专利名称：基于微毛细管的检测系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于确定流体试样中组分的基于微毛细管的测试系统，所述试样优选体液分析物、尤其是血液中的葡萄糖。
所叙述的测试系统的特征是，将流体试样、例如全血或组织间液通过毛细力吸入例如在色谱分析中所使用的毛细管内。
在家庭使用者部分中自诊断尤其是血糖在许多年前就已成为现有技术了。
然而，为进一步改进准确性和再现性、尤其是操作和使用者的友善性，现有产品的持续的进一步开发仍是需要的。基于电化学检测反应的生物传感器和其中对颜色反应进行反射评价的膜基测试条是现有技术。
关于对使用者的友善性，尤其是通过所谓“吸入”机理抽吸病人血液的生物传感器认为是有益的。
为获得再现性结果，在电化学传感器的情况下必须用血液覆盖全部电极区(参见例如USP5759364)，为实现该目的，在目前公知产品的情况下，通常需要至少3μl或更多的血液。
在进行反射评价的膜基测试条的情况下(例如USP5453360)，通常需要更大量的血液。
关于再现性和准确性，除传感器几何形状和膜形态的恒定以外，在测试元件中生物化学反应物体系的均匀应用是特别起决定作用的。
这里，电化学生物传感器包括例如通过丝网印刷或微量移液管移液将酶/介体配剂涂覆在传感器电极区。
在比色测试条系统中，用酶/指示剂配剂来浸渍或涂覆微孔膜。
由色谱分析尤其是气相色谱分析(GC)已公知许多种变化形式的微毛细管，例如参照Kurt Grob的“Making and Manipulating CapillaryColumns for Gas Chromatography(用于气相色谱分析的毛细管柱的制备和操作)”，Heuthing Verlag，1986。
现已意外发现，应用基于例如在色谱分析中所使用的微毛细管柱上述目标标准可得到显著的进展。
因此，本发明涉及微毛细管用于通过毛细力采样的测试系统中的用途。
按照另一方面，本发明还涉及用于流体试样的测试系统，其中分析物的采样通过微毛细管来实现。优选分析物的采样和检测在微毛细管中进行。
本发明的测试系统具有的优点是，试样流体可不与测试结构(Testformats)的粘合剂或粘结剂接触。
适用的微毛细管尤其是由气相色谱分析所公知的。在毛细管几何形状和试剂对毛细管内侧的涂覆来说，这种气相色谱分析(GC)微毛细管满足高标准的再现性和准确性，所述试剂例如为用于亲水固定相的聚乙二醇或用于憎水固定相的聚硅氧烷。适用的微毛细管也是毛细管电泳所公知的。
本发明使用的微毛细管的尺寸和材料性能使得它们通过毛细力来抽吸基本为含水的试样流体。吸入的试样体积优选小于3μl，特别优选小于1μl，更特别优选0.5μl或更少。
本发明使用的微毛细管优选具有圆的横截面。微毛细管的内径优选小于500μm，特别优选小于250μm，更特别优选为25μm至200μm。
所使用的微毛细管的长度优选最高达2cm，特别优选最高达1cm，更特别优选约0.5cm。
在本发明微毛细管的用途的情况下，重要的是，在对应的测试结构中所含的微毛细管根据在各种情况所使用的测量原理来准确吸入限定的试样体积；这尤其应用于测定反应终点，例如酶显色反应。
GC或毛细管电泳柱已证实适用于本发明的目的，所述GC或毛细管电泳柱尺寸通常为，使得尽管少量的试样流体、如0.5μl血液或组织间液在长度为1或更小的毛细管的情况下足以进行功能测试。
由于试样体积小，本发明的毛细管柱还满足所谓的“最小侵入(minimal Invasive)”试验试剂盒的需求，后者据说是特别有益的，尤其是对病人的疼痛小。
所述微毛细管由在对应条件下为惰性的适用材料构成。这些材料的实例是石英玻璃、标准玻璃和金属，如钢。
