本发明涉及一种重污染土壤修复技术领域，尤其涉及一种海洋酵母菌联合植物修复重金属污染盐碱土壤的方法。
背景技术：
在人为和自然作用的影响下，土壤中重金属高于原生含量、并造成生态环境质量恶化的现象越发普遍。由于重金属在土壤中一般只能发生形态的转变和迁移，难以降解，同时在不同形态下引起的毒性不同，因而极易长期潜伏，产生生物放大作用，对植物和人类造成不可忽视的危害。因此，利用生物表面活性剂的阴离子(带负电荷)性对土壤中重金属的修复作用，它能够吸附到土壤上与重金属离子结合，使其从土壤颗粒上分离出来进入土壤溶液中，结合到表面活性剂胶束中，促进土壤颗粒上重金属离子的去除，是修复重金属污染土壤的重要途径。
生物表面活性剂是微生物或植物在一定条件下培养时，其代谢过程中分泌出的具有一定表面活性的次级代谢产物，它本身具有分散、增溶、润湿、渗透等特性，能够降低界面张力和表面张力。与合成表面活性剂相类似，生物表面活性剂的分子结构主要由两部分组成：一部分是疏油亲水的极性基团，如单糖、聚糖、磷酸基等；另一部分是由疏水亲油的碳氢链组成的非极性基团，如饱和或非饱和的脂肪醇及脂肪酸等。疏水基一般为脂肪酰基链,极性亲水基则有多种形式,如中性脂的酯或醇官能团。利用其两亲的特殊性质，通过胶束的分配作用和改变界面张力显著增加疏水性有机物在水中的溶解度，对污染土壤进行清洗处理，成为一种典型的修复技术。在土壤修复中，添加生物表面活性剂或者生物表面活性剂产生菌克服了物理和化学修复方法的众多缺点，特别是能够大幅缩短修复时间、提高修复效率，并且能够保持良好的环境友好性。但是现有的生物表面活性剂刚刚起步品种较少，修复效果也欠佳，使用方法也比较单一。如何开发出新品种的生物表面活性剂及使用方法是目前急需解决的技术难题。
技术实现要素：
本发明的目的之一在于克服现有技术的不足，提供了一种用海洋酵母菌制造生物表面活性剂，然后联合植物修复重金属污染土壤的方法。植物修复、海洋微生物产生物表面活性剂强化修复均绿色、环保、无二次污染，将二者有效结合，避免了化学强化剂易残留、难降解、生物毒性等弊端，利用生物表面活性剂增溶、增流效果，提高土壤中有效态重金属含量，利于植物吸收，对植物进行重金属污染场地的修复有强化效果，有利于海洋资源开发，应用前景广阔。
本发明提供了一种海洋酵母菌联合植物修复重金属污染盐碱土壤的方法,其特征在于包括如下步骤：
(1)首先取得海洋酵母菌菌种；
(2)将海洋酵母菌菌种进行发酵得生物表面活性剂发酵液；
(3)将无柄小叶榕种植于污染土壤中，再将生物表面活性剂发酵液添加至污染土壤中，与无柄小叶榕联合修复污染土壤。
优选所述海洋酵母菌为海洋解脂耶罗维亚酵母菌。
优选所述步骤(2)的发酵温度为28℃，摇床培养条件为150rpm·min-1、72小时后得生物表面活性剂发酵液；
优选步骤(3)为首先将生物表面活性剂定量：将步骤(2)中的发酵液依次经过酸沉淀法粗提、减压蒸馏纯提取、最后经真空冷冻干燥提取得纯的生物表面活性剂粉末，将粉末称量计算生物表面活性剂的产率；以干土质量计，生物表面活性剂纯品在土壤中的添加浓度为10mg·kg-1—1000mg·kg-1，优选为100mg·kg-1—300mg·kg-1。通过生物表面活性剂的产率计算生物表面活性剂发酵液在土壤中的添加量进行添加，发酵液添加方式为一次性添加或者分多次添加。
本发明在步骤(3)中还可以添加有化学螯合剂柠檬酸或者乙二胺四乙酸，两者在土壤中的添加量均为0.1mmol·kg-1-10mmol·kg-1，优选为1mmol·kg-1。
本发明所述步骤(1)优选包括如下步骤：
(a)将采集的海水和底泥浓缩液进行富集培养并进行筛选；
(b)通过生理生化以及分子生物学方法对筛选得到的菌株进行鉴定得海洋不动杆菌。
所述步骤(1)的详细步骤为：
(a)将采来的海水样品和经无菌水处理的底泥浓缩液在灭菌的人工海水培养基中，28℃，200r/min条件下进行富集培养。对制造生物表面活性剂的菌株进行筛选，可通过①柴油降解率测定，②液滴坍塌实验，③免疫溶血实验，④排油圈大小的测定，⑤表面张力测定。
(b)菌种鉴定：
