一种糖胺聚糖裂解酶及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种糖胺聚糖裂解酶及其编码基因与应用，属于生物技术技术领域。
【背景技术】
[0002] 糖胺聚糖（Glycosaminoglycan, GAG)是广泛存在与动物结缔组织中的一类多 糖。GAG属于直链多糖，由氨基己糖和糖醛酸及其它们异构化或硫酸化残基以双糖单位重 复构成，其结构通式为[己糖醛酸-己糖胺] n，重复双糖结构的个数（n)随种类而异，一 般在30和250之间。GAG根据其单糖组成及糖苷键连接形式的不同，可分为硫酸软骨素 (chondroitin sulfate，CS)、硫酸皮肤素（dermatan sulfate，DS)、硫酸角质素（kermatan sulfate，KS)、透明质酸（hyaluronic acid，HA)、肝素（heparin，HP)及硫酸乙酰肝素 (heparin sulfate，HS)等类别。其中HA广泛存在于动物结缔组织的细胞外基质中，在 胚胎、滑液、玻璃体等组织中尤为丰富，起到润滑、防震和增稠剂的作用。CS常以蛋白聚糖 聚集体形式存在于动物鼻骨、喉骨、软骨等组织中（Lauder RM，Chondroitin sulphate:A complex molecule with potential impacts on a wide range of biological systems. Complementary therapies in medicine，2009, 17:56-62.)，具有治疗风湿病、关节炎、骨质 疏松症等多种药理学活性。HP主要存在于肺、肝、皮肤和其它结缔组织的肥大细胞中，是一 种天然的抗凝剂，临床上用作抗凝血酶的增强剂。
[0003] 大量研宄表明，GAG糖链的长度，单糖残基和硫酸根基团的排列形式决定了糖链与 各类蛋白因子结合的能力，进而影响其所在蛋白聚糖的生物学活性。其中，由于低分子量 的GAG具有粘度小、溶解性好、易吸收等特点，相对于普通的GAG，有着更高的生物活性。因 此，低分子量GAG制备工艺的研宄是当前的一个热点话题。低分子量GAG的制备（Higashi K，et al. Photochemical preparation of a novel low molecyLar weight heparin. Carbohydrate Polymer，2012,87:1737-1743.)通常包括化学解聚法、物理解聚法、生物解 聚法、化学酶法合成等方法。其中生物解聚法主要是指酶裂解法，因其具有反应效率高、污 染小、成本低等优点，具有广阔的应用前景（Akio Hamai，et al. Two Distinct Chondroitin S y Lfate ABC Lyases. J. Biol. Chem. 1997, 272:9123-9130.)〇
[0004] 糖胺聚糖裂解酶是一类主要存在于微生物体内，能将硫酸皮肤素、硫酸软 骨素、透明质酸等糖胺聚糖裂解为寡糖及不饱和二糖的裂解酶（Stern R，Jedrzejas MJ. Hyaluronidases ：their genomics structure, and mechanisms of action. Chemical Reviews，2006, 106 :818-839.)。根据其底物特异性的不同，可以分为透明质酸酶 (hyaluronidase，HAase)、硫酸软骨素酶（chondroitin sy Lfate lyase，ChSase)、肝素 裂解酶（heparin lyase)等。其中微生物来源的HAase通过作用于0-1，4糖苷键来降 解HA，终产物是不饱和寡糖（Xueping Guo，et al. A Novel Hyaluronidase Produced by Bacillus sp.A50.PLoS One. 2014, 9:94156)。此外还可在一定程度上催化作用于CS。 ChSase能将CS裂解为不饱和二糖及寡糖，根据其作用底物的差异主要分为ChSase ABC、 ChSase AC、ChSase B及ChSase C等多种类型。肝素酶主要从一些利用肝素为碳源的细菌 中分离得到，肝素黄杆菌是商品肝素酶的唯一来源。已从肝素黄杆菌中分离纯化出的肝素 酶有三种，分别为肝素酶I、II、III，这三种酶具有不同的酶切识别位点。针对糖胺聚糖裂 解酶的开发已成为目前的研宄热点。
【发明内容】
[0005] 本发明针对现有技术的不足，提供了一种糖胺聚糖裂解酶及其编码基因与应用。 本发明还构建了该核酸分子的重组表达载体以及表达该重组蛋白的宿主细胞。
[0006] 本发明技术方案如下：
[0007] -种糖胺聚糖裂解酶的编码基因ssgaglyase，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0008] 一种糖胺聚糖裂解酶SSGAGlyase，氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0009] 一种重组载体，在质粒上插入了含有上述糖胺聚糖裂解酶的编码基因 ssgaglyase〇
[0010] 根据本发明优选的，所述的质粒为pET28a(+)质粒。
[0011] 一种重组细胞，将上述重组载体转化入宿主细胞中获得。
[0012] 根据本发明优选的，所述的宿主细胞为细菌、酵母或丝状真菌。
