本发明涉及用于生产微生物存储化合物(MSC)的方法，特别是利用累积微生物存储化合物的微生物生产聚羟基链烷酸酯(PHA)的方法。
背景技术：
已知在用于好氧废水处理的污泥中发现的一些微生物能够产生微生物存储化合物，例如诸如聚(羟基链烷酸酯)(PHA)或糖原作为储备化合物。人们对废水处理过程的兴趣日益增加，其中为了从这些细菌中回收这种PHA，例如用于作为生物塑料的应用，而使积聚PHA的细菌中的PHA的积聚达到最大。
用于选择能够产生PHA或其它微生物存储化合物的微生物的方法在本领域中是已知的，通常包括交替进行所谓的饱食阶段(feast phase)和所谓的饥饿阶段(famine phase)的几个周期，在饱食阶段中，用包含易生物降解的有机化合物(所谓的易生物降解的化学需氧量或RBCOD)的底物进料包含积聚PHA的细菌的污泥；在饥饿阶段中将底物从细菌中扣除(withheld)。在饱食阶段，积聚PHA的细菌将RBCOD(例如挥发性脂肪酸类(VFA))转化为PHA。在饥饿阶段，细菌中积聚的PHA被用作原料，从而能够选择那些能够积聚PHA或其它细菌存储化合物的细菌。
例如，WO00/52189公开了一种用于生产聚羟基链烷酸酯的方法，其中在第一步骤中通过交替地使微生物经受加入底物的阶段(饱食阶段)和扣除底物的阶段(饥饿阶段)来选择能够积聚PHA的微生物。在积聚步骤中，通过使在第一步骤中选择的一些微生物经受底物(优选含脂肪酸的流)来积聚PHA。在WO00/52189的方法中，在第一反应器中进行具有交替饱食阶段和饥饿阶段的选择步骤，在单独的第二反应器中进行积聚步骤。
WO2011/073744也公开了一种通过交替使生物质经受饱食和饥饿条件而能够产生PHA的丝状微生物(生物质)的选择方法。在WO2011/073744的方法中，饱食和饥饿条件可以在同一反应器中顺序应用或在单独的反应器中应用。从选择过程中取出的污泥(生物质)可以用于在单独的步骤中进一步积聚或用于提取PHA。
WO2012/023114、WO2014/108864和WO2014/108878描述了类似的方法。在所有这些方法中，任何积聚步骤都在单独的反应器中进行。在WO2014/108878的方法中，原料中的氮与RBCOD的比率和/或磷与RBCOD的比率受到控制。
WO2013/022874公开了一种利用曝气池中回流污泥的生产PHA的方法，使得在同一曝气池中提供饥饿-饱食方案(regime)。回流污泥可在回流反应器中进行处理，在回流反应器中应用相对低的原料/生物质比率。没有披露或暗示积聚。
Serafim等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.81(2008)615-628和Bengtsson等人，Bioresource Technology 99(2008)509-516公开了在序批式反应器(sequencing batch reactor)或连续式反应器中利用混合培养物生产PHA的方法，其中可以在单个(选择)反应器中进行饱食和饥饿周期。在现有技术的方法中，为了生长富含在能够积聚PHA的生物体中的生物质的目的，采用饱食和饥饿方案以及过量的营养物来进行对积聚PHA的生物体的选择。所获得的富集的生物质中的PHA的最终积聚将在单独的积聚步骤中进行以达到污泥中最大的PHA含量。
US 2009/0317879公开了一种通过交替进行产生PHA的微生物的营养物剥夺(饱食)阶段和碳原料剥夺(饥饿)阶段的PHA生物合成的方法。然而，根据US‘879长成的微生物的PHA含量似乎相当低(“通常高于20％”)，并且碳供应和营养物供应以绝对方式控制：在第一周期阶段不存在营养物，在第二周期阶段不存在碳源。这意味着积聚阶段和生长阶段完全分离，阻碍连续操作。US‘879中对如何控制碳供应和营养物供应以及停留时间以达到PHA的有效水平和高效简化的工艺管理未提供任何进一步的指导。
技术实现要素：
已经发现，可以改进和整合用于选择能够产生微生物存储化合物(MSC)的微生物并且进一步在选定的微生物中积聚这种MSC的方法。通过控制生长必需的元素的水平和提供生长必需的元素的增强存在的时期和减少存在的时期以及管理污泥停留时间，在选择方法中实现了基于污泥中有机物含量的高达80重量％或更高的PHA水平而不需要额外的积聚步骤。
除了通过删除积聚步骤简化了从含有RBCOD的废水生产PHA的整个过程之外，还在两点上改善了选择。首先，新方法选择了能够达到非常高的细胞间PHA含量的积聚PHA的生物体，而现有技术选择方法选择了快速的RBCOD摄取，但不一定是积聚后达到最高PHA水平的能力。其次，应用同时有限的RBCOD和营养物的存在与短的污泥停留时间的组合使得所产生的生物质中其它非积聚PHA的生物体的存在最小化。这导致产生的污泥中总PHA含量更高，这提高了RBCOD上PHA的产率并降低了PHA纯化的成本。
附图说明
图1和图2分别示意性地示出了用于实施本发明的方法的单反应器系统和双反应器系统。
图3示出了工艺周期期间的溶解氧。
图4和5分别示出了单反应器系统和双反应器系统过程期间的PHA水平。
具体实施方式
