] 其中，全基因组提取按照质粒提取试剂盒Bacterial DNA Kit(购自OMEGA Bio-tek公司）说明书操作。
[0054] DNA walking技术克隆未知基因序列按照Genome walking Kit (购自TAKARA BIO INC.公司）说明书操作。
[0055] 实施例2重组表达载体的构建
[0056] 1、PCR扩增两端分别带有Xho I和Sal I酶切位点的目的基因。设计引物序列如 下：
[0057] SSGAGlyase-Ll：
[0058] 5'AGCAAATGGGTCGCGGATCCACGCGTGAACTTTCCCGACGACACATCCTC 3'；
[0059] SSGAGlyasel-L2：
[0060] 5 ' GCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTGTCGACCTAGCGGTGCAGCGTGACCTC 3 '。
[0061] 以菌株SSAs-1全基因组为模板，使用Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (购自New England Biolabs公司）扩增目的基因，得到带有Xho I和 SalI(详见引物SSGAGlyase-Ll/L2序列中下标横线位置）酶切位点的目的基因 ssgaglyase (电泳结果如图2所示）。
[0062] 2、限制性内切酶Xho I和Sal I (购自Thermo Scientific公司）双酶切 pET28a(+)质粒。
[0063] 100 y L 反应体系：pET28a(+)质粒，50 y L ;Xho I，5 y L ;Sal I，5 y L ;Buffer， 10 y L ;H20,30 y L。
[0064] 37°C水浴lh，制得双酶切的pET28a质粒。
[0065] 3、将目的基因和双酶切的pET28a质粒通过Gibson连接（Gibson, D. G.，et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat. Methods，2009,6 :343 - 345.)构建重组质粒。
[0066] 20 y L 反应体系：Gibson 连接液（5 X isothermal reaction buffer，320 y L ; 10U/ y L T5Exonuclease, 0. 64 y L ；2U/ y L Phusion DNA polymerase 20yL；40U/ y L Taq DNA ligase，160 y L ;ddH20 459. 36 y L ;total 960 y L) 12 y L ;双酶切 pET28a(+)质粒，3 y L ;目 的基因，3 yL ;H20,2 yL。
[0067] 50°C水浴lh，制得连接反应液。
[0068] 4、连接反应液直接转化大肠杆菌DH5a感受态细胞（购自北京天根生化科技 有限公司），在含有50 yg/mL氨苄青霉素的LB培养基中筛选转化子，未被转化的细胞 不能在该平板上生长。挑取单个克隆的转化子，用质粒提取试剂盒Plasmid Mini Kit I (购自OMEGA Bio-tek公司）提取转化子细胞中的质粒。电泳检测经SalI线性化的 各个转化子质粒，其中大小约为7500bp的质粒为连接成功的重组质粒。经DNA测序， 将含有DNA序列完全正确的目标酶分子基因片段的重组载体命名为该重组质粒命名为 pET28a(+)_His_ssgaglyase (重组质粒物理图谱见图6)。
[0069]其中目的基因扩增按照 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (购自 New England Biolabs公司）说明书操作
[0070] 其中大肠杆菌转化按照DH5a感受态细胞（购自北京天根生化科技有限公司）说 明书操作。
[0071] 其中，质粒提取按照质粒提取试剂盒Plasmid Mini Kit I(购自OMEGA Bio-tek 公司）说明书操作。
[0072] 实施例3重组蛋白的表达和纯化
[0073] 将重组质粒pET28a(+)-His-ssgaglyase转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞 (购自北京天根生化科技有限公司）中，在氨苄青霉素钠（50yg/mL)的LB平板上培养12h， 筛选转化子，挑选转化子单菌落进行菌落PCR验证，获得阳性转化子。
[0074] 挑选阳性转化子，过夜培养后，按体积比1:100接入含有50 y g/mL氨苄青霉素钠 的液体LB培养基中，37°C，225r/min震荡培养至0D6QQ约为0. 6-0. 8 (约4h)，加入IPTG (终 浓度0.2禮/1)，20°0,2251'/111111，诱导1211。800(^离心收集菌体并用上样缓冲液（20臟〇1 Tris-Hcl，PH = 7. 6 ;0? 5mol NaCl ;5mmol咪挫）重悬，超声破碎（工作3s，间歇5s，振幅 35%，能量 1500KJ，4°C ) 30min，将破碎菌体离心（12000g，4°C ) 30min，上清用 0? 22um 滤膜 过滤。上样到Ni-Sepharose 6 Fast Flow(购自GE healthcare)柱中纯化，通过聚丙稀酰 胺凝胶电泳对诱导后重组蛋白的表达情况进行鉴定（如图3所示）。
[0075] 其中大肠杆菌转化按照BL21感受态细胞（购自北京天根生化科技有限公司）说 明书操作。
[0076] 其中目的蛋白纯化步骤按照GE healthcare手册中亲和色谱方法纯化。
