一种处理石油类污染物的固定化菌藻共生系统及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属海洋石油污染生物修复【技术领域】，涉及一种处理石油类污染物的固定化菌藻共生系统，其是由如下方法制备而成：（1）藻种的选择及无菌化培养：小球藻藻液先经过溶菌酶和SDS无菌预处理，然后接种至含抗生素的BG11培养液中进行无菌化培养，得到无菌的小球藻藻液备用；（2）石油降解菌的选择和培养：（3）复合载体菌藻凝胶球的制备：将步骤（1）得到的无菌的小球藻藻液和步骤（2）得到的石油降解菌采用海藻酸钠和PVA作为固定化载体进行固定化，最后得到固定化菌藻共生系统。该固定化菌藻共生系统能够漂浮在水面上进行石油污染的降解，不会产生二次污染，对微生物无毒害作用，反应速度快，运行稳定可靠，微生物流失少，不需分离。
【专利说明】一种处理石油类污染物的固定化菌藻共生系统及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属海洋石油污染生物修复【技术领域】，涉及一种处理石油类污染物的固定化菌藻共生系统。
【背景技术】
[0002]海洋是地球三大生态系统之一，是维持全球生态平衡的重要屏障，海洋在为人类提供大量资源的同时，也正面临着越来越严峻的污染，其中石油是海洋环境中最重要的污染物。海洋石油污染的主要来源为石油运输、油田开采、海岸排油及大气石油烃沉降等，据联合国有关组织的统计，每年人类生产生活所导致的海洋石油污染约为lX107t，其中包括了海上油井井喷事故和油轮事故所造成的污染，其溢油量高达2.2X106t。海洋石油污染不仅给海洋环境和海洋生态系统带来了严重的危害，同时也直接或间接的影响着人类的生存和可持续发展，海洋石油污染已经成为世界公害之一。因此，治理海洋石油污染已成为当前世界各国科学家关心和迫切需要解决的问题之一。
[0003]目前，海洋石 油污染的智力方法主要有物理机械法、化学法和生物法。物理机械法和化学法普遍存在除油不彻底和容易造成二次污染的问题，而生物降解法因其具备处理费用低、治理效果好、对环境影响小、无二次污染等优点，体现出其他方法无以比拟的优越性，其应用前景十分看好。生物法主要包括在污染区域接种微生物、添加营养物及提供电子受体等几种方法。其中，固定化生物技术是新兴起的一种新型生物技术，它是一种利用物理化化学方法将酶或生物细胞限制或定位在某一特定空间范围内，保留其固有的催化活性，并能被重复或连续使用的技术。固定化后的生物不仅能长期保持活性，而且固定化生物载体的微环境有利于屏蔽土著菌、噬菌体和毒性物质对生物体的恶性竞争、吞噬和毒害，减轻海浪的剪切力对生物的损害，使其在复杂的环境中稳定地发挥高效性能。对于污染物浓度较低，空间区域分布较广的海洋水体而言，固定化生物技术无疑具有特殊的技术优势。
[0004]目前，固定化生物技术最关键的是固定化载体材料的选择，具体要求是制备的固定化小球成本低，易于成型、固定化时间短、物理及化学稳定性好等特性，而且固定化过程中及固定化后对生物无毒。固定化材料一般采用海藻酸钠、琼脂、明胶、聚乙烯醇(PVA)和聚丙烯酰胺凝胶等。琼脂强度较差，明胶内部结构密实，传质性能差，聚丙烯酰胺凝胶对生物有毒性，海藻酸钠和PVA相对于其他载体，凝胶机械强度和传质性能均较好，对生物无毒，且耐生物分解性良好，是较为合适的固定化细胞载体。而作为海洋石油降解菌的固定载体需要满足以下特殊条件:可降解、可漂浮、生物相容性好、对景观影响小。因此采用海藻酸钠和PVA制成的固定化复合载体因具有原料来源广泛、价格低廉、固定条件温和、操作简单、生物相容性好、基质和产物扩产阻力小等优点，而成为制备海洋石油微生物固定载体的理想材料。
[0005]菌藻共生系统是利用藻类和细菌两类生物之间的生理功能协同作用来净化水体的生态系统。当前利用生物法处理海洋石油污染的菌种绝大部分是好氧菌，所以氧含量的高低很大程度上影响其对石油的降解效率。然而被石油污染的水体中由于光合作用减弱以及水生生物的呼吸作用使水中溶解氧含量较低，这就限制了微生物对石油降解速率的提高。藻类的光合作用为细菌提供了呼吸作用所需要的氧气，在缺乏氮的环境中，藻类还可通过固氮作用固定大气中的氮，为细菌提供氮元素以及有机物，促进其生长。由于光照的限制，一些烃类降解菌受到抑制，与藻类形成共生体后，可保护其在强光或者干燥条件下生存。同时，共生系统也为藻类的生长提供了有利条件，细菌呼吸产生的CO2能被藻类利用，细菌降解石油而产生的有机物也能被藻类所利用。此外，藻类可先将石油烃富集在藻细胞中，细菌再获得这些物质，因而在与藻类共生时，降解菌的生长速率以及对石油的降解效率均要高于其单独培养。由此可见，藻类和海洋中降解石油的细菌形成共生体系，为彼此提供能源和营养物质，互利共生，提高海上石油的降解效率。