根据本发明的方法是用于生产微生物存储化合物(MSC)(特别是聚羟基链烷酸酯(PHA))的方法。在该方法中，将包含有机化合物的废水流供应给含有活性污泥的反应器，所述有机化合物包括易生物降解的化学需氧量(RBCOD)和可能还有其它(＝不太容易)生物降解的化学需氧量(OBCOD)，活性污泥包含能够积聚所需的微生物存储化合物的生物体。该方法在一个或多个反应器中进行，特别是在单个反应器中或在两个连续的反应器中进行。
更特别地，本方法包括以下步骤：
a)在第一反应器(其可以是唯一的反应器)中向第一反应器阶段供应废水流，并且在第一时间段期间在积聚MSC的条件下使废水与活性污泥接触，以获得包含MSC的装载有MSC的活性污泥和经过处理的废水，积聚MSC的条件包括存在溶解氧；
b)提供在第一反应器阶段即在步骤a)中获得的至少部分装载有MSC的活性污泥和至少部分经过处理的废水变得存在于第一(相同)反应器的第二反应器阶段中或第二反应器中；
c)向第二反应器阶段供应生长必需的元素，并在第二时间段期间在生长条件下使废水与活性污泥接触，生长条件包括存在溶解氧，其中与步骤a)中供应的RBCOD的量相比，至少一种所述必需元素的供应量将生长限制在不是所有的MSC都用于生长的程度，以获得包含残余的MSC的长成的(grown)活性污泥；
d)提供在第二反应器阶段即在步骤c)中产生的至少部分长成的活性污泥变得存在于第一反应器阶段中；
e)在步骤a)期间或之后，从第一反应器阶段(即从第一反应器中)中除去部分经过处理的废水和/或在步骤c)期间或之后，从第二反应器阶段(即从第一反应器或第二反应器)中除去部分经过处理的废水，和在步骤a)期间或之后除去部分装载有MSC的活性污泥和/或在步骤c)期间或之后除去部分长成的活性污泥，在步骤a)期间或之后或在步骤c)期间或之后除去的活性污泥含有基于污泥有机部分的干重的至少50重量％、优选至少60重量％的水平的MSC，并且这些部分使得活性污泥在第一反应器和任选的第二反应器中的平均停留时间(SRT)总共少于72小时。
由于本过程是循环过程，因此步骤d)或e)之后是步骤a)等。
在本发明的上下文中，应用以下定义：
-“微生物存储化合物”是由微生物(例如细菌、古生菌、霉菌和藻类)产生的用于储存其剩余能量的化合物。这些化合物包括酯类、聚酯类、聚硫酯类、甘油三酯类、其它脂肪类和油类，以及多糖类(例如糖原)。由羟基-羧酸的分子间酯化作用产生的聚酯类是一类重要的微生物存储化合物，最突出的是聚羟基链烷酸酯类，特别是聚-β-羟基链烷酸酯类，例如具有下式的聚-β-羟基丁酸酯(PHB)和聚-β-羟基戊酸酯(PHV)以及它们的共聚物，其中n可以为数十到数百或甚至数千。
[-O-CH(CH3)-CH2-CO-]n,PHB
[-O-CH(C2H5)-CH2-CO-]n,PHV
聚羟基链烷酸酯类(或聚氧化链烷酸酯类)通常(本文)称为聚羟基链烷酸酯(PHA)。在下文中，MSC通常由PHA例证，而适用于PHA的情况也适用于其它MSC。
-“化学需氧量”(COD)是指可被氧化成更小分子、最终成为二氧化碳和水的有机物质，该术语表示氧化一升废水中的有机物质所需的氧气量。
-“可生物降解的COD”是指废水中的可被同化用于生物质生长的有机物质。
-“底物”是指用于被微生物同化以使其生长的底物，即等同于可生物降解的COD。
-“易生物降解的化学需氧量(RBCOD)”是指如下面进一步说明的可以被微生物快速同化的相对较小的有机分子。
-“其它可生物降解的化学需氧量(OBCOD)”是指除RBCOD以外的可生物降解的COD，即更复杂和不易得的有机化合物，例如复合多糖类、脂肪类和蛋白质类，以及具有相对较少含氧基团和较大的烃基基团的有机化合物，例如长链脂肪酸类。
-“废水”是指在被重新使用或排放到环境中之前需要被处理的包含COD的含水流。如下面进一步说明的，例如废水包括来自生物基工业或其它工业的工艺用水、副产物或中间产物流。
-“淤泥”是指存在于反应器或其流入物或流出物中的任何固体或固体样物质，其可以通过物理方式(例如过滤器、旋风分离器、沉降器、膜等)与反应器的液体部分(或流入物或流出物)分离。污泥可以包含有机部分以及无机部分，有机部分包括所有的生物材料以及不可溶或不可精细分散的有机化合物，无机部分包括不可溶或不可精细分散的盐和其它无机材料。因此，“干燥的有机污泥”包含固体材料，其中无机材料(盐、灰分)和水以及其它液体已经从固体材料中分离，或在计算产物水平时已被考虑在内。
-“反应器阶段”涉及在空间或时间上与另一个反应器内容物实体分离的反应器内容物实体。例如，其可以是与反应器的另一部分在物理上部分或完全分离(通过壁、窄化或另一个障碍)的反应器的隔室。其也可以是一个单独的反应器。此外，反应器阶段可以是其中的具有与在相同空间中反应器阶段之后或之前(在非连续过程中)的另一阶段不同的含量、组成或一组不同的条件的反应器。
-“积聚MSC的条件”(特别是积聚PHA的条件)是指允许MSC(PHA)积聚在细菌污泥中的条件，通常也称为饱食条件。这些包括存在RBCOD形式的底物和存在溶解氧。除非另有说明，否则溶解氧指溶解的分子氧。优选地，溶解氧的浓度为每升至少0.32mg O2，更优选至少每升0.5mg O2。积聚MSC的条件优选还包括在4至10的范围内、更优选在6至8的范围内的pH，在10至50℃的范围内、更优选在20至40℃的范围内的温度，和在0至20mS/cm的范围内的电导率。应注意的是，本文所用的积聚MSC的条件意味着相对促进MSC(PHA)的积聚，但不排除生长。
