一种纳米半导体驱动假单胞菌的水体脱氮方法与流程

本发明涉及一种纳米半导体驱动假单胞菌的水体脱氮方法，属于污水处理技术领域。

背景技术：

目前，由于生活污水、工业废水、养殖污水的大量排放，水体中硝酸盐含量日益增加。而过高的硝酸盐浓度，促使水体富营养化进程加快。同时，其还原的中间产物亚硝酸盐，易导致人和动物缺氧而患高铁血红蛋白症，这将严重威胁人类健康和生态环境。现有的水体脱氮的技术主要包括非生物法及生物法。其中非生物法(反渗透膜法、电渗析膜法和化学还原法)能较好去除硝酸盐，但是效率低，易造成二次污染，且运行费用高，不适合大面积的水体脱氮处理。而生物法水体脱氮是指通过微生物利用电子将硝酸盐还原为氮气，主要分为异养生物反硝化和自养生物反硝化。然而异养反硝化过程需额外投加有机碳源作为电子供体，其投资成本高，易造成有机物残留。自养反硝化技术则是以无机电子为电子源，相比于异养反硝化更加绿色经济，被认为是目前最富有潜力的水体脱氮技术。

假单胞菌(pseudomonasstutzeri)，作为典型的反硝化菌，具有快速的自我修复及繁殖能力，能够有效还原硝酸盐至氮气。目前常用的电子供体包括有机碳，亚铁离子、电极电子等电子源。但是，以有机碳为电子受体成本高；亚铁离子为电子受体时易被氧化，且产生大量的铁泥，污染环境；以电极电子为电子供体时，电极反硝化工艺繁琐。因此，不利于大规模的推广应用。

纳米半导体在分析化学、生物医学和生物传感器方面具有潜在的应用价值。但是经文献与专利检索，尚未有研究考虑将纳米半导体光生电子作为pseudomonasstutzeri菌电子来源，也未见其应用于水体脱氮的先例。

技术实现要素：

本发明提供了一种纳米半导体驱动假单胞菌的水体脱氮方法，可以有效解决上述问题。

本发明是这样实现的：

一种纳米半导体驱动假单胞菌的水体脱氮方法，包括以下步骤：

s1，在假单胞菌菌液中合成或加入纳米半导体，构建假单胞菌-纳米半导体杂化体系；

s2，将假单胞菌-纳米半导体杂化体系离心或过滤，取固体转接至无电子供体培养基中，加入牺牲试剂和含有硝酸盐的污水；在光照条件下进行脱氮反应。

作为进一步改进的，所述假单胞菌菌液的od600nm值为0.1～0.3，或者假单胞菌菌液为生长对数期的菌液。

作为进一步改进的，所述假单胞菌-纳米半导体杂化体系的负载量为20％～400％。

作为进一步改进的，所述纳米半导体为cds、bi2s3、cdse中的至少一种。

作为进一步改进的，所述纳米半导体在菌液中的终浓度为0.05～2mmol/l。

作为进一步改进的，所述无电子供体培养基的配方kh2po48.4～10.2g/l，kh2po41.6～2.0g/l，na2moo4·2h2o43.4～53.2mg/l，mgcl2·6h2o0.15～0.18g/l，mncl2·4h2o0.9～1.1mg/l，cacl2·2h2o46.4～56.7mg/l，feso4·7h2o5.0～6.2mg/l，乙醇1～10ml/l，其余为水。

作为进一步改进的，所述牺牲试剂为乳酸钠、乳酸或者半胱氨酸中的至少一种，其中以半胱氨酸为牺牲试剂时硝酸盐还原能力最强。

作为进一步改进的，所述牺牲试剂的加入量为使其终浓度为0.1～1％

作为进一步改进的，所述光照的光强为1～100mw/cm²，光照时的温度为25～40℃。当光度强度为80mw/cm²时时硝酸盐还原能力最强。

作为进一步改进的，所述光照的光源选自太阳光、led灯或者氙灯中的至少一种。

作为进一步改进的，所述假单胞菌菌液为假单胞菌在mediai培养基中培养的菌液，该mediai培养基的ph值为6.5～7.5。

本发明的有益效果是：

本发明的纳米半导体驱动假单胞菌的水体脱氮方法，能够以丰富廉价的光能作为驱动力激发纳米半导体光生电子，然后pseudomonasstutzeri菌利用光生电子实现选择性还原硝酸盐氮，显著降低了工艺成本。