【发明内容】
[0006]本发明提供一种用于处理海洋石油类污染物的固定化菌藻共生系统，该固定化菌藻共生系统能够漂浮在水面上进行石油污染的降解，不会产生二次污染，对微生物无毒害作用，反应速度快，运行稳定可靠，微生物流失少，不需分离。
[0007]本发明还提供一种所述的固定化菌藻共生系统在石油污染物降解中的应用。
[0008]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
[0009]一种处理石油类污染物的固定化菌藻共生系统，其特征在于其是由如下方法制备而成:
[0010](I)藻种的选择及无菌化培养:小球藻藻液先经过溶菌酶和SDS无菌预处理，然后接种至含抗生素的BG ll培养液中进行无菌化培养，得到无菌的小球藻藻液备用；
[0011]本发明采用溶菌酶/SDS (十二烷基磺酸钠)结合抗生素对小球藻进行无菌纯化，所用 BGll 培养液(常规培养基)的配方为:NaN031.5g/L、K2HP040.04g/L、MgS04.7Η200.075g/L、CaCl2.7H200.036g/L、柠檬酸(Citric acid) 0.006g/L、柠檬酸铁铵(Ammoniumferric citrategreen) 0.006g/L、EDTA0.001g/L、Na2C030.02g/L、H3B036.1 X 10_5g/L、MnS04.H201.69 X 10_4g/L、ZnS04.7H202.87 X 10_4g/L、CuS04.5H202.5 X 10_6g/L、(NH4) 6Mo7024.4H201.25X 10_5g/L。
[0012](2)石油降解菌的选择和培养:取6种石油降解菌，购买于中国海洋微生物菌种保藏管理中心(MCCC)，其中假单胞菌属3种，菌株编号为1A00241、1A00269和1A00364，芽孢杆菌属2种，菌株编号为1A0008、1A0009，无色杆菌属I种，菌株编号为1A04524，对上述6种石油降解菌依次命名为￥132、￥3、￥4、￥5、￥6，并分别进行培养，培养时间为3~5天；
[0013](3)将步骤(1)得到的无菌的小球藻藻液和步骤(2)得到的石油降解菌采用海藻酸钠和PVA作为固定化载体进行固定化，最后得到固定化菌藻共生系统。固定化菌藻共生系统即混合在一起的复合载体菌藻凝胶球。
[0014]微藻与细菌能构成菌藻共生体系，其协同作用能使污染物的生物降解更为高效，但是由于微藻在生长过程中附带着一些细菌，在人工菌藻体系组建过程中，外加菌与微藻自身所带附生菌的关系十分复杂，可能相互促进、抑制、协同或拮抗，为构建最高效的石油降解体系，对微藻进行无菌化培养是必不可少的前提条件。通过对菌藻共生系统处理海洋石油类污染物相关文献的查阅，最终选择小球藻作为本发明的藻种，该藻种购自中国科学院武汉水生生物研究所。[0015]作为优选，步骤(1)所用无菌预处理方法为:取在BGll培养液中培养7d的小球藻藻液，离心去上清液，无菌蒸馏水重复洗涤离心3~5次，加ImL质量浓度0.005%的Tween80, 5 滴 0.lmol/L 的 EDTA, 3OmL 无菌水，摇匀放置 IOmin,再加 ImL0.5mg/ml 溶菌酶，5滴0.25%的SDS’摇匀，放置lOmin，离心去上清液后，再用无菌水洗涤3~5次。
[0016]作为优选，步骤(1)中含抗生素的BGll培养液配方为:NaN03l.5g/L、K2HPO4.3Η200.04g/L、MgSO4.7Η200.075g/L、CaCl2.7Η200.036g/L、柠檬酸(Citric acid)