-“生长条件”是指允许细菌污泥(包括积聚MSC(积聚PHA)的微生物)生长(即种群增加)的条件，有时也称为饥饿条件。这些包括存在如本文进一步定义的生长必需的元素并允许由污泥摄取元素。生长条件还包括存在溶解氧，优选每升至少0.32mg O2，更优选至少每升0.5mg O2，优选包含在4至10的范围内、更优选在6至8的范围内的pH，在10至50℃的范围内、更优选在20至40℃的范围内的温度，和在0至20mS/cm的范围内的电导率。应注意的是，本文所用的生长条件意味着相对促进微生物的生长，但不排除积聚并且优选避免MSC(PHA)的完全分解。特别地，“积聚条件”和“生长条件”可能仅在RBCOD供应与生长必需的元素供应的比率上有所不同。
-“生长必需的元素”或“生长必需的营养物”包括除碳、氧和氢以外的细胞适当的生长所需要的常见元素。这些包括大量元素N、P、K和S，微量元素Mg、Ca、Fe和痕量元素如Mn、Mo、Zn、Co、Cu、Ni、B、Se、W、Cr以及维生素。虽然可以利用包括维生素在内的任何元素来控制生物体的生长，但可以有利地利用氮和磷。生长必需的元素可以以任何常规和合适的、优选水溶性的形式提供，例如，作为铵盐或尿素，磷酸盐，钾、镁、钙或铁盐(氯化物、硝酸盐、乙酸盐等)，硫酸盐、痕量金属盐、维生素或维生素盐等提供。
-“污泥停留时间”(SRT)是本方法的反应器系统中总污泥的平均停留时间。它可以通过污泥的部分分离和回收而区别于水力(液体)停留时间(HRT)。为此目的，SRT被定义为存在于第一反应器和任选的第二反应器中的污泥的时间平均量(千克干固体)的总和除以系统中产生并从系统中除去的固体的时间平均量(千克干固体/小时)。
本方法的一个重要特征是控制产生MSC的淤泥的积聚条件和生长条件。在步骤a)中，积聚条件优于生长条件。这可以通过以下条件实现：与RBCOD(即含碳原料)的供应相比，生长必需的元素的相对水平是低的。步骤c)允许由污泥摄取生长必需的元素，生长可能比在步骤a)中更占优势，但远低于所有MSC都用于生长的程度。
在本发明方法的步骤c)中供应的一种或多种必需元素的限制量使得微生物可以生长(积聚的MSC为生长将至少部分地提供碳、氢和氧源)，但生长不能导致所有的MSC都被消耗。确保不是所有的MSC都用于生长所供应的必需元素的量取决于限制性的特定元素。如果限制性元素包含氮，步骤c)中供应的氮连同步骤a)中由废水供应的溶解氮的量除以步骤a)中供应的RBCOD-碳的量(Nc/Ca)优选在1/12和1/100之间。如果限制性元素包含磷，则磷的量除以步骤a)中供应的RBCOD-碳的量(Pc/Ca)在1/60和1/500之间。对于其它必需元素，可以按照下面的描述计算相应的值。在这些计算中，元素是以元素为基础的，尽管它们通常以化合物(盐或其它)形式提供。
更优选地，比率Nc/Ca低于1/15，甚至更优选低于1/20，低至1/75。可选地，Pc/Ca更优选低于1/75，甚至更优选低于1/100，优选低至1/375。
如果限制性元素包含另一种元素，则其水平可由技术人员基于已知组成和细菌的元素需要来确定。例如，磷的限制水平可以比氮的限制水平低5倍，硫、钾、钙、镁、铁和痕量金属(例如Cu)的限制水平可以分别比氮水平低10倍(S、K)、30倍(Ca、Mg)、50倍(Fe)和300倍(痕量金属)。技术人员能够通过涉及不同水平的讨论的元素或维生素的适当常规实验来确定这些和其它元素和维生素的限制水平，他应选择这些中的一个水平以确保有限的生长。未在限制生长水平使用的必需元素通常已经以足够的量存在于废水中，或者如果需要可以供应，以实现非限制水平。常用的和可商购获得的元素混合物以所需的相对水平含有各种元素。
优选的是，与RBCOD的水平相比，废水中的至少一种生长元素(例如N或P)的水平是有限的。有利地，步骤a)中供应的废水具有低于1/15的氮的量与RBCOD-碳的量的重量比(Na/Ca)和/或低于1/75的磷的量与RBCOD-碳的量的重量比(Pa/Ca)。更优选地，Na/Ca低于1/20，甚至更优选低于1/25，直至非常低的水平，例如1/1000，优选低至1/500。可选地，Pa/Ca优选低于1/100，更优选低于1/125，低至例如1/5000，优选低至1/2500。如果未处理的废水具有超过这些比率的氮和/或磷的水平与RBCOD水平之比，则可以通过插入一个旨在降低相关元素与RBCOD的量的重量比的预处理步骤，通过部分地除去所述一种或多种生长必需的元素(特别是N或P)而将N/C或P/C水平降低至优选水平。例如，可以通过在步骤a)之前向废水中添加镁，从废水中除去沉淀的鸟粪石(磷酸铵镁)以除去磷酸盐(P)和氨(N)。可选地或另外，可以通过添加RBCOD来降低比率。
下表1给出了关于作为Nc/Ca或Pc/Ca的函数的可获得的PHA含量的更多指导。
表1：PHA含量与氮和磷的关系
采用常规已知的方法，包括比色法、色谱法、元件特异性电极法、滴定法、凯氏测氮法(氮气)等，通过在线或离线测定废水中的营养物水平以及碳水平(如果需要)，然后酌情添加一种或多种营养物或碳(RBCOD)，可以实现所需的营养物(氮、磷或其它)水平或所需的营养物与碳的比率。