本发明纳米半导体驱动假单胞菌的水体脱氮方法克服了传统水体脱氮过程中存在的工艺复杂、能耗大、水体二次污染等缺点，具有工艺简单、能耗低、绿色经济的优点，系统的相对简单性使得它们更易于以模块化方式进行修改和改进，因此可进行大规模的推广应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1中pseudomonasstutzeri-cds杂化体系水体脱氮性能图。

图2为本发明实施例2中不同牺牲试剂(乳酸钠、乳酸、半胱氨酸)对pseudomonasstutzeri-cds杂化体系水体脱氮性能的影响的图。

图3为本发明实施例3中不同cd²⁺浓度对pseudomonasstutzeri-cds杂化体系水体脱氮性能的影响的图。

图4为本发明实施例4中不同pseudomonasstutzeri-cds负载量对pseudomonasstutzeri-cds杂化体系水体脱氮性能的影响的图。

图5为本发明实施例5中不同光强对pseudomonasstutzeri-cds杂化体系水体脱氮性能的影响的图。

具体实施方式

为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

在本发明的描述中，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。

表1培养基的组成

实施例1

(1)将pseudomonasstutzeri(购买于日本微生物菌种保藏中心，保藏编号为jcm5965，下同)以1％的体积比接种至ph为7.0的mediai培养基中，调节培养基，30℃恒温培养；

(2)当步骤1中pseudomonasstutzeri的od600nm值为0.15时，缓慢加入1％的半胱氨酸(提供硫源)和1mmol/lcdcl2(提供cd²⁺)，使菌液中合成cds，最终获得pseudomonasstutzeri-cds杂化体系；

(3)将pseudomonasstutzeri-cds杂化体系以5000r/min离心分离8min，取沉淀转接至无电子供体培养基(表1，mediaii，下同)中，pseudomonasstutzeri的负载量为100％(即4.76*10⁹菌数/ml，下同)投加乳酸钠，使其终浓度为1％，并于培养基顶部加入含有硝酸盐氮的污水，硝酸盐氮的终浓度为14mg/l；

(4)在30℃恒温条件下，利用led紫光灯(30mw/cm²)对步骤3的杂化体系进行光照还原硝酸盐氮，从而达到水体脱氮。

为了分析反硝化菌pseudomonasstutzeri、纳米半导体cds及光源在富含硝酸盐氮水体反硝化过程，还进行了对照组实验，包括：pseudomonasstutzeri(光照)组，即不加入cds，其他操作均相同；pseudomonasstutzeri-cds杂化体系(黑暗)组，即将紫光灯光照替换成黑暗条件下处理，其他操作均相同；pseudomonasstutzeri(灭活)-cds杂化体系(光照)组，即加入的pseudomonasstutzeri为灭活菌体，其他操作均相同。结果显示，上述3组对照组实验未有明显的硝酸盐还原，仅实验组中的体系能还原硝酸盐，68h内采用离子色谱仪(ics900,dionex,thermofisher,usa)检测到14mg/l硝酸盐氮完全被还原(图1)，采用靛酚蓝比色法检测到21.21％的硝酸盐氮转化为铵态氮，采用气相色谱仪(agilent7890,usa)检测到72.36％的硝酸盐氮转化为氧化亚氮，6.33％的硝酸盐氮转化为氮气。本发明pseudomonasstutzeri-cds杂化体系在光照的条件下有优越的水体脱氮性能。

