棉花GhEDR2基因及其编码蛋白与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物基因克隆和功能分析，属于植物基因工程领域，具体是一种棉花GhEDR2基因及其编码蛋白与应用，其用于通过植物基因工程技术改善植物抗病性。
【背景技术】
[0002]棉花是在我国国民经济中占有重要地位的经济作物。棉花黄萎病是世界范围内的病害之一，严重制约着棉花产业的稳步发展。近年来，棉花黄萎病的发生面积呈加重的趋势，发病面积占棉花总面积的50%左右。棉花黄萎病是由大丽轮枝菌侵染引起的真菌性维管束系统病害，属于土传病害。棉花黄萎病菌的寄主范围非常广泛，包括棉花、番茄、亚麻、马铃薯和茄子等两百多种植物，就是在没有合适寄主存在的恶劣条件下黄萎病菌也可以以微菌核在土壤中存活十年以上。目前各种棉花黄萎病防治措施，因此包括物理防治、化学防治、生物防治等方法很难对棉花起到防治效果，所以选育和利用抗黄萎病品种是解决这一难题最经济有效的途径。虽然我国在抗枯萎病育种方面已取得显著成效，然而由于缺乏黄萎病抗源，棉花抗黄萎病育种的进展缓慢。
[0003]EDR(Enhanced Disease Resistance) 2是从拟南芥edr突变体中克隆出的具有抗病性的基因。拟南芥EDR2包括一个PH区，一个START区和一个DUF1336区。其中，pH区由主要负责与脂结合协助膜定位，START区在脂运输和代谢以及细胞信号中起作用；DUF1336区是植物特有的结构域。EDR2的同源蛋白EDRl和EDR3在拟南芥中非常保守，它们介导的抗性都需要水杨酸(SA)的信号通路，而不需要茉莉酸(JA)和乙烯(ET)，其介导的抗性具有广谱性，在农业生产上具有重要的应用价值。
[0004]随着生物技术的发展，利用基因工程方法，将抗病基因直接导入棉花，创制抗黄萎病的种质材料，为我们提供了解决这一难题的有效方法。因此当今棉花抗病育种中，了解棉花的抗病机制和挖掘抗逆优异基因资源，创制育种新材料已经成为当下棉花分子育种的主要任务。克隆、分离和研宄抗黄萎病相关的基因，分析不同基因的表达、调控机制为改良棉花品种提供物质基础和理论依据。
【发明内容】
[0005]本发明为了弥补目前棉花品种在抗黄萎病方面存在的缺陷，提供了一种棉花GhEDR2基因及其编码蛋白与应用。
[0006]本发明是通过以下技术方案实现的:棉花GhEDR2基因，是如SEQ ID N0.1所示的碱基序列；或在SEQ ID N0.1所示的碱基序列基础上进行一个或多个碱基的替换、缺失或/和插入的喊基序列变体，且该喊基序列变体所编码的蛋白仍具有GhEDR2编码蛋白的功能或活性。
[0007]SEQ ID N0.1所示的碱基序列或者在严格条件下与其杂交且编码得到的仍具有GhEDR2编码蛋白的功能或活性的DNA分子也属于本发明的保护范围。所述SEQ ID N0.1所示的碱基序列是利用NCBI数据库中的基因序列，查找与拟南芥抗病基因cDNA同源的棉花EST片段，将部分重叠且高度同源的棉花EST进行序列拼装，组合成完整ORF的cDNA序列，根据这些序列设计特异性的PCR引物，采用RT-PCR的方法，获得GhEDR2基因。
[0008]本发明的目的之二是提供一种棉花GhEDR2基因编码蛋白，是如(a)或(b)所示的蛋白:
[0009](a) SEQ ID N0.2 所示的蛋白质；
[0010](b)将SEQ ID N0.2所示的蛋白质通过一个或多个氨基酸的替换、缺失或/和插入而衍生得到的仍具有GhEDR2基因功能或活性的蛋白变体。
[0011]SEQ ID N0.1是从棉花叶片中克隆出的棉花基因，命名为GhEDR2，开放阅读框2449bp，编码由816个氨基酸组成的蛋白质，如SEQ ID N0.2所示。
[0012]另外，本发明提供了棉花GhEDR2基因在提高植物对黄萎病抗性中的应用。