如上所述，RBCOD是指相对简单的有机分子，其可以被同化用于微生物的生长并且可以被快速摄取并转化为存储化合物，通常不需要水解。这种RBCOD的示例包括挥发性脂肪酸类，也称为短链脂肪酸类，即具有至多6个碳原子，例如甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸和己酸，羟基酸类(例如乳酸)，碳水化合物类(例如单糖类和二糖类)，糖醛酸类，醇类，酮类和醛类，优选具有至多六个碳原子的醇类、酮类和醛类及其两种或更多种的组合。换句话说，RBCOD包括每分子具有至多6个碳原子并且每个分子具有至少一个羟基(C-OH)或酮基(C＝O)氧原子并且每四个碳原子具有至少一个氧原子的有机化合物，优选仅具有碳、氢和氧原子的有机化合物以及二糖类。RBCOD的浓度可以通过呼吸测量法的标准方法的方式来确定，呼吸测量法确定废水COD的分数，当将具有特定量的生物质的等分试样的废水与底物在受控条件下脉冲进料时，废水COD被快速利用。合适的呼吸测量法的标准化方法的示例在M.Henze等人，Activated Sludge Models ASM1,ASM2,ASM2d和ASM3,IWA Publishing,London,2000,第16至17页；ISBN 1900222248中进行了公开。
所述废水流可以是包含RBCOD的任何废水流。该流可以是市政、工业或农业废水或来自固体可生物降解的废物本身的工艺流或残余流，或者其可以是经过预处理(例如已经进行了预水解以将所谓的OBCOD转化为RBCOD，和/或已经进行预酸化或发酵以将糖类或其它化合物转化为羧酸(优选挥发性脂肪酸、乳酸或乙醇))的市政、工业或农业废水。
废水通常每升含有多于50mg、优选多于100mg的RBCOD。更优选地，废水包含在0.5至50克/升的范围内、更优选在1至20克/升的范围内的RBCOD。其优选包含挥发性(C1至C6)脂肪酸和/或乳酸和/或乙醇，更优选在0.5至50克/升的范围内的挥发性脂肪酸，甚至更优选在1至20克/升的范围内。
在步骤a)中供应至第一反应器阶段的废水还可以包含OBCOD。优选地，其含有比OBCOD更多的RBCOD。本发明方法涉及两个反应阶段之间的短周期时间、RBCOD和营养物的可用性的时间或地点的分离以及相对较短的SRT，本发明的优点在于微生物种群对于来自RBCOD的MSC的产生的高选择性，其它细菌种群被抑制使其对OBCOD消化相对不敏感，从而导致高的MSC产量。如果OBCOD的水平超过RBCOD水平的0.2倍，则优选在两个反应器中进行本方法。在这种布置中，有利的是在浓缩的污泥从第一反应器转移至第二反应器之前将经过处理的废水与污泥分离。这限制了到达第二反应器的含有OBCOD的经过处理的废水的量，并另外防止了OBCOD的转化和不需要的微生物的生长。当废水含有高水平的OBCOD时，可能需要进行后处理以降解OBCOD。
优选地，微生物存储化合物为糖原或PHA，更优选为PHA，该方法是用于生产PHA的方法。在那种情况下，活性污泥包含积聚PHA的微生物，优选积聚PHA的细菌。一旦该过程以稳态运行，所述活性污泥为步骤a)和c)中获得的进一步富含积聚的微生物的活性污泥。在该过程的起始，第一反应器阶段可以用活性污泥或包含这种积聚的微生物的其它样品或用能够积聚所需的微生物存储化合物(特别是PHA)的微生物菌株进行接种。供应至第一反应器的废水流通常包含能够积聚所需的微生物存储化合物的微生物，然后可以开始该过程而不需要用污泥或用这样的微生物进行接种。
积聚PHA的细菌和古生菌以及能够积聚微生物存储化合物的其它微生物通常存在于微生物的非无菌培养物中，例如在土壤、天然水或混合生物质样品中发现的微生物。它们也可以从普通的市政废水处理厂中分离或富集。积聚PHA的细菌可以属于各种属，例如产碱杆菌属(Alcaligenes)(例如产碱弧菌(A.latus))、雷尔氏菌属(Ralstonia)(例如真氧产碱杆菌(R.eutropha))、贪铜菌属(Cupriavidus)(例如钩虫贪铜菌(C.necator))、着色菌属(Chromatium)(例如酒色着色菌(C.vinosum))、分支杆菌属(Mycobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、陶厄氏菌属(Thauera)等。它们可以在各种碳源(例如葡萄糖、甲醇、乙醇、乙酸盐和/或其它脂肪酸类)上特异性或非特异性生长。参见例如Tan G-Y.A.等人，Polymers 2014,6,706-754；Huang Y-T.等人，J.Microbiol.Biotechnol.2012,22,1141-47。特别有用的是塑藻属(Plasticicumulans)的细菌，例如嗜酸聚塑料菌(P.acidivorans)(消耗乙酸盐)和P.lacatativorans(消耗乳酸盐)，参见例如Jiang等人，Int.J.systematic Evolutionary Microbiology 2011,61,2314-2319，Tamis等人，J.Biotechnology 2014,192,161-169。有利地，本方法中所用的微生物包含塑藻属的细菌，特别是嗜酸聚塑料菌种。