对筛选得到的产生物表面活性剂菌株进行分子生物学鉴定，18srrna序列分析。菌株经ma(difcotmmatineagra2216)28℃，24h纯化培养，利用axygen基因组dna提取试剂盒提取dna，用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测酵母菌dna质量，在tebuffer管中将dna稀释至70ng/μl用作pcr扩增模板，利用正向引物(5'-3'：atctggttgatcctgccagt)和反向引物(5'-3'：gatcttccgcaggttcacc)进行扩增，扩增体系：模板dna0.5μl，10×buffer5μl，25mmmgcl24μl，dntp1μl，正向及反向引物(10μm)1μl，taqdna聚合酶0.25μl。通过ncbi网站对比，找出与目的基因同源性最高的已知菌种，从genbank数据库中找出近源菌株的18srrna序列，与测定序列共同进行clustalx程序校准多序列比较。进一步地，通过革兰氏染色、甲基红实验、乙酰甲基醇实验、糖发酵实验、柠檬酸实验、明胶液化实验、吲哚试验、硫化氢实验等生理生化鉴定。
本发明所述步骤(2)包括如下步骤：发酵培养基具体成分为硫酸铵10.0g·l-1，氯化钾1.1g·l-1，氯化钠1.1g·l-1，磷酸二氢钾3.4g·l-1，酵母膏0.5g·l-1，三水合磷酸氢二钾2.46g·l-1，微量元素5ml·l-1，正十六烷20ml·l-1；初始ph7.4，超净工作台内接菌，28℃、150rpm·min-1摇床培养，发酵72小时，灭菌条件：121℃、20min；微量元素溶液：七水合硫酸锌29g·l-1；氯化钙24g·l-1；无水硫酸铜25g·l-1；一水合硫酸锰17g·l-1；七水合硫酸镁10g·100ml-1；0.056g·l-1七水合硫酸亚铁，用0.22μm的滤膜过滤除菌；发酵液ph调至8，12000rpm·min-1离心30min去除菌体。
本发明所述的生物表面活性剂是脂肽类生物表面活性剂。
有益效果
本发明所用的无柄小叶榕为温州本土树种，其根部生态系统与微生物发酵液共同作用下，对盐碱地金属进行去除。无柄小叶榕为盐碱地适生树种,在ph8.01，含盐量3.7‰的重度盐碱条件下，无柄小叶榕成活率100％，利用无柄小叶榕进行重金属污染盐碱地的修复，植物成活得到保障，且不仅绿化环境，还易于管理、无二次污染。其对重金属污染土壤的修复可归为植物提取，即通过植物的吸收作用将土壤环境中的重金属迁移至地上部分；植物固定，重金属不被植物利用，有毒有害的重金属污染物仅被植物根系固定在其周围，降低重金属的活动性，进一步阻止其向更深层土壤或地下水迁移。另外根际流出物与生物表面活性剂的复配提高了重金属可用性和植物富集力，重金属不断向植物地上部分转移，成年后无柄小叶榕生物量大，地上部分积累大量重金属，可通过收获地上部分，去除土壤中重金属。
该酵母菌能高产脂肽类生物表面活性剂，通过增溶、增流特性，活化土壤中重金属，促进植物吸收，从而大大提高单纯的植物修复效果，且利用生物表面活性剂强化手段绿色、可持续发展，具有良好的应用前景。
采用上述技术方案，本发明利用筛选自海洋的酵母菌产生的生物表面活性剂联合乡土树种无柄小叶榕修复重金属污染的盐碱地，易于管理、环境友好、无二次污染，通过盆栽试验进一步有效探索海洋酵母菌所产生物表面活性剂的实际场地修复效果。
附图说明
图1为海洋解脂耶罗维亚酵母菌菌落形态照片
图2酵母菌株的电子显微观察
图3为生物表面活性剂的红外光谱扫描图
图4为生物表面活性剂水解酯化后的总离子色谱图
图5为生物表面活性剂的质谱图
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
需要说明的是本发明的所有实施例中所用到的海洋酵母菌及生物表面活性剂都是按照实施例1方法得到的，但并不说明本发明所用到的海洋酵母菌一定是用实施例1的方法获得，本发明中的海洋酵母菌可以从其它海域中采用其它的方法分离筛选，也可以直接使用现有的公开的海洋酵母菌。
实施例1
1)菌种分离、筛选：