[0013]含有棉花GhEDR2基因的重组载体或重组菌或转基因细胞系也属于本发明的保护范围。
[0014]进一步，含有棉花GhEDR2基因的重组载体是在pIPlOl的多克隆位点插入权利要求I所述的编码基因得到的重组载体。
[0015]本发明还提供了一种培育对黄萎病抗性的转基因植物的方法，将含有棉花GhEDR2基因的导入到植物中，培育筛选得到对黄萎病抗性提高的转基因植物。所述的植物为双子叶植物和单子叶植物，如拟南芥、棉花和玉米。
[0016]本发明根据同源基因序列的相对保守性，查找与拟南芥抗病基因cDNA同源的棉花EST片段，将部分重叠且高度同源的棉花EST进行序列拼装，组合成完整ORF的cDNA序列，根据这些序列设计特异性的PCR引物，采用RT-PCR的方法，获得GhEDR2基因。利用qPCR分析发现该基因在棉花植株中的表达呈现了组织特异性的特点。而且转基因植物黄萎病的发病率明显低于非转基因植物。因此利用本发明所述的GhEDR2基因来培育抗黄萎病植物，在植物抗病育种中将会有广阔的前景。
【附图说明】
[0017]图1为GhEDR2基因在棉花不同器官中的表达量分析。
[0018]图2为黄萎病病原菌处理棉花后不同时间GhEDR2基因表达。
[0019]图3为GhEDR2基因过量表达载体的构建。
[0020]图4为GhEDR2蛋白的亚细胞定位。
[0021]图5为转GhEDR2基因拟南芥的PCR电泳图。
[0022]图6为接种15天后转GhEDR2基因拟南芥株系的病指调查，WT为野生型植株；PX1-PX5为的转基因株系。
[0023]图7为接种20天后转GhEDR2基因拟南芥株系的病指调查，WT为野生型植株；PX1-PX5为的转基因株系。
【具体实施方式】
[0024]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
[0025]下述所有基因操作方法均参照《分子克隆》(Sambrook J等人，1989)所述进行；有关试剂盒使用参照所购试剂盒的应用说明；所用限制性内切酶和其它工具酶均购自NEB公司。
[0026]棉花材料为抗病棉花品种豫棉21，由山西省农业科学院棉花研宄所品种资源室提供。拟南芥为哥伦比亚生态型、烟草品种为SR1，由中国科学院微生物所吴家和研宄员提供，根瘤农杆菌菌株GV3103本实验室保存。克隆载体pMD18-T Simple Vector、中间载体pDNOR、大肠杆菌DH5a、反转录试剂盒、Real time RT-PCR试剂盒、以及SYBR Premix ExTaq均购自TaKaRa公司，DNA纯化试剂盒、质粒DNA快速抽提试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒购自上海生工有限公司。所用引物合成及测序均由上海生工生物技术服务有限公司完成。
[0027]一、棉花GhEDR2基因的克隆及序列分析
[0028]1.总RNA的提取
[0029]将棉花抗病品种豫棉21种植在花盆中，待棉花幼苗子叶完全伸展时，取棉花叶片按照TaKaRa公司RNA提取试剂盒说明提取总RNA。使用TaKaRa公司的PrimerScript?反转录酶进行cDNA合成。
[0030]2.GhEDR2基因的分离
[0031]根据同源基因序列的相对保守性，用拟南芥EDR2基因的碱基序列，用tblastn程序在GenBank的棉花ESTs数据库中进行比对，将比对后的ESTs按照同源性高低进行排序，并选择匹配分值高、E值低的序列。根据获得的具有完整编码区的同源基因序列，采用PrierPremier 5.0设计引物进行PCR扩增。
[0032]GhEDR2 F GCTCACAATCAAAATCATAATCAA
[0033]GhEDR2 R CAGGGAAGATGTGAAAAACG