[0077] 实施例4重组蛋白活性的验证
[0078] 以0.1% CS溶液（0. 02mol/L Tris-HCL配制，pH7. 5)为底物，使用紫外分光光度 计（安捷伦Cary60)通过酶动力学检测重组蛋白SSGAGlyase对糖胺聚糖的裂解活性，观察 波长232nm处吸光度随着反应时间的变化。本方法主要依据CS经酶解后形成不饱和二糖 结构，其最大吸收波长为232nm。
[0079] 设定紫外分光光度计检测波长232nm。取2mL0.1 % CS溶液作为实验组加入到紫 外分光光度计的石英比色皿中，静置lmin。向比色皿中加入0.0 lmg纯化后蛋白，迅速混匀， 检测A232随反应时间的变化。
[0080] 取0.0 lmg纯化蛋白煮沸3min灭活，13000g离心lmin，取上清在相同条件下做对 照组实验（如图4所示）。实验结果表明，重组表达并纯化的蛋白具有降解CS的活性，并且 降解效率高，活性明显。
[0081] 实施例5重组蛋白的性质研宄
[0082] 1、酶最适反应pH
[0083] 用0?02mol/L Tris-HCl缓冲液配制不同pH值的CS溶液，使反应缓冲体系的pH 分别为 4. 5, 5. 0, 5. 5,6. 0,6. 5, 7. 0, 7. 5,8. 0,8. 5,9. 0,9. 5,10. 0,10. 5。加入相同量的酶液， 测定不同pH条件下的酶活力。结果表明，该酶反应的最适pH值为6. 0-7. 0。
[0084] 2、酶最适反应温度
[0085]分别在15。〇，25。〇，30。〇，33。〇，37。〇，40。〇，45。〇，50。〇，55。〇下，在21^0.1%〇5溶 液（0.02mol/L Tris-HCL配制，pH7.5)中加入O.Olmg酶，测定酶活力。结果表明，酶反应 最适的温度为37-45 °C。
[0086] 3、酶的稳定性研宄
[0087] 取部分酶液在37°C放置，持续测定酶活力。结果表明，酶液在25h后失活。
[0088]将一定量的酶液在60 °C，70 °C，80 °C，90 °C，100 °C的条件下分别加热lmin，2min， 3min后，测定各组酶液的酶活，摸索最佳的酶的灭活条件。结果表明，酶液在70°C条件下加 热3min后失活。
[0089] 实施例6重组蛋白底物特异性测定与产物二糖机构分析
[0090] 分别取 2mL 0? 1 % HA 溶液，2mL 0? 1 % CS 溶液，2mL 0? 1 % HP 溶液，2mL 0? 1 % DS 溶液（均采用〇? 〇2mol/L Tris-HCL配制，pH7. 5)，各加入0? Olmg纯化后重组蛋白，37°C水 浴反应lh。反应结束后，煮沸3min灭活，13000g离心lmin，取上清通过P2分子筛（购自 BIO-RAD)分离纯化。
[0091] 降解产物分离结果表明，该酶可以降解透明质酸，硫酸软骨素，硫酸皮肤素，纯化 后产物通过质谱分析检测分子量，发现终产物均为二糖（如图5所示）。
[0092] 其中P2分子筛分离纯化按照Bio-Gel Polyacrylamide Gel(购自BI0-RAD)说明 书操作。
【主权项】
1. 一种糖胺聚糖裂解酶的编码基因 ssgaglyase，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. -种糖胺聚糖裂解酶SSGAGlyase，氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3. -种重组载体，在质粒上插入了含有权利要求1所述糖胺聚糖裂解酶的编码基因 ssgaglyase〇
4. 如权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述的质粒为pET28a(+)质粒。
5. -种重组细胞，将权利要求3所述重组载体转化入宿主细胞中获得。
6. 如权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为细菌、酵母或丝状真 菌。
7. 如权利要求6所述的重组细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为大肠杆菌。最优的， 所述的宿主细胞为大肠杆菌BL21 (DE3)。
8. 权利要求2所述糖胺聚糖裂解酶SSGAGlyase在生产低分子量糖胺聚糖中的应用。
9. 如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的低分子量糖胺聚糖为硫酸软骨素和/ 或透明质酸。
【专利摘要】本发明涉及一种糖胺聚糖裂解酶及其编码基因与应用。糖胺聚糖裂解酶的编码基因ssgaglyase，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；糖胺聚糖裂解酶SSGAGlyase，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明所述的糖胺聚糖裂解酶SSGAGlyase能够选择性降解CS、HA、DS，且有较高的酶解活性，最终降解产物均为二糖，不能降解HP和HS。为系统的研究新型糖胺聚糖裂解酶提供参考，为糖胺聚糖的后续研究开发奠定了基础。
【IPC分类】C12N15-60, C12N9-88, C12P19-26
【公开号】CN104830881
【申请号】CN201510289566
【发明人】生举正, 王凤山, 尹风新, 薛佳俊
【申请人】山东大学
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2015年5月29日