将采来的海水样品和经无菌水处理的底泥浓缩液在灭菌的人工海水培养基(mmc)中，28℃，200r/min条件下进行富集培养。对产生物表面活性剂微生物进行筛选，可通过①柴油降解率测定：降解率＝(空白柴油浓度-培养液柴油浓度)/空白柴油浓度×100％②液滴坍塌实验：取5μl去除菌体的发酵液滴于布有油膜的96孔板中，放大镜观察液滴的形状③免疫溶血实验：将微生物菌落点样于血平板上，观察单菌落周围有无透明的溶血圈，并比较溶血圈直径的大小④排油圈大小的测定：取一定量离心除去菌体的发酵液，加入表面均匀覆盖油膜的水中，测量发酵液推开油膜的直径⑤表面张力测定：用全自动表/界面张力仪进行测定，方法依照威廉姆悬片法，测样前先测定空白样的表面张力(73.4mn/m)进行校正，然后测定各实验组发酵液的表面张力。
2)菌种鉴定：
对筛选得到的产生物表面活性剂菌株进行分子生物学鉴定，18srrna序列分析。菌株经ma(difcotmmatineagra2216)28℃，24h纯化培养，利用axygen基因组dna提取试剂盒提取dna，用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测酵母菌dna质量，在tebuffer管中将dna稀释至70ng/μl用作pcr扩增模板，利用正向引物(5'-3'：atctggttgatcctgccagt)和反向引物(5'-3'：gatcttccgcaggttcacc)进行扩增，扩增体系：模板dna0.5μl，10×buffer5μl，25mmmgcl24μl，dntp1μl，正向及反向引物(10μm)1μl，taqdna聚合酶0.25μl。通过ncbi网站对比，找出与目的基因同源性最高的已知菌种，从genbank数据库中找出近源菌株的18srrna序列，与测定序列共同进行clustalx程序校准多序列比较。进一步地，通过革兰氏染色、甲基红实验、乙酰甲基醇实验、糖发酵实验、柠檬酸实验、明胶液化实验、吲哚试验、硫化氢实验等生理生化鉴定。
经鉴定：本实施例的海洋酵母菌为海洋解脂耶罗维亚酵母菌。
3)发酵阶段：
发酵培养基为硫酸铵10.0g·l-1；氯化钾1.1g·l-1；氯化钠1.1g·l-1；磷酸二氢钾3.4g·l-1；酵母膏0.5g·l-1；三水合磷酸氢二钾2.46g·l-1；微量元素5ml·l-1；正十六烷20ml·l-1；初始ph7.4，超净工作台内接菌，28℃、150rpm·min-1摇床培养，发酵72小时(灭菌条件：121℃、20min；微量元素溶液：七水合硫酸锌29g·l-1；氯化钙24g·l-1；无水硫酸铜25g·l-1；一水合硫酸锰17g·l-1；七水合硫酸镁10g·100ml-1；0.056g·l-1七水合硫酸亚铁，用0.22μm的滤膜过滤除菌)。发酵液ph调至8，12000rpm·min-1离心30min去除菌体。
4)生物表面活性剂定量：
通过酸沉淀法粗提、减压蒸馏纯提取、最后经真空冷冻干燥提取的纯的生物表面活性剂为黄褐色粉末，进行称量计算生物表面活性剂的产率。本实施例生物表面活性剂产率为481mg·l-1。
5)生物表面活性剂种类鉴定：
薄层色谱(tlc)进行糖、脂鉴定，用红外光谱仪进行扫描并分析光谱图，气相色谱质谱联用(gc/ms)进行生物表面活性剂的结构组成研究。
(1)菌株产生的表面活性剂经薄层色谱展层，喷洒酸性茚三酮溶液后出现红色斑点，rf值在0.7附近，说明这些菌株产生的表面活性剂是脂肽类生物表面活性剂。
(2)对酵母菌产生的生物表面活性剂进行傅里叶变换红外光谱分析，红外扫描图如图3。由图可以看出酵母菌产生的表面活性剂在3302cm-1处吸收峰，位于-n-h键3500cm-1～3200cm-1范围之内，表明有大量的-n-h存在。而2853cm-1～2957cm-1和1465cm-1处吸收峰为c-h的伸缩振动吸收带，1653cm-1,1542cm-1及1073cm-1附近的强吸收峰分别代表了co-n、c＝o、c-o-c的伸缩振动吸收带。上述生物表面活性剂属于脂肽。
