖 5g、KH2PO4 O. 8g，MgSO4 · 7H20 O. 8g，K2HPO4 2g，NaCl lg、余量为水，pH自然。实施例4 :生物修复降解菌菌剂的生物修复作用对敏感作物影响甜菜种子作为供试作物，选取经清水浸种催芽萌发一致的甜菜种子备用。配制嗪草酮溶液放入花盆中(每盆IOOOg 土)，加入适量的水，使含水量为20%左右，将实施例2 制备的NI菌剂施在土壤中。处理一取风干土(过20目筛)I. Okg,加入适量的水，使含水量为20%。处理二 分别取风干土(过20目筛)I. 0kg，加入嗪草酮溶液，充分拌匀后制成嗪草酮浓度分别为lmg/kg、10mg/kg、20mg/kg的含药土壤,再加入重量百分比为10%的基于上述NI菌株的生物修复菌剂，混匀。处理三取风干土(过20目筛)I. 0kg，加入嗪草酮溶液，充分拌勻后制成嗪草酮浓度分别为lmg/kg、10mg/kg、20mg/kg的含药土壤。从已经浸种催芽的种子中选取萌发度一致的甜菜种子，播种于不同处理土壤中， 在25°C温室中培养7d。同时观察记录不同处理土壤株高、根长。降解菌固体菌剂的生物修复作用对敏感作物的影响实验结果表明含药土壤施用菌剂后可以明显提高甜菜株高、根长。当土壤中嗪草酮浓度分别为lmg/kg、10mg/kg、20mg/ kg时，加入质量分数为10%的菌剂后，甜菜的株高和根长明显高于未施用菌剂处理培养的甜菜，株高分别提高10%、35%、63%，根长分别提高19%、35%、47%，表明NI菌剂对土壤中嗪草酮有较好的降解作用，提高甜菜株高、根长。同时土壤中嗪草酮的残留对甜菜的生长有明显的抑制作用，施用NI菌剂后甜菜的药害作用明显减轻，加菌处理含药土壤中甜菜株高、根长均明显高于未加菌处理植株。表明NI菌剂对甜菜的生长有明显的解除药害的作用。结果参照图2和图3。
权利要求
1.一种嗪草酮农药残留降解菌,其分类命名为腊样芽孢杆菌NI (Bacillus cereus NI)，在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)的保藏编号是CCTCC NO :M2011163，该降解菌菌株在平板培养基上生长的菌落形态为直径5 7mm，圆形，表面粗糙，扁平，不规则稍有光泽，白色，半透明，细菌细胞体为杆状，末端方，成短或长链，氧化酶试验为阳性，V.P试验为阳性，葡萄糖发酵试验为阳性。
2.一种包含权利要求I所述的嗪草酮农药残留降解菌的土壤生物修复菌剂。
3.如权利要求2所述的土壤生物修复菌剂的制备方法，其步骤如下1)在嗪草酮降解菌NI的斜面试管菌种中，用接种环沾少许菌体接种于平板培养基上， 30°C培养48h后；然后再用接种环沾少许菌体接种于LB培养基中，30°C振荡培养至对数期； 所述LB培养基是将IOg NaCl、5g酵母粉和5g胰蛋白胨，加入到IOOOmL蒸馏水中配制而成， 调pH为7. O ;2)将上述步骤培养好的菌种接入种子瓶，用量为10 15mL菌种/IOOOmL种子瓶培养基，振荡培养至对数期，IOOmL的种子瓶培养基的重量百分含量是蔗糖O. 3 O. 5%、 MgSO4 · 7H20 O. 04 O. 08 %、Κ2ΗΡ040· 15 O. 2 %、NaCl O. 08 O. I %、KH2PO4 O. 05 O.07%、酵母膏O. 015 O. 02%，余量为水，调pH为7. O ;3)将上述步骤培养好的菌种，加入到由豆柏、麦麸、木屑、稳定剂硅藻土组成的发酵培养基中，用量为15 20mL菌种/IOOOg发酵培养基，同时把15 20mL的营养液加入到 IOOOg发酵培养基中，在30°C下进行通风发酵48h，并将发酵物在30°C下进行通风干燥，粉碎后进行包装，即得到降解菌NI菌株的土壤生物修复菌剂；每IOOg发酵培养基的组成按重量百分比是豆柏55 60 %、麦麸15 20%、木屑 10 15%、稳定剂娃藻土 4 8% ;每IOOml营养液组成按重量百分比是蔗糖O. 5 O. 7 %，KH2PO4O. 08 O. I %， MgSO4 · 7H20 O. 08 O. I %, K2HPO4 O. 18 O. 2%, NaClO. I I. 2%，余量为水，pH 自然;
4.一种包含权利要求I所述的嗪草酮农药残留降解菌的土壤生物修复菌剂在土壤生物修复中的应用。
5.如权利要求4所述的一种包含嗪草酮农药残留降解菌的土壤生物修复菌剂在土壤生物修复中的应用，其特征在于按重量百分比为10%的比例，将土壤生物修复菌剂散施于种植有作物的土壤中。
6.如权利要求5所述的一种包含嗪草酮农药残留降解菌的土壤生物修复菌剂在土壤生物修复中的应用，其特征在于作物是甜菜。
全文摘要
本发明涉及一种嗪草酮农药残留降解菌，其分类命名为蜡样芽孢杆菌N1(Bacillus cereus N1)，该菌株是一株革兰氏染色反应阳性菌，在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)的保藏编号是CCTCC NOM2011163，及应用该菌制备的土壤生物修复菌剂及应用。嗪草酮农药残留降解菌为从生产嗪草酮农药厂排水口淤泥中通过富集培养分离得到的一株对嗪草酮有较强降解能力的菌株，该菌株以嗪草酮为唯一氮源生长，在液体培养基中通过嗪草酮诱导增加菌体活性，提高对嗪草酮的降解能力。该菌剂的制备方法简单，成本较低，施用方便，可以散施在土壤上，在土壤中的降解效果可达到68.19％，有很好的应用前景。
文档编号B09C1/10GK102604872SQ20121008691
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月29日 优先权日2012年3月29日
发明者侯志广, 张 浩, 王岩, 赵晓峰, 逯忠斌, 高鹤南 申请人:吉林农业大学