[0034]PCR扩增体系:反应总体积为40 ( μ L)的体系，模板2，Ρ1/Ρ2 2/2，DNTP3，BUFFER4，TAQ 0.4，水 26.6。PCR 反应条件为:95°C预变性 7min ;95°C变性 30s，52°C退火 30s，72°C延伸180s，变性、退火、延伸35个循环后，72°C再延伸10min，4°C保温。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。PCR产物的目的DNA条带用干净解剖刀从琼脂糖胶中切下放在
1.5mL的离心管中，然后用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化回收目的片段。纯化回收完成后，取5yL进行电泳检测。
[0035]3.PCR产物的连接
[0036]根据Takara pMD18_T Vector 的说明书，将回收的 GhEDR2 片段和 pMD18_T Vector于冰上融化后短暂离心，在1.5mL的离心管中建立如下反应体系:回收产物(GhEDR2片段)5yL，连接Mix 4.5yL, pMD18_T Vector 0.5 μ L，总体积10 μ L。所有产物加好后，用移液器轻轻混匀，16 °C过夜连接。
[0037]4.连接产物的转化
[0038]_70°C冰箱中取出一管感受态细胞置于冰浴中，向感受态细胞悬液中加入目的DNA5 μ L，轻轻旋转离心管以混匀内容物，在冰浴中静置30分钟，将离心管置于42°C水浴中放置90秒，然后快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2-3分钟。向每个离心管中加入900 μ L无菌的LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于37 °C摇床震荡培养45分钟(150转/分钟)，目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。将离心管内容物混匀，吸取100 μ L已转化的感受态细胞加到75 μ MAmp+的LB固体琼脂培养基上，用无菌的弯头玻棒轻轻的将细胞均匀涂开。再将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37°C培养12-16小时。
[0039]5.重组质粒的PCR鉴定
[0040]分别挑选8个白斑接种到8个含有Amp+抗性的LB液体培养基的1.5mL的离心管中，置于37°C摇床震荡培养5小时后，以这些菌液为模板进行PCR检测，然后电泳检测PCR产物，分别选取与目的片段大小一致的克隆测序，DNA测序由上海生工生物技术服务有限公司完成。
[0041]二、棉花GhEDR2基因在不同组织及黄萎病诱导下基因的表达分析
[0042]1.样品的采集和处理设置
[0043]将抗病棉花品种豫棉21种子脱绒后种植在花盆中，供试土壤为蛭石。子叶长出后定苗，每盆留苗3棵。培养条件为昼夜温度分别为28°C、20°C，每天光照16h，黑暗8h，培养至两周出现2片真叶完全展开时，进行黄萎病病原菌接种。采用蘸根法接种大丽轮枝菌V991，孢子浓度为1.0X107mL_1，分别于接种后12、24、36、48、72和96h取棉株幼根，同时取未接种黄萎病菌的棉株幼根作为对照，经液氮冷冻后，保存于一 80V冰箱。
[0044]2.Quantitative Real-time RT-PCR 方法
[0045]利用Quantitative Real-time RT_PCR(qRT_PCR)方法，检测 GhEDR2 在棉花根、茎、叶中的表达情况及其黄萎病诱导后的不同时段的表达情况，GhEDR2扩增的一对引物为 GhEDR2-F:5，-ATGGTTTCAAGGGCAGGAT-3，；GhEDR2_R:5，-AATGCCAGGGAGGAAGGT-3，。以棉花ubiquitin基因(登录号:AY189972)作为内标基因，扩增一对引物为Ub1-F