通过向步骤a)供应废水，在第一反应器阶段中形成活性污泥在废水中的混合物，然后使混合物在第一时间段内经受积聚MSC的反应条件以在经过处理的废水中获得包含MSC的活性污泥。溶解氧的存在优选通过向第一反应器供应含分子氧的气体、更优选空气来实现。这可以在步骤a)期间连续地或不连续地、优选连续地完成。
RBCOD和溶解氧的量使得它们不限制微生物存储化合物的产生。应理解的是，RBCOD和溶解氧的最低浓度将取决于能够积聚第一反应器阶段中存在的微生物存储化合物的微生物的量、待生产的微生物存储化合物和其它工艺条件(例如反应器中混合物的温度和pH值)。
该时间段适用于污泥在被提供到第二反应器阶段之前停留在第一反应器阶段中的平均时间。在间歇操作(batch operation)的情况下，该时间段适用于混合物。如果废水或污泥交换再循环流被间歇地或连续地添加(并且因此经过处理的废水被间歇地或连续地排出)，当污泥不排出或者仅部分与(连续)排出的经过处理的废水一起排出时，该时间段不适用于水，而是适用于污泥本身。
在RBCOD达到某个最小浓度时，当产生一定量的MSC时或当氧气消耗减少时，第一时间段将结束。在两个反应器中连续操作的优选实施方案中，第一时间段通常由设计的反应器体积和废水流量预先确定。在这种情况下，控制第一反应器中的生物质浓度以实现RBCOD的某个最小浓度或氧气消耗速率。可选地，通过调节废水流的供应或第一反应器中生物质的浓度，步骤a)期间第一反应器中混合物中的RBCOD浓度可以保持恒定。当废水供应的流量降到某个值以下时，然后第一时间段也可以结束。
步骤a)中保持的RBCOD水平优选为至少20mg/l，更优选为至少100mg/l。步骤c)中保持的RBCOD水平优选小于100mg/l，更优选小于40mg/l，最优选小于20mg/l。步骤a)中RBCOD的装载率可以在2和80kg/m3.d之间，优选在4和40kg/m3.d之间。
在步骤a)结束时(第一时间段)，基于污泥的有机部分的干重，装载有MSC的活性污泥包含至少50重量％、更优选至少60重量％、甚至更优选至少70重量％或甚至更高的水平的MSC(PHA)。
在步骤c)中应用的生长条件包括如上所述的以足够但限定的水平存在生长必需的元素，并且允许由污泥摄取元素。如上所述，生长条件还包括存在溶解氧。
在步骤c)结束时(第二时间段)，基于污泥的有机部分的干重，长成的活性污泥包含至少20重量％的水平的残余MSC，优选为基于干重的至少40重量％，更优选为至少50重量％，甚至更优选为至少60重量％。
在采用单个反应器的本方法的实施方案中，步骤a)中的废水供应在步骤c)期间减少或中断。因此，步骤c)期间供应的RBCOD的量和/或步骤c)期间存在的RBCOD的平均水平较低，优选比步骤a)低至少50％。在优选的布置中，在步骤c)期间停止供应RBCOD(没有添加超过已经可用于污泥的RBCOD)。
第一时间段(步骤a)和第二时间段(步骤c)对应于污泥被提供给周期的下一阶段之前的停留在这些反应器段中的平均时间。在采用半连续式或间歇式或脉冲式操作的单一反应器的情况下，第一时间段和第二时间段也分别对应于开始废水进料和营养物进料(或在营养物进料之前除去污泥)之间的时间，以及开始营养物进料和除去污泥或废水进料之间的时间。第一时间段(步骤a)优选在0.5至8小时之间，更优选在1至4小时之间。第二时间段(步骤c)优选在0.1和6小时之间，更优选在0.2和4小时之间，甚至更优选在0.25和2小时之间。当营养物的摄取速度快并且在随后的步骤a)中也可以实现部分生长时，第二时间段可以相对较短。总周期因此可以有利地在0.5小时和10小时之间，优选在1小时和6小时之间。
在步骤b)和d)中，分别转移在前面的步骤a)和c)中获得的至少部分污泥，或者如果不需要物理转移，则使前面的步骤a)和c)中获得的至少部分污泥分别存在于在后续步骤c)和a)中。在步骤b)中，甚至将全部的污泥转移至步骤c)，条件是将步骤d)中转移的至少部分污泥除去或收获。在优选的实施方案中，将步骤d)中的所有污泥都转移至步骤a)，将步骤b)中转移的至少部分污泥除去或收获。
可将步骤a)中产生的装载有MSC的活性污泥的部分从周期中除去，优选进行收获。另外，根据例如在步骤c)之后的MSC水平上，可以将步骤c)中产生的部分长成的活性污泥从周期中除去并进一步进行处理和/或收获。除去(和收获)的污泥的量优选使得系统中平均的污泥停留时间(SRT)(第一反应器和任选的第二反应器一起)小于72小时，更优选小于48小时，还更优选小于36小时，最优选小于24小时。
基于污泥的有机部分的干重，步骤e)中除去的部分装载有MSC的活性污泥含有至少50％的MSC(PHA)，优选为至少60％，更优选为至少70％的PHA，或甚至至少75％，在步骤c)中存在于第二反应器阶段中的活性污泥优选含有至少50％的PHA。基于污泥的有机部分的干重，步骤e)中任选除去的部分长成的活性污泥含有至少20％、优选至少40％、更优选至少50％、甚至更优选至少60％、最优选至少65％的MSC(PHA)。最优选地，装载有MSC的污泥(来自步骤a)中的MCS(特别是PHA))的水平和长成的活性污泥(来自步骤c))的水平相差小于(有机污泥的总干重的)20％，最优选小于(有机污泥的总干重的)10％。在两个反应器阶段之后达到的PHA含量的差异主要取决于在两个反应器阶段施加的总污泥浓度，并且可以受保留在第一反应器阶段和第二反应器阶段中并在第一反应器阶段和第二反应器阶段之间再循环的污泥的量以及步骤e)中除去的污泥的量影响。