实施例2

(1)将pseudomonasstutzeri以1％的体积比接种至ph为7.0的mediai培养基中，调节培养基，30℃恒温培养；

(2)当步骤1中pseudomonasstutzeri的od600nm值为0.15时，缓慢加入1％的半胱氨酸(提供硫源)和1mmol/lcdcl2(提供cd²⁺)，使菌液中合成cds，构建pseudomonasstutzeri-cds杂化体系；

(3)将pseudomonasstutzeri-cds杂化体系以5000r/min离心分离8min，取沉淀转接至无电子供体培养基中，pseudomonasstutzeri的负载量为100％，加入乳酸钠作为牺牲试剂，使其终浓度为1％，并于培养基中加入含有硝酸盐氮的污水，硝酸盐氮的终浓度为14mg/l；

(4)在30℃恒温条件下，利用led紫光灯(30mw/cm²)，研究牺牲试剂乳酸钠在步骤3pseudomonasstutzeri-cds杂化体系的水体脱氮性能。

为了分析不同牺牲试剂乳酸钠、乳酸、半胱氨酸在pseudomonasstutzeri-cds杂化体系的水体脱氮性能，还设置了两组对比实验，只是将牺牲试剂乳酸钠分别换成了牺牲试剂乳酸、半胱氨酸，其他操作均相同。

结果显示，乳酸钠、乳酸、半胱氨酸均能作为牺牲试剂，被pseudomonasstutzeri-cds杂化体系利用，从而光照还原硝酸盐氮，达到水体脱氮，其中以半胱氨酸为牺牲试剂时硝酸盐还原能力最强，其动力学常数高达0.2522。

(图2)。

实施例3

(1)将pseudomonasstutzeri以1％的体积比接种至ph为7.0的mediai培养基中，调节培养基，30℃恒温培养；

(2)当步骤1中pseudomonasstutzeri的od600nm值为0.15时，缓慢加入1％的半胱氨酸(提供硫源)和1mmol/lcdcl2(提供cd²⁺)，使菌液中合成cds，构建pseudomonasstutzeri-cds杂化体系；

(3)将pseudomonasstutzeri-cds杂化体系以5000r/min离心分离8min，取沉淀转接至无电子供体培养基中，pseudomonasstutzeri的负载量为100％，投加乳酸钠作为牺牲试剂，使其终浓度为1％，并于培养基中加入含有硝酸盐氮的污水，硝酸盐氮的终浓度为14mg/l；

(4)在30℃恒温条件下，利用led紫光灯(30mw/cm²)，对步骤3的杂化体系进行光照还原硝酸盐氮，从而达到水体脱氮。

为了研究不同浓度cd²⁺对pseudomonasstutzeri-cds杂化体系的水体脱氮性能的影响，还设置了多种对比实验，只是使用不同cd²⁺浓度，如0.05mm、0.1mm、0.5mm、2mm，其他操作均相同。

结果显示，pseudomonasstutzeri-cds杂化体系的水体脱氮性能随着cd²⁺浓度增加而先提高而后降低，当cd²⁺浓度为1mm时硝酸盐还原能力最强，其动力学常数高达0.0912(图3)。

实施例4

(1)将pseudomonasstutzeri以1％的体积比接种至ph为7.0的mediai培养基中，调节培养基，30℃恒温培养；

(2)当步骤1中pseudomonasstutzeri的od600nm值为0.15时，缓慢加入1％的半胱氨酸(提供硫源)和1mmol/lcdcl2(提供cd²⁺)，使菌液中合成cds，构建pseudomonasstutzeri-cds杂化体系；

(3)将pseudomonasstutzeri-cds杂化体系以5000r/min离心分离8min，取沉淀转接至无电子供体培养基中，pseudomonasstutzeri的负载量为100％，投加乳酸钠作为牺牲试剂，使其终浓度为0.1％，并于培养基中加入含有硝酸盐氮的污水，硝酸盐氮的终浓度为14mg/l；