0.006g/L、朽1 樣酸铁铵(Ammonium ferric citrategreen) 0.006g/L、EDTA0.001g/L、Na2C030.02g/L、H3B036.1X l(T5g/L、MnSO4.H2Ol.69X l(T4g/L、ZnSO4.7H202.87X l(T4g/L、CuSO4.5H202.5X l(T6g/L、(NH4)6Mo7O24.4H201.25 X l(T5g/L、lml/L 青霉素和 0.5ml/L 卡拉霉素作为优选，步骤(1)培养条件为:温度25 土 1°C，摇床转速150r/min培养，光照强度为80001ux，光暗比 L/D=14:10。
[0017]作为优选，步骤(2)所用石油降解菌的培养基配方为:石油10g、NH4N033g、KH2PO40.5g、K2HP040.5g、微量元素液2mL和水1000mL，pH为7.5 ;微量元素液组分(重量)为:MgSO40.4%、CuSO40.1%、MnSO40.1%、FeSO4.H2O0.1% 和 CaCl20.1%。
[0018]作为优选，固定化方法具体为:用无菌注射器抽取含藻种、石油降解菌群和固定化复合载体的混合溶液至质量浓度4%、pH=6.7的硼酸溶液中，在10°C固定化交联20h，然后将小球取出，去离子水脱盐2h，并4°C保存于无菌海水中，得到固定化菌藻共生系统。
[0019]作为优选，步骤(2)小球藻藻液、石油降解菌培养液与固定化载体的比例为1:1:2混合，固定化载体的配方(质量分数)为0.3%海藻酸钠、20%PVA、8%Si02和0.6%CaC03。
[0020]本发明将石油降解菌群和小球藻附着在一种采用海藻酸钠和PVA的复合膜制成的可漂浮可降解的生物固定载体上，从而制备出的固定化菌藻共生系统有望用于海洋石油污染的治理。
[0021]所述的固定化菌藻共生系统在石油污染物降解中的应用，将步骤(3)中制备的复合载体菌藻凝胶球按照1%的质量浓度接种到含石油0.5% (重量)的50mL MMC培养基中，30°C、180rpm摇床培养7天，培养液用于降解率的测定。所用MMC培养基配方为:NaCl0.024g/L、MgSO4.7Η200.0007g/L、NH4NO30.001g/L、KC10.0007g/L、KH2PO40.002g/L、Na2HPO4.7H200.003g/L, pH为7.5，灭菌后补加适量微量元素混合。
[0022]与现有技术相比，本发明具有以下优点:
[0023](1)采用溶菌酶/SDS结合抗生素对选用的小球藻进行除菌纯化，获得无菌小球藻。在经过人工驯化的共生体系中，该藻种与高效石油降解菌互利共生，与天然的菌藻共生体系及只用混合菌剂处理海上石油污染相比，不仅保存了共生体系的优势，又继承了混合菌剂在适宜环境下高效处理石油的能力。
[0024](2)采用菌藻共生系统处理海上石油污染，一方面利用了菌藻互利共生的优势降解石油污染物，另一方面藻类在有效降解石油中的烃类化合物的同时也在细胞内富集大量的油脂，使其可以作为生物燃料加以利用。
[0025](3)采用海藻酸钠和PVA作为菌藻共生系统的复合载体，一方面为菌藻共生系统提供了一个相对稳定的环境，构建了稳定的微生物生态系统，使菌藻能够持续发挥石油污染环境修复作用。另一方面该复合载体可降解，无二次污染；可漂浮，使降解菌与石油污染物充分接触，降解效率更高；无毒害，不会对菌藻共生系统或海洋其他生物造成危害。【具体实施方式】
[0026]下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
[0027]在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
[0028]实施例1藻种的无菌化培养
[0029]小球藻藻液先经过溶菌酶/SDS预处理，然后接种至含不同抗生素组合的BGll培养液中进行无菌培养。
[0030]上述预处理方法为:取在BGl I培养液中培养7d的藻液，2000r/min离心10min，去上清液，无菌蒸懼水重复洗漆离心3~5次,加ImL Tween80 (0.005%), 5滴EDTA (0.1mol/L), 30mL无菌水,摇匀放置lOmin。再加ImL溶菌酶,5滴SDS,摇匀,放置lOmin。离心去上清液后，再用无菌水洗涤3~5次。
[0031 ] 由于各抗生素抑菌的作用机制不同，将上述6种抗生素进行组合(表1)，用于微藻无菌化培养，用平板检测除菌效果方法是:取抗生素培养基培养7d的藻液，稀释至10_4g/L，涂布于BGll固体平板。置于光照条件下再培养7d左右，观察平板上微藻和细菌的生长情况。