如上所述，反应器阶段可以具有不同的形式。在合适的实施方案中，第一反应器阶段和第二反应器阶段是两个单独的反应器或一个反应器的两个隔室，步骤a)在第一反应器或第一隔室中进行，步骤c)在第二反应器或第二隔室中进行。反应器优选以连续或半连续模式或脉冲进料模式操作。在连续模式中，向第一反应器连续进料废水，在第一时间段后(在这种情况下为一定的停留时间)，将废水与部分或全部的污泥转移至第二反应器，在第二反应器中直接添加更少量的废水或更多的稀释废水或优选根本不含RBCOD的废水，并且根据需要进料生长必需的元素。可以有利地在步骤a)和c)之间将装载有MSC的活性污泥与废水分离。在半连续模式或脉冲进料模式中，废水不是连续添加的，而是例如脉冲式添加的。特别是当第二反应器用于连续系统时，在步骤c)中用于生长的营养物也可以有利地脉冲式供应。如上所述，如果供应至步骤a)的废水中的其它可生物降解的COD(OBCOD)的水平相对较高，特别是大于步骤a)中的RBCOD的水平的0.2倍，则这种操作模式是特别有利的。
可选地，第一反应器阶段和第二反应器阶段是在同一反应器中的阶段，在空间中或优选在时间上分开。然后在第一反应器阶段供应废水，在第二反应器阶段c)期间供应优选被抑制或中断。根据需要在步骤c)中连续地或脉冲地计量生长必需的元素。单个反应器可以优选地以半连续或脉冲模式操作。本发明的一个优点是，在步骤c)中，废水流并不总是必须中断，尤其是在可生物降解的COD的RBCOD分数高的情况下。在这种模式下，相对促进生长的步骤c)由在如上文中所定义的限制内供应生长必需的元素而启动。在另一个单反应器的实施方案中，其可以在序批式反应器中操作，包括用废水填充、允许积聚的反应、添加营养物，允许摄取营养物的反应和有限生长以及污泥的沉降、积聚(a)后或有限的生长(c)后(或者特别是两者之后)，除去流出物并部分除去污泥。
因此，在涉及一个反应器的一个优选实施方案中，本方法包括以下步骤：
a)将废水流供应到反应器，并在第一时间段期间在积聚MSC的条件下使废水与活性污泥接触，以获得装载有MSC的活性污泥和经过处理的废水，基于污泥的有机部分的干重，装载有MSC的活性污泥包含MSC，优选包含至少60重量％的水平的MSC；
b)任选地在步骤a)期间或之后减少或中断废水的供应；
c)向反应器供应生长必需的元素(优选脉冲式地)，并在第二时间段期间，在生长条件下使废水与活性污泥接触，其中与步骤a)中供应的RBCOD的量相比，至少一种所述必需元素的供应量将生长限制在不是所有的MSC都用于生长的程度，以获得包含残余的MSC的长成的活性污泥，基于污泥的有机部分的干重，长成的活性污泥优选包含至少20重量％的水平的残余的MSC；
d)在步骤c)期间或之后中断生长必需的元素的供应；
e)在步骤a)期间或之后和/或在步骤c)期间或之后，除去部分经过处理的废水，且在步骤a)期间或之后除去部分装载有MSC的活性污泥和/或在步骤c)期间或之后除去部分长成的活性污泥，例如在步骤c)之后，通过在反应器中沉降并从反应器中排出，使得活性污泥在反应器中的平均停留时间(SRT)小于72小时，优选小于48小时；
并继续步骤a)。
在涉及两个反应器或反应器隔室的另一个优选实施方案中，本方法包括以下步骤：
a)向第一反应器供应废水流，并在第一时间段期间在积聚MSC的条件下使废水与活性污泥接触，以获得装载有MSC的活性污泥和经过处理的废水，基于污泥的有机部分的干重，装载有MSC的活性污泥包含MSC，优选包含至少60重量％的水平的MSC；
b)将至少部分装载有MSC的活性污泥和至少部分在第一反应器中获得的经过处理的废水转移至第二反应器；
c)向第二反应器供应生长必需的元素，并在第二时间段期间，在生长条件下使废水与活性污泥接触，其中与步骤a)中供应的RBCOD的量相比，至少一种所述必需元素的供应量将生长限制在不是所有的MSC都用于生长的程度，以获得包含残余的MSC的长成的活性污泥，基于污泥的有机部分的干重，长成的活性污泥优选包含至少20重量％的水平的残余的MSC；
d)将第二反应器中产生的至少部分长成的活性污泥转移至第一反应器；
e)在步骤a)期间或之后，从第一反应器中除去部分经过处理的废水和/或在步骤c)期间或之后，从第二反应器中除去部分经过处理的废水，且在步骤a)期间或之后除去部分装载有MSC的活性污泥和/或在步骤c)期间或之后除去部分长成的活性污泥，使得活性污泥在第一反应器和第二反应器中的平均停留时间(SRT)总共少于72小时；
并继续步骤a)。
在任一实施方案中，在步骤c)中供应的限制生长而使得不是所有的MSC(PHA)都用于生长的生长必需的元素的量对应于如上文所定义的Nc/Ca或Pc/Ca(或Sc/Ca、Kc/Ca、Fec/Ca等)的比率。在所有实施方案中，本发明的方法允许生产和分离具有高水平MSC(例如PHA)的微生物污泥。因此，基于干燥的有机污泥(该污泥可被分开和分离)，步骤e)中获得的含MSC的活性污泥包含至少50重量％、优选至少60重量％、更优选至少70重量％、或者特别是至少75重量％、或甚至至少80重量％的水平的PHA。