(3)通过气相质谱进一步对酵母菌株产生的脂肽的脂肪酸部分进行结构组成分析，图4为酵母菌产生的脂肽水解酯化后的总离子色谱图，图5为生物表面活性剂的质谱图，其中图5a中质核比m/z＝103的基峰为典型的β-羟基脂肪酸甲脂的特征峰，即[ch(oh)ch2cooch3]+离子碎片，图5b在m/z＝74有一个典型的饱和脂肪酸甲脂的特征基峰，这是由于发生了mclafferty重排，即在α-β断裂处形成离子的同时从丢失的片段上转移来一个h。分别提取质核比为m/z＝103、m/z＝74的离子色谱图进行分析，色谱图中色谱峰的保留时间分别为11.406、14.491和16.894。质谱中β-羟基脂肪酸甲脂离子峰失去(ch3oh+h2o)、h2o和h分别产生m-50、m-18、m-1的离子碎片峰，由以上数据可得出脂肪酸甲酯为c14、c15β-羟基脂肪酸甲脂，所以脂肽主要是由c14、c15脂肪酸构成。
6)盆栽试验：
采集各重金属含量均低于国家和本地土壤背景值的土壤，并对供试土壤进行基本理化性质检测，对供试土壤进行盐碱处理，使得陈化稳定土壤ph8～8.5，盐度2.5～2.7‰。进一步地，对土壤进行重金属污染处理，按50mg·kg-1的处理浓度添加镉元素，400mg·kg-1(以干土重量计)的处理浓度添加铜元素。
土壤处理完后，装入pvc花盆，每盆植入一株健康生长的无柄小叶榕幼苗。向盆中土壤倒入生物表面活性剂发酵液，发酵液分5次倒入，一周内倒完。使得最终以干土质量计，生物表面活性剂纯品的添加浓度为100mg·kg-1。本发明所有实施例均分为5次添加。经前面计算已得出本实施例表面活性剂的纯粉产率为481mg/l，每盆土壤4.3kg重，经计算100mg/kg时要加894ml发酵液；200mg/kg时要加1788ml；300mg/kg时要加2682ml；分5次添加，100mg/kg时5次，每次180ml；200mg/kg时5次，每次358ml；300mg/kg时5次，每次536ml；一周内加完。
以单纯种植无柄小叶榕幼苗而不添加生物表面活性剂和其他助剂的处理方法作对比例1，实施例2-实施例11中有些配方添加了柠檬酸(ca)或者乙二胺四乙酸(edta)，添加的具体组分及浓度见下表1，对比例1和每个实施例设3次重复，3个月后取样。
表1各处理实例的配方组分
7)样品采集：
各实施例采集根系周围土壤样品四分法取100g左右，自然风干后除去土样中的石子和动植物残体等异物，用木棒研压、过2mm(10目)尼龙筛除去2mm以上的砂砾、混匀后再将通过2mm尼龙筛的土样研磨至全部通过100目(孔径0.149mm)尼龙筛，取0.2g加4:2:2的混合酸(hno3：h2o2：hf)multiwave3000微波消解。
收获的植物样品分别用自来水、纯水清洗3次，根系置于20mm的edta-na2中交换15min，以除去根系表面吸附的重金属，最后去离子水冲洗3次并用吸水纸吸干。按根、地上部分将植物分成2部分，放入烘箱，杀青(105℃)30min后在70℃下烘至恒重。获得的植物干样经不锈钢粉碎机粉碎过100目尼龙筛，保存，备用。取0.2g加6ml硝酸微波消解。
8)相关性能指标检测：
1.检测无柄小叶榕不同器官中重金属含量：超纯水定容至25ml容量瓶，采用原子吸收分光光度计测定重金属(cu、cd)含量。结果见表2：
表2各处理实例中无柄小叶榕不同器官中重金属含量
由表2可以看出：本发明制造的生物表面活性剂的添加能强化无柄小叶榕对盐碱地cd、cu的吸收，且随生物表面活性剂投加浓度的增加植物根部、地上部cd、cu含量增加，当与化学螯合剂柠檬酸联合应用时强化效果更佳。
2.生物富集系数(bcf)＝植物体内重金属浓度/土壤中重金属浓度；
生物转移系数(tf)＝植物地上部分重金属浓度/根部重金属浓度；
植物修复率＝植物积累的重金属量/土壤中总量×100％；
结果见表3。
表3各处理实例中cd2+，cu2+的富集系数和转移系数及修复率
由表3中的富集系数和转移系数可以看出：本发明的海洋酵母菌制造的生物表面活性剂单独或与螯合剂联合作用下bcf值均显著提高，且大于1，说明强化处理下无柄小叶榕对cd、cu具有高的富集能力。且对cd的富集能力更强，向地上部分转移cd的能力更强。通过修复率可以看出，植株收获时土壤中cd含量较初始土壤cd含量下降更明显，对cd有更高的修复潜能。