[0032]表1抗生素组合
【权利要求】
1.一种处理石油类污染物的固定化菌藻共生系统，其特征在于其是由如下方法制备而成: (1)藻种的选择及无菌化培养:小球藻藻液先经过溶菌酶和SDS无菌预处理，然后接种至含抗生素的BGll培养液中进行无菌化培养，得到无菌的小球藻藻液备用； (2)石油降解菌的选择和培养:取6种石油降解菌，购买于中国海洋微生物菌种保藏管理中心(MCCC)，其中假单胞菌属3种，菌株编号为1A00241、1A00269和1A00364，芽孢杆菌属2种，菌株编号为1A0008、1A0009，无色杆菌属I种，菌株编号为1A04524，对上述6种石油降解菌依次命名为Yl、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6，并分别进行培养，培养时间为3飞天； (3)复合载体菌藻凝胶球的制备:将步骤(1)得到的无菌的小球藻藻液和步骤(2)得到的石油降解菌采用海藻酸钠和PVA作为固定化载体进行固定化，最后得到固定化菌藻共生系统。
2.根据权利要求1所述的固定化菌藻共生系统，其特征在于:步骤(1)所用无菌预处理方法为:取在BGll培养液中培养7d的小球藻藻液，离心去上清液，无菌蒸馏水重复洗涤离心:3-5 次，加 ImL 0.005% 的 Tween80，5 滴 0.lmol/L 的 EDTA，30mL 无菌水，摇匀放置 lOmin，再加ImL 0.5mg/ml溶菌酶,5滴0.25%的SDS,摇匀，放置IOmin,离心去上清液后，再用无菌水洗涤3-5次。
3.根据权利要求1所述的固定化菌藻共生系统，其特征在于:步骤(1)中含抗生素的 BGll 培养液配方为:NaNO3 1.5g/L、K2HPO4 -- 3H20 0.04 g/L、MgSO4-- 7H20 0.075 g/UCaCl2-- 7H20 0.036 g/L、柠檬酸 0.006 g/L、柠檬酸铁铵 0.006 g/L、EDTA 0.001 g/UNa2CO3 0.02 g/L、H3BO3 6.1X10-5 g/L、MnS04-- H2O 1.69X10-4 g/L、ZnS04-- 7H202.87X10-4 g/L、CuS04-- 5H20 2.5X 10-6 g/L、(NH4)6Mo7O24-- 4H20 1.25X10-5 g/L、lml/L青霉素和0.5ml/L卡拉霉素。
4.根据权利要求1所述的固定化菌藻共生系统，其特征在于:步骤(1)培养条件为:温度25 ± I °C,摇床转速150r/min培养，光照强度为80001ux,光暗比L/D=14: 10。
5.根据权利要求1所述的固定化菌藻共生系统，其特征在于:步骤(2)所用石油降解菌的培养基配方为:石油10 g、NH4NO3 3 g、KH2PO4 0.5 g, K2HPO4 0.5 g、微量元素液2 mL和水1000 mL，pH 为 7.5 ;微量元素液组分(重量)为:MgS04 0.4%, CuSO4 0.1%, MnSO4 0.1%, FeSO4--H20 0.1% 和 CaCl2 0.1%。
6.根据权利要求1所述的固定化菌藻共生系统，其特征在于:固定化方法具体为:用无菌注射器抽取含藻种、石油降解菌群和固定化复合载体的混合溶液至质量浓度4%、pH=6.7的硼酸溶液中，在10°C固定化交联20h，然后将小球取出，去离子水脱盐2h，并4°C保存于无菌海水中，得到固定化菌藻共生系统。
7.根据权利要求1所述的固定化菌藻共生系统，其特征在于:步骤(2)小球藻藻液、石油降解菌培养液与固定化载体的比例为1:1:2混合，固定化载体的配方(质量分数)为0.3%海藻酸钠、20%PVA、8%Si02 和 0.6%CaC03。
8.—种权利要求1所述的固定化菌藻共生系统在石油污染物降解中的应用。
【文档编号】C02F103/08GK103849615SQ201310754942
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2013年12月31日 优先权日:2013年12月31日
【发明者】徐珊, 郑斌, 陆阿定, 杨会成, 周宇芳, 胡建坤 申请人:浙江省海洋开发研究院