本发明的方法之前可以是厌氧发酵废水以增加RBCOD、特别是挥发性脂肪酸类和/或乳酸和/或乙醇的水平的步骤。因此，该方法可以包括在前的步骤，其中未处理的废水在单独的反应器(例如厌氧反应器，其中实现部分发酵(水解、酸化、乙酰化))中进行水解和/或发酵。有利的是，在该步骤中，存在于废水中的部分营养物被除去，从而降低营养物与RBCOD的比率。
从一个反应器阶段向另一个反应器阶段的污泥转移和步骤e)中部分污泥的除去可以通过本领域已知的方式进行，例如通过反应器内部或外部的污泥的沉降的方式，或通过反应器内部或外部的固液分离器的方式。合适的固液分离器在本领域是已知的，包括沉降器、水力旋流器、离心机、膜和带式过滤器。当需要污泥保留时，这种分离可以在第一反应器内的沉降器中进行，更优选通过沉降的方式进行。例如，可以通过在步骤a)结束时停止向第一反应器供应废水和空气来实现这种沉降。由于所需的生物质积聚存储化合物比不需要的生物质重，所以在将这样的污泥转移至第二反应器之前可以有利地进行活性污泥的浓缩，使得待转移的活性污泥中的不需要的生物质与所需的积聚微生物分离。
可以将步骤a)中处理的部分废水转移至第二反应器阶段中或导致其存在于(如果在相同的物理反应器区域)第二反应器阶段中，通常与污泥和经过处理的废水的(浓缩的)混合物一起用作生长步骤c)中的液体反应介质。可选地，可以首先在内部或外部分离器中将经过处理的废水与固体污泥分离，然后可以将部分分离的经过处理的废水转移至第二反应器阶段以用作在步骤c)中的液体反应介质。
经过处理的废水可以在步骤a)至e)期间从一个或多个反应器连续取出，或者在步骤a)结束时和/或在步骤c)结束时分批取出。如果在步骤a)至e)期间从第一反应器阶段连续取出经过处理的废水，则反应器优选包含用于将任何污泥与经过处理的废水分离的沉降器，以使污泥至少部分保留在第一反应器中。这种沉降器可以位于反应器内部，优选恰好在经过处理的废水出口之前的反应器上部，或者在反应器外部以将经过分离的污泥再循环至第一反应器。应理解的是，用于防止污泥在经过处理的废水连续取出的情况下从第一反应器中取出的沉降器可以是与可以用于浓缩步骤b)中待转移至第二反应器阶段的活性污泥的沉降器不同的沉降器。
在第一反应器阶段或第二反应器阶段之后除去活性污泥之后，可以在一个或多个进一步的步骤中从该产物流中回收PHA，以用于例如生物塑料中。这些步骤在本领域中是公知的并且通常包括破坏微生物细胞以收获微生物存储化合物和进一步的纯化步骤。
在步骤d)中，使部分长成的富含能够积聚微生物存储化合物的微生物的活性污泥存在于(或转移至)第一反应器阶段以形成包含能够在步骤a)中积聚微生物存储化合物的微生物的活性污泥。
步骤a)和c)中所需的溶解氧浓度通过在这些步骤期间向第一反应器或第二反应器供应分子氧或另外的含氧氧化剂来保持，优选通过连续地向相关的反应器供给空气流。
如果第二反应器阶段物理上不同于第一反应器阶段，即在两个反应器的情况下，第二反应器阶段的体积通常小于第一反应器阶段的体积。优选地，第二反应器的体积为第一反应器的体积的10％至90％，更优选在第一反应器的体积的20％至50％的范围内。
附图描述
图1示意性地示出了根据本发明的单反应器系统。积聚和生长反应器1设置有具有空气分配装置的空气供应2。含有RBCOD并且营养物有限的废水可以通过入口管线3连续或间歇地进料。营养物可以通过入口管线4以脉冲方式或间歇方式进料。反应器可以设置有用于测量溶解氧(DO)、营养物(例如氮)、(RB)COD(特别是挥发性脂肪酸类(VFA))、温度、pH等的传感器。当反应器中的RBCOD水平下降到最低水平(例如10mg/l，根据测量的增加的DO浓度，从降低的耗氧率中得出)时，可以中断RBCOD的进料并且随后可以添加营养物。出口管线5允许排出含污泥的流出物。流出物在分离器6中分离，通过管线7将澄清的流出物从分离器6中排出。可选地，可以在反应器1中设置内部沉降器(未示出)。污泥通过管线8离开分离器，并以可控的方式在任选的回流管线9和排出(产物)管线10上分开。任选的出口管线11允许从反应器1直接排出污泥。在序批式反应器系统中，可以在空气供应暂时停止并省去分离器6之后通过沉降污泥而在反应器1中实现污泥分离。
图2示意性地示出了根据本发明的双反应器系统。积聚反应器1设置有具有空气分配装置的空气供应2。含有RBCOD和营养物有限的废水可以通过入口管线3连续或半连续地进料。出口管线5允许将含有污泥的流出物转移至分离器6(其也可以是内部的，未示出)，澄清的流出物通过管线7从分离器6中排出。污泥通过管线8离开，并以可控的方式在排出(产物)管线10、循环管线15和任选的回流管线9上分开。管线15将污泥运送至生长反应器12，生长反应器12设置有具有空气分配装置的空气供应13。可以将营养物通过入口管线14连续地或脉冲地进料至生长反应器。任选的出口管线11允许直接从反应器1排放污泥以通过出口管线17除去或收获污泥和/或通过管线18将污泥直接进料至生长反应器12。管线16将反应器12的含污泥流出物转移回反应器1。