微毛细管载有内涂层，其在色谱分析中也称为固定相。由GC柱所公知的许多材料原则上适用于作为这一涂层。适用的亲水材料是，如具有各种分子量的聚乙二醇(Carbowax)和聚乙二醇衍生物，例如Carbowax 4000单硬脂酸酯。其它亲水固定相可由聚乙烯亚胺、聚丙二醇或环糊精来制备。
憎水性材料也适于作为憎水固定相的内涂层，其中硅氧烷聚合物和硅氧烷共聚物是最常见的。实例有二甲基聚硅氧烷、(50％氰丙基)-甲基聚硅氧烷、(50％三氟丙基)-甲基聚硅氧烷或5％苯基聚碳甲硼烷聚硅氧烷。
关于固定相的涂覆(微毛细管柱内涂层)，可参照由GC柱公知的标准方法。如在上述文献中所述(K.Grob，1986)，原则上有两种方法。这两种方法是静态涂覆和动态涂覆。60至100m长度的毛细管可通过这些方法来进行涂覆。如上述文献所述，固定相聚合物也可通过共价连接到石英柱的表面上。
除通用GC柱外，所谓的PLOT(多孔层开口管状)柱也可用作本发明的微毛细管。在PLOT柱中，例如三氧化二铝、二氧化硅凝胶、分子筛或多孔聚合物用作固定相。
适用于本发明测试部件的其它的微毛细管柱类型是毛细管电泳柱，其也可有很小内径如25μm。
通用的毛细管柱通常由上述石英(石英玻璃)构成。先前使用的玻璃柱已在色谱分析中变得不重要了，但由于其突出的透明性，对本发明的测试部件具有一定的重要性。
通常在石英柱外侧提供有对高温稳定的黄/褐色聚酰亚胺层。相应的，消除了石英毛细管的脆性，并导致易于操作的柔性的系统。
本发明的测试部件需要良好的透明度，特别是在比色评价的情况下。因此代替着色的聚酰亚胺涂层也可使用透明、无色的聚合物，如聚硅氧烷、丙烯酰基聚合物、聚乙酸乙烯基酯、聚碳酸酯、聚酰胺或聚醚聚砜。如必要，为进行光学评价，还可在对应的微毛细管区中除去有干扰的涂层。
微毛细管作为本发明试验试剂盒的重要部件的根本的必要条件是它们的借助于毛细力抽吸全血或其它测试流体的性能。
意外发现，具有亲水性涂层的柱，如涂覆聚乙二醇(Carbowax)或三氧化二铝的柱，可优异地抽吸血液，而用憎水性涂层改性的柱(如聚硅氧烷改性)不具有这一性能。
但后一类型的柱可通过用特殊的表面活性剂进行后处理来为这一目的进行改性。
适用的表面活性剂是离子型表面活性剂、如SDS，两性离子型表面活性剂，如磷脂，和非离子型表面活性剂、如Pluronic或氟表面活性剂(如Bayowet FT219)。
流体试样通常基本是含水的流体，尤其是体液。实例是尿、组织间液和血液。
通常可测定的分析物例如是葡萄糖、胆红素、酮、pH、蛋白质和胆固醇。
检测试剂优选包含于微毛细管的内涂层中(固定相)中。通常经微毛细管壁来实现测量，例如比色。关于对分析物专有的检测试剂的组合，可使用在诊断学中建立的体系，如通过酶或非酶显色反应或通过电化学方法，其中显色反应，尤其酶显色反应是优选。因而，可利用各种酶控显色反应例如来定量检测血液葡萄糖，对于这里叙述的毛细管试验试剂盒来说，优选氧无关的酶反应。
例如，具有四唑指示剂的葡萄糖脱氢酶体系或己糖激酶体系适用于葡萄糖检测。
对应反应物的加入可或者经用于固定相的配剂、通过随后呈涂层涂覆在固定相上或通过这些变体的组合来实现。
所述检测反应均可异相进行，即在固定相中进行，或者加入到固定相中的检测反应物可溶解于试样流体中，在这种情况下在流体相中进行均相反应并可进行比色监测。
可通过反射来评价显色反应，特别是使用PLOT柱，例如以三氧化二铝作为固定相，或者在透明毛细管系统的情况下以透射来进行评价，例如用Polywax作为固定相的GC柱，可检测反应动力学或反应终点。
根据指示剂的类型，显色反应的透射测量还可在全血试样中进行，而不预先分离掉红血球。