[0013] 进一步优选的，所述的宿主细胞为大肠杆菌。最优的，所述的宿主细胞为大肠杆菌 BL21(DE3) 〇
[0014] 上述糖胺聚糖裂解酶SSGAGlyase在生产低分子量糖胺聚糖中的应用。
[0015] 根据本发明优选的，所述的低分子量糖胺聚糖为硫酸软骨素和/或透明质酸。
[0016] 有益效果
[0017] 本发明所述的糖胺聚糖裂解酶SSGAGlyase能够选择性降解CS、HA、DS，且有较高 的酶解活性，最终降解产物均为二糖，不能降解HP和HS。为系统的研宄新型糖胺聚糖裂解 酶提供参考，为糖胺聚糖的后续研宄开发奠定了基础。
【附图说明】
[0018] 图1、设计简并引物克隆部分基因序列的电泳结果照片；
[0019] 图中：M为marker ;1、2、3出现非特异性条带；4、5出现明亮的单一条带，为正确克 隆的产物；
[0020] 图2、目的基因克隆电泳结果照片；
[0021] 图中：M、IW为marker ;1、2、3、4、5、6为正确克隆的产物；
[0022] 图3、重组蛋白的表达纯化的结果照片；
[0023] 图中：M为marker ;1为菌液上清，2为含空白质粒的对照菌液上清；3为菌体沉淀； 4、5、6、7为纯化得到的蛋白溶液；
[0024] 图4A、实验组吸光度随反应时间的变化曲线；
[0025] 图4B、对照组吸光度随反应时间的变化曲线；
[0026] 图5A、重组蛋白酶解CS的产物分析图谱；
[0027] 图5B、重组蛋白酶解HA的产物分析图谱；
[0028] 图6、重组质粒pET28a(+)-His_SSGAGlyase物理构建图谱。
【具体实施方式】
[0029] 下面结合实施例及说明书附图，对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所 保护范围不限于此。
[0030] 发明人从土壤中筛选出一株产糖胺聚糖裂解酶菌株，通过对其形态分析和 16SrRNA基因序列的比对，鉴定该菌株属于节杆菌属（Arthrobacter sp.)，并命名为 SSAs-l〇
[0031] 实施例1全新糖胺聚糖裂解酶编码基因的克隆
[0032] 1、扩增模板的制备
[0033]使用Bacterial DNA Kit试剂盒（购自OMEGA Bio-tek公司）提取菌株SSAs-1 的全基因组，作为PCR扩增全新GAG裂解酶编码基因的模板。
[0034] 2、简并引物的设计
[0035] 通过与同源关系较近已知的糖胺聚糖裂解酶氨基酸序列的比对，确定GNWWSWEIG 和WYECGNGENN为该类糖胺聚糖裂解酶家族保守序列，并据此设计PCR简并引物，引物序列 如下：
[0036]上游引物 JP-L1 :5'-GGCAACTGGTGGTCMTGGGAG-3'；
[0037]下游引物 JP-L2:5 ' -CCAACAARAGCGGYAACGGCGT-3 '。
[0038] 3.扩增部分目的基因
[0039] 使用Taq酶（购自Thermo Scientific公司）扩增目的基因，PCR扩增程序如下：
[0040] 95°C 预变性 10min ;95°C 变性 lmin，50°C 退火 lmin，72°C 延伸 2min，循环 30 次； 72°C延伸 10min ;
[0041] PCR扩增体系如下：
[0042] DNA 模板（100ng/ y L)，1 y L ; JP-L1 (20 y M)，1 y L ; JP-L2 (20 y M)，1 y L ; dNTPs(10mM)，l yL ;Taq(2U/yL)，l yL ;10XTaq buffer，5yL ;ddH20，加至 50yL。
[0043] PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，结果如图1所示。
[0044] 将电泳回收的PCR扩增产物经DNA序列检测，该序列长度为879bp。
[0045] 4、应用DNA walking技术克隆剩余基因序列（参见Yao-Guang Liu，et al. High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences.BioTechniques，2007,44:649 - 656)，利用 SEQ ID NO. 1 所 示核苷酸序列，设计DNA walking引物，DNA walking引物序列如下：
[0046] Dff-Ll ：TTGGCGATCAGGTCCGGGCTG
[0047] DW-L2 ：GCTGAAGGAACTCGCCGCTTC
[0048] 使用Genome walking Kit (购自TAKARA BIO INC?公司）试剂盒，扩增编码糖胺 聚糖裂解酶的未知基因片段并测序确定DNA序列，预测编码目标基因的起始密码子（ATG) 和终止密码子（TAG)，从而确定目标基因序列的长度为2370bp。
[0049] 5、根据DNA walking实验结果设计目的基因上下游引物，
[0050] SS-L1 ：ATGACGCGTGAACTTTCCCGAC
[0051] SS-L2 ：CTAGCGGTGCAGCGTGACCTC
[0052] 并以全基因组为模板PCR扩增全部目的基因。测序得到目的基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1所示，并验证了目标基因序列的长度为2370bp。
[0053