图3表示示出了如示例1中进一步描述的在作为SBR操作的反应器中的约三个工艺周期期间的溶解氧(％饱和度)的图。该图示出了作为乙酸盐的添加(步骤1)、乙酸盐的消耗、营养物的添加(步骤2)和反应器内容物的部分除去(步骤3)的函数的溶解氧浓度。
图4示出了在SBR系统中工艺周期期间污泥的PHA水平(干燥有机物的百分比)。菱形(◆)示出了积聚期结束时的PHA水平，正方形(■)示出了生长期结束时的PHA水平。
图5示出了在连续操作的双反应器系统中工艺周期期间的污泥的PHA水平(干燥有机物的百分比)。菱形(◆)示出了积聚反应器中的PHA水平，球形(●)示出了生长反应器中的PHA水平。
示例1
将6升双壁玻璃反应器保持在30℃±1℃。通过连续加入少量的CO2气体将pH保持在6.8和7.0之间。该反应器作为序批反应器以3.5小时(210分钟)的周期操作。在整个周期中，用固定量的空气对反应器充气。该周期由以下组成：
步骤1在t＝0分钟时：添加750ml的合成培养基，其含有10g/l的乙酸盐(50％摩尔的NaAc和50％摩尔的HAc)、200mg/l的K(作为KCl)、100mg/l的Ca(作为CaCl2)和50mg/l的Mg(作为MgCl2)。
步骤2在t＝160分钟时：添加含有N(作为尿素)、P(作为H3PO4)和痕量金属的商购的营养物混合物，其中N是限制性化合物。每个周期添加90mg/l的N。
步骤3在t＝200分钟时：除去750ml的反应器内容物。
系统特征如下：
-水力停留时间(HRT)：28小时
-平均污泥停留时间(SRT)：28小时
-第一时间段：160分钟
-第二时间段：40分钟
-基于元素以重量计的N/C：1/33)
当在上述条件下启动反应器时，污泥已经含有由先前研究得到的积聚PHA的生物体的混合物。最初将实验室反应器用来自市政废水处理厂的好氧污泥进行接种。
图3示出了约三个周期的测量的溶解氧浓度。图中示出只要将乙酸盐进料至反应器(步骤1)，溶解氧浓度就会下降，这表明乙酸盐的摄取和PHA的生产需要氧气消耗。大约100分钟后，乙酸盐耗尽，溶解氧浓度突然增加回到基线水平。一旦添加了营养物(步骤2)，溶解氧浓度再次下降，并且在20分钟内溶解氧浓度增加回到基线水平，在除去反应器内容物时溶解氧浓度略有变化(步骤3)。在积聚期间(步骤1之后的低DO期间)，溶解的氮浓度低，在该期间结束时乙酸盐浓度耗尽(未示出)。在营养物的摄取和有限的生长期间(步骤2之后)，溶解的N浓度在添加营养物后直接增加，并在20分钟的生长期间内再次下降。
在这些设置下SBR反应器操作超过一个月(其等于约200个周期或污泥停留时间(SRT)的25倍)，并且在PHA积聚期结束和在成长期结束时分析PHA含量。通过热重分析(TGA)测定污泥中的PHA含量，其中污泥样品的PHA含量在200和300℃之间损失。这导致了可以基于其确定PHA含量的独特的失重峰值。结果如图4所示。
图4显示出基于有机物含量，污泥中的平均PHA含量在70和78重量％之间循环，其中PHA积聚期间后的平均PHA含量仅略高于生长期间后的平均PHA含量。
示例2：
根据图2中的流程图(省略了管线9、11、17和18)并在以下设置下，包括两个双壁玻璃反应器的连续式装置操作超过两个月：
-PHA积聚反应器(1)：3.5升体积，将温度控制在30℃，采用另外的二氧化碳供应将pH控制在pH 7.0，并采用空气充气以确保高于20％饱和度的溶解氧浓度。
-进料(3)：1.4l/h的合成培养基，其含有1.8g/l的乙酸盐(50％摩尔的NaAc和50％摩尔的HAc)、100mg/l的K(作为KCl)、50mg/l的Ca(作为CaCl2)和30mg/l的Mg(作为MgCl2)
-沉降器(6)：直径10厘米，具有锥形底部
-生长反应器(12)：3升体积，将温度控制在30℃，采用另外的二氧化碳供应将pH控制在pH 7.0，并采用空气充气以确保高于20％饱和度的溶解氧浓度。每30分钟脉冲添加(14)含有N(作为尿素)、P(作为H3PO4)和痕量金属的商购的营养物混合物，其中N是限制性化合物。每个脉冲添加19mg的N。
-来自沉降器的污泥排放(10)：0.4l/h
-从沉降器到生长反应器的污泥再循环(15)：0.6l/h。
系统特征如下：
-第一时间段等于PHA积聚反应器中的水力停留时间(HRT)：1.8小时
-第二时间段等于生长反应器中的HRT：5小时
-平均污泥停留时间(SRT)：17小时左右
-基于元素以重量计的N/C：1/27
-第一反应器的有机物装载率：17kg/m3.d乙酸盐。
当在上述条件下启动系统时，将反应器用已经含有取自示例1中提到的反应器的积聚PHA的生物体的混合物的污泥进行接种。最初，将来自示例1的SBR实验室反应器用来自市政废水处理厂的好氧污泥进行接种。
在这些条件下，几周后达到稳定状态。通过分析证实，PHA积聚反应器和沉降器溢流中的乙酸盐浓度通常在50和100mg/l之间。生长反应器中的溶解氧浓度在脉冲添加营养物后直接下降，并在下一次脉冲供应之前再次增加。
在取自PHA积聚反应器和生长反应器的样品中分析PHA含量。结果显示在图5中。基于有机物含量，PHA积聚反应器中污泥中的平均PHA含量为70重量％，而生长反应器中的平均PHA含量在50至60重量％之间。