关于实际操作，本发明的微毛细管系统应组合在相应的结构中。适用的测试结构原则上是本领域技术人员所熟知的。优选的是对微毛细管中的酶显色反应进行光学评价的那些结构。
如
图1和2所示，借助于聚合物膜和双面粘合带制备出的也用于如下实验的“测试条结构”。
图1所示为微毛细管测试结构的横断面图，所述结构包括覆盖膜(1)、隔膜(2)、双面粘合带(3)、微毛细管(4)和基底膜(5)。
图2所示为微毛细管测试结构的俯视图。
测试条的设计还可使得，通过适当穿孔，在进行光度学评价的区域中不存在膜或粘合带。
顶层覆盖膜可是透明的，以使得可观察到毛细管的注入过程。
使用在毛细管柱端部具有作为检查窗口的切口的含填料的(白)覆盖膜，也可实现同一目的，即记录试样流体对毛细管的完全流填过程。
除医学诊断外，本发明的微毛细管系统也可应用于高通量筛选领域。
因而，可使用垂直测试系统，其可对应排布为与微滴定(microtitre)板的几何形状平行，在浸入各微滴定板室时从中抽吸试样流体，并引发对应的测试反应。
实施例实施例1制备酶/指示剂配剂1.1.组分指示剂噻唑基蓝溴化四唑鎓(ThiazolylblauTetrazoliumbromid)(MTT)甲基噻唑基二苯基-四唑鎓溴化物(Fluka 88415)酶葡糖脱氢酶(GDH 35U/mg)Diaporase(54U/mg)辅酶NAD(二磷酸吡啶核苷酸单水合物)表面活性剂Phospholipon 90G(Rhone Poulenc)1.2.备用液指示剂溶液在甲醇中10％MTT酶/辅酶溶液在各种情况下在磷酸盐缓冲剂pH7.0中的1M溶液表面活性剂溶液在异丙醇中10％ Phospholipon 90G1.3.浸渍配剂在搅拌条件下混合如下组分，得到澄清溶液。
MTT溶液11.43gGDH溶液28.57gDiaporase溶液28.57g
NAD溶液28.57gPhospholipon溶液2.86g实施例2涂覆PLOT柱微毛细管柱HP-PLOT Al2O3“KCl”去活化，内径0.32mm如在上述文献(K.Grob)中所述，借助于注射器来对20cm长的PLOT柱段进行充填。
在约两分钟后，用氮气吹扫，之后用热空气(40℃)对所述柱进行干燥。
实施例3血的抽吸行为1cm长的带涂层的微毛细管段(来自Macherey-Nagel公司的涂覆Polywax的GC柱，内径320μm)抽吸全血没有问题(＜1秒)。
用葡萄糖溶液进行测试在各种情况下用如下水溶液对1cm长制备的毛细管柱进行测试0、25、100和250mg/dl的葡萄糖。
在抽吸葡萄糖溶液时，增加葡萄糖浓度观察到强度增加的蓝色。
为评价显色反应，通过应用火焰来除去褐色聚酰亚胺涂层。
权利要求
1.微毛细管在通过毛细力采样的的测试系统中的用途。
2.如权利要求1的用途，其中所述微毛细管在内表面上载有涂层并含有对分析物的测试系统。
3.如权利要求1或2的用途，用于检测血中的葡萄糖。
4.如前述任一权利要求的用途，其中所述微毛细管由玻璃或石英制成。
5.如前述任一权利要求的用途，其中所述微毛细管的内径为500μm或更小。
6.用于流体试样的测试系统，其中通过微毛细管来实现采样。
7.如权利要求6的测试系统，其中在微毛细管中进行采样和分析物的检测。
8.如权利要求6或7的测试系统，其中抽吸的试样体积小于3μl。
全文摘要
本发明涉及基于微毛细管的的测试系统，用于确定在流体试样中组分的存在，所述组分优选为在体液中的分析物，尤其是在血中的葡萄糖。
文档编号B01L3/00GK1411395SQ01805399
公开日2003年4月16日 申请日期2001年2月13日 优先权日2000年2月25日
发明者K·希尔登布兰德 申请人:拜尔公司