(4)在30℃恒温条件下，利用led紫光灯(30mw/cm²)对步骤3的杂化体系进行光照还原硝酸盐氮，从而达到水体脱氮。

另设比较组，改pseudomonasstutzeri-cds负载量25％、50％、200％、400％，其他操作均相同。

结果显示，pseudomonasstutzeri-cds杂化体系的水体脱氮性能随着pseudomonasstutzeri-cds负载量的增加而提高，当负载量为200％时硝酸盐还原能力最强，其动力学常数高达0.1381(图4)。

实施例5

(1)将pseudomonasstutzeri以1％的体积比接种至ph为7.0的mediai培养基中，调节培养基，30℃恒温培养；

(2)当步骤1中pseudomonasstutzeri的od600nm值为0.15时，缓慢加入1％的半胱氨酸(提供硫源)和1mmol/lcdcl2(提供cd²⁺)，使菌液中合成cds，构建pseudomonasstutzeri-cds杂化体系；

(3)将pseudomonasstutzeri-cds杂化体系以5000r/min离心分离8min，取沉淀转接至无电子供体培养基中，pseudomonasstutzeri的负载量为100％，投加乳酸钠作为牺牲试剂，使其终浓度为1％，并于培养基中加入含有硝酸盐氮的污水，硝酸盐氮的终浓度为14mg/l；

(4)在30℃恒温条件下，改变光照强度20、40、60、80、100mw/cm²，利用氙灯，对步骤3的杂化体系进行光照还原硝酸盐氮，从而达到水体脱氮。

结果显示，pseudomonasstutzeri-cds杂化体系的水体脱氮性能随着光照强度的增加而先提高而后降低，当光度强度为80mw/cm²时时硝酸盐还原能力最强，其动力学常数高达0.5812(图5)。

实施例6

(1)将pseudomonasstutzeri以1％的体积比接种至ph为7.0的mediai培养基中，调节培养基，30℃恒温培养；

(2)当步骤1中pseudomonasstutzeri的od600nm值为0.15时，缓慢加入1％的半胱氨酸(提供硫源)和1mmol/lbicl3(提供bi³⁺)(或者直接加入纳米半导体bi2s3)，使菌液中合成终浓度为1mmol/lbi2s3，构建pseudomonasstutzeri-bi2s3杂化体系；

(3)将pseudomonasstutzeri-bi2s3杂化体系以5000r/min离心分离8min，取沉淀转接至无电子供体培养基中，pseudomonasstutzeri的负载量为100％，投加乳酸钠作为牺牲试剂，使其终浓度为1％，并于培养基中加入含有硝酸盐氮的污水，硝酸盐氮的终浓度为14mg/l；

(4)在30℃恒温条件下，利用led紫光灯(30mw/cm²)，对步骤3的杂化体系进行光照还原硝酸盐氮，从而达到水体脱氮。

结果显示，pseudomonasstutzeri-bi2s3杂化体系反硝化，120h内14mg/l硝酸盐氮完全被还原。

实施例7

(1)将pseudomonasstutzeri以1％的体积比接种至ph为7.0的mediai培养基中，调节培养基，30℃恒温培养；

(2)当步骤1中pseudomonasstutzeri的od600nm值为0.15时，加入物质使菌液中合成cdse(或者直接加入纳米半导体cdse)，使cdse终浓度为1mmol/l，构建pseudomonasstutzeri-cdse杂化体系；

(3)将pseudomonasstutzeri-cdse杂化体系以5000r/min离心分离8min，取沉淀转接至无电子供体培养基中，pseudomonasstutzeri的负载量为100％，投加乳酸钠作为牺牲试剂，使其终浓度为1％，并于培养基中加入含有硝酸盐氮的污水，硝酸盐氮的终浓度为14mg/l；

(4)在30℃恒温条件下，利用led紫光灯(30mw/cm²)，对步骤3的杂化体系进行光照还原bi2s3，从而达到水体脱氮。

结果显示，pseudomonasstutzeri-cdse杂化体系反硝化，72h内14mg/l硝酸盐氮完全被还原。

以上所述仅为本发明的优选实施方式而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。