解角质素微杆菌及其培养方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明为一株解角质素微杆菌（ Microbacteriumkeratanolyticum ）Mk-6菌株，环境适应能力强，可以在低营养、磷浓度为14.9mg/L（达到0.2mg/L将会致使水体富营养化）的合成污水液体培养基中快速生长，并将磷去除；除磷效率高而稳定，培养20h磷效率可达60%~70%，无二次污染。因此，Mk-6菌株可应用于含磷的污水处理，是水体生物除磷工艺上重要的微生物资源，具有良好的应用前景。CCTCC NO:M20142792014.06.24
【专利说明】解角质素微杆菌及其培养方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于环境微生物领域，具体涉及一株解角质素微杆菌(#icrc^ac i Mk-6菌株的分离、培养及其在污水除磷中的应用。
【背景技术】
[0002] 磷是生物生长的必需元素之一,但是水体中磷含量超过0. 2 mg/L将会致使水体富 营养化，导致水质降低，水体中的有害物质增加，饮用水资源减少，对人畜的健康造成影响， 破坏生态系统的平衡，造成经济损失。就2013年中国环境状况公报显示，松花江、海河、太 湖、巢湖、滇池等水域，均因总磷等指标的超标，多年来处于富营养化状态。因此，控制工业 废水、生活污水磷含量已经成为急切需要解决的重大环境问题之一。
[0003] 目前，水体除磷主要分为生物和化学除磷。化学除磷具有操作简单、高效除磷、稳 定等优点；但该法成本高，易造成二次污染。生物除磷是利用聚磷菌富集水体中的磷，通过 排除剩余含磷污泥的方式除磷，具有节能、产泥量少、成本低、无二次污染等优点，是大规模 污水处理厂主要的污水除磷方法。
[0004] 聚磷菌是一类具有"超量吸磷"特征的微生物，可以把多余的磷以多聚磷酸盐的形 式储藏在体内，使外界环境中的磷含量显著减少，是水体生物除磷的主要执行者，在生物除 憐中起决定性作用。
[0005] 实验室运用低营养合成污水液体培养基(磷含量为14. 9 mg/L)检测菌株水体除磷 能力，筛选具有高效除磷能力的聚磷菌。合成污水液体培养基磷浓度是致水体富营养化最 低磷浓度（〇. 2 mg/L)的74. 5倍，通过低营养超高磷浓度合成污水液体培养基筛选得到的 聚磷菌，能够较好的适应自然水体环境，且更高效的去除自然水体中的磷。
[0006] 本发明从自然生境中筛到一株高效生物除磷特性的聚磷菌解角质素微杆菌 (#icrc^aci6?ri應左<9，<3(<3/?〇7，?^應）]\&-6菌株，旨在丰富的聚磷菌资源,扩大聚磷菌菌种 库，为污水生物除磷提供菌种。
【发明内容】
[0007] 为了解决上述的技术问题，本发明的第一个目的是提供一株解角质素微杆菌 (#/<^，0办<3<^6?/^應左(9， <3(<3/7〇7，?^應)]\&-6菌株,该菌株除磷效率高而稳定。本发明的第二 个目的是提供上述的菌株的培养方法。本发明的第二个目的是提供上述的菌株的应用。
[0008] 为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案： 解角质素微杆菌(ift'croAacieriiffl? 菌株，该菌株保藏在位于中 国典型培养物保藏中心（CCTCC)，保藏日期为2014年06月24日，保藏编号为：CCTCC Ν0:Μ 2014279，保藏地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心。
[0009] 本发明所涉及的菌株筛选自浙江省金华市市郊池塘的水体样品。采用梯度稀释法 获得纯菌株，根据形态特征、生理生化特征、16S rDNA基因序列鉴定Mk-6菌株为解角质素 '傲妖麗、Microbacterium keratanolyticum)。
[0010] 为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案： 上述的解角质素微杆菌Mk-6菌株的培养方法，该方法包括以下的步骤：取保存 于-20°C的甘油的解角质素微杆菌Mk_6菌株20 μ L涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基的平 板上，28 °C培养24 h后挑单菌落于0.3 mL无菌水混匀，取100 yL涂布于牛肉膏蛋白胨 固体培养基的平板上，用打孔器取2孔接到15 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于28 °C， 170 r/min摇床中培养24 h用作种子液。
[0011] 为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案： 上述的解角质素微杆菌Mk-6菌株用于除磷。优选用于城市污水处理厂的生物除磷。
[0012] 本发明为一株解角质素微杆菌菌株，环 境适应能力强，可以在低营养、磷浓度为14. 9 mg/L (达到0.2 mg/L将会致使水体富营养 化）的合成污水液体培养基中快速生长，并将磷去除；除磷效率高而稳定，培养20 h磷效率 可达609Γ70%，无二次污染。因此，Mk-6菌株可应用于含磷的污水处理，是水体生物除磷工 艺上重要的微生物资源，具有良好的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0013] 图I Mk-6菌株的菌落特征。
[0014] 图2 Mk-6菌株的菌体形态（X 1000)。
[0015] 图3 Mk-6菌株16S rDNA基因序列。
[0016] 图4基于16s rDNA基因序列建立的微杆菌属系统发育树。
[0017] 图5 Mk-6菌株在低营养高磷合成污水培养液中的生长曲线。
[0018] 图6装液量对Mk-6菌株除磷率的影响。
【具体实施方式】
[0019] 实施例1高效聚磷菌解角质素微杆菌Mk-6菌株的分离筛选和鉴定 (一）培养基 牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、琼脂20 g/L，pH 7. (Γ7. 2 (液体培养基不加琼脂)，用于细菌的分离、纯化。
[0020] 限磷(富磷）固体培养基：取30 mL去离子水溶解8. 372 g 3-吗啉丙磺酸、0. 717g N-三(羟甲基）甲基甘氨酸，用10 mol/L的KOH调节pH至7. 4,按下列顺序加溶液：0.01 mL 1.830% FeSO4溶液（现配）、5 mL 1.9 mol/L NH4C1、1 mL 0.276 mol/L K2S04、0.025 mL 0.02 mol/L CaCl2 · 2Η20、0· 42 mL I. 25 mol/L MgCl2 · 6 H20、20 mL 2· 5 mol/L NaCl、0. 02 mL 微量元素混合液(七钥酸铵 3 X 10_6 mol/L、H3BO3 4X 10_4 mol/L、CoCl2 3 X 10_5 mol/L、CuSO4 10 5 mol/L、MnCl2 8 X 10 5 mol/L、ZnSO4 10 5 mol/L)、10 mL 1% 葡萄糖、0.4 mL I. 686% 维生 素 Bl、250 yL 6. 928% K2HPO4 (富磷加5 mL)、50 mg对甲苯胺蓝，加水定容至500 mL，过滤 除菌后与已灭菌处理的溶有20 g琼脂且未凝固的500 mL溶液混匀制成固体培养基，用于 聚磷菌的筛选。
[0021] (二）方法 采用梯度稀释分离法。取水样I mL，加9 mL无菌水稀释，进行KT1^r3梯度稀释，取 10_2、10_3稀释液100 μ L涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上，28 °C培养24 h。挑取 细菌单菌落，进行分离、纯化；进一步纯化菌株采用划线法，所得纯菌株置-20 °C冰箱中保 存，备用。
[0022] 分别接种保存的细菌纯菌株在限磷和富磷固体培养基上，用吕氏美兰染色法、苏 丹黑染色法、蓝白斑法和钥酸铵分光光度法测定细菌菌株对磷的吸收能力，经初筛和复筛 后获一株编号为Mk-6高效吸磷的细菌菌株(附图2)。
[0023] 对Mk-6菌株进行形态学、生理生化和16S r DNA序列鉴定。
[0024] (三）结果 Mk-6菌株的形态特征：菌落圆形、黄色、边缘完齐、隆起、光滑、粘稠、湿润、半透明（附 图1);菌体呈短小杆状，革兰氏染色呈阴性，有鞭毛，无芽孢(附图2)。
[0025] Mk-6菌株的生理生化特征：Mk_6菌株淀粉水解、吲哚、硫化氢和L-精氨酸脱羧酶 试验均呈阳性，不能利用柠檬酸盐，不液化明胶，VP、甲基红、葡萄糖发酵、硝酸盐还原试验 均为阴性(表1);菌株生长温度范围为15 °C~40 °C，最适生长温度为25 °C~28 °C，适宜 生长 pH 为 7. (T9. 0。
[0026] Mk-6菌株16S rDNA基因序列（附图3) :16S rDNA基因测序分析结果表明，其碱 基序列全长为1422 bp，运用在线Blast软件进行同源性分析，选取19株微杆菌属的菌株 构建系统发育树（附图4)。由图4显示，Mk-6菌株与解角质素微杆菌 左在进化树的同一支上，两菌株同源性最高达98%。结合菌株形态特征、生 理生化特征，鉴定该菌株为解角质素微杆菌
[0027] 表I Mk-6菌株的生理生化试验结果
【权利要求】
1. 解角质素微杆菌dicroAacieritt? 菌株，该菌株保藏在位 于中国典型培养物保藏中心（CCTCC)，保藏日期为2014年06月24日，保藏编号为：CCTCC N0:M 2014279,保藏地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心。
2. 权利要求1所述的解角质素微杆菌Mk-6菌株的培养方法，其特征在于该方法包括以 下的步骤：取保存于_20°C的甘油的解角质素微杆菌Mk-6菌株20 μ L涂布于牛肉膏蛋白 胨固体培养基的平板上，28 °C培养24 h后挑单菌落于0.3 mL无菌水混匀，取100 μ L涂 布于牛肉膏蛋白胨固体培养基的平板上，用打孔器取2孔接到15 mL牛肉膏蛋白胨液体培 养基中，置于28 °C，170 r/min摇床中培养24 h用作种子液。
3. 权利要求1所述的解角质素微杆菌Mk-6菌株用于除磷。
4. 权利要求1所述的解角质素微杆菌Mk-6菌株用于城市污水处理厂的生物除磷。
【文档编号】C02F3/34GK104277996SQ201410348045
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2014年7月21日 优先权日:2014年7月21日
【发明者】蒋冬花, 谢祥聪, 胡优, 李晓倩 申请人:浙江师范大学