专利名称：：电音喷离子化方法和用于分子的大气离子化设备的制作方法
技术领域：
：本发明通常涉及一种用于在大气压下从液体形成样品材料例如分子，包括生物分子例如蛋白质的气态离子的设备和方法，更特别地涉及一种设备和方法，其中包含样品材料或者分子的液体从毛细管的末端发射，该毛细管在其末端维持电位以建立电场，而超音速环形气体喷射对准毛细管的末端以产生带电荷的超细微粒，该超细微粒在大气压力下通过气体的绝热膨胀和液体的强烈蒸发形成材料或者分子的气态离子。
背景技术：
：电喷离子化(ESI)质谱1，2已经迅速成为结构生物化学领域的重要工具。该技术可以使折叠的蛋白质离子化，有时对于在完整三维结构中有小的改变的证据。所得离子可以随后在气相中使用现代质谱工具进行研究。3-8不仅单一蛋白质可以使用这种方法论进行研究，而且有时多种蛋白质和蛋白质-配位体配合物也可以完整地离子化，尽管彻底研究的实例的数量要少得多。近来，这种如整个核多糖体9的配合物结构的离子化已经被证实。在气相中蛋白质配合物可以借助级联的或者多步质谱进行研究。10-12在这种步骤中，初始配合物可以经受连续的离解过程，以揭示各个组分的分子量。与大多数其他技术不同，质谱并不局限于检测特定种类的分子配合物组分，例如用荧光蛋白标记或者否则使得对于分析方法可见的那些。蛋白质和其他生物相关的大分子体系在生理学条件下通常表现出一种或者很少数量的构造，这种构造是对于承担一种意义明确的生化功能的必要特征。通常认为液相结构与在气相中最稳定的构造不同。3，4，9，13-15因此，对于开发出成功的质谱技术的主要要求是保持这些亚稳态溶液结构，而这要求最小化该离子的内能以使得保持气相解重叠率或者离解率尽可能低。这种任务通常通过在制备用于质谱的溶液时避免变性条件和在仪器的源和大气界面区域小心地调节压力和透镜电位值来实现。10，16这些工序的主要目的在于去溶剂化蛋白质离子并引导它们进入质谱的高真空区域而不影响保持高度有序结构的非共价相互作用。这一目标通常通过在大气界面中施加相对高压和在整个透境系统施加低电位梯度来实现16。高气压提供了在仪器的第一真空区的高碰撞频率，这保持离子在低温下通过碰撞冷却并同时促进有效离解。然而，因为溶液包封和离子构造都是由非共价相互作用保持，经常在保持完整结构的条件和那些需要完全离解的条件之间得到妥协。此外，允许温和地离解的仪器设定通常对于离子转化效率不是最优化的，因此仪器的灵敏度可能被严重降低。纳米喷雾(nanospray)17，18是经常被选用来取得温和的离解的离子化方法，并同时也提供用于少量有价值的样品的高离子化效率。不同于传统的商业上可获得的ESI离子源，18纳米喷雾适合于生理pH下含水缓冲液并且由于其高的离子化效率该方法的样品消耗量降低了一个或两个数量级。高离子化效率和有效的离解是通常有助于低溶液流速的特性，已知低溶液流速降低初始产生的带电荷液滴的尺寸。较小的初始液滴经受较少的库仑分裂和每个液滴蒸发较少的溶剂，这导致非挥发性基质组分在产生实际气态蛋白质离子的最终纳米液滴中的较低浓度。较小的初始液滴尺寸还加速离子形成并通过该方式液滴的较高份额将实际上被完全去溶剂化以提供对于质量分析可用的离子。通常认为纳米喷雾提供比ESI更好的离解效率。由于显著较低的样品流速，这种特性有助于从较小液滴中更有效地挥发溶液和在大气界面上的较低溶剂蒸汽负载。该固有的良好离解效率不要求在大气界面上施加苛刻的离解条件(高温、高锥电压等)，其进而增强了包括非共价配合物的易损生化实体的存活。尽管有这些优点，纳米喷雾质谱强烈依赖于所用的纳米喷雾尖端；从尖端到尖端的谱图重现性弱。另外，尖端的几何形状在操作期间可能会由于弧烧或断裂而改变。纳米喷雾的另一难点在于在喷雾过程中缺少控制在实践中喷雾不能调节，其仅能通过改变高电压来打开和关闭。19，20通常要求高的流速和极端的pH值。在纳米喷雾和传统加压流动(压缩空气辅助的电喷射)的情况下，绝对灵敏度不仅受到各个峰的宽度(单位为m/z)的影响，而且受到整个电子价态分布的形状和宽度的影响。电子价态分布的形状经常用作确定离子化过程中蛋白质的解折叠程度的分析工具。21-26在高电子价态下宽的电子价态分步通常伴随着解折叠的结构，而在低电子价态下窄的分布被处理为在气相中的天然或者类似天然的折叠离子结构的标志。由Kebarle等人最近开发出来的模型基于在蛋白质分子上的可能带电荷位点的相对表观气相碱度(GB)评价蛋白质离子的最大电荷数26-29。这种模型描述了在电喷雾中通过在每一带电荷位点上形成具有缓冲分子的质子束缚配合物并接着离解这些配合物来由缓冲溶液形成蛋白质离子。这些配合物离解的支化率取决于该缓冲分子(例如在铵缓冲液下为氨)的相对表观GB相对于蛋白质带电荷位点的相对表观GB。蛋白质上特定位点的表观GB值可以基于化学部分的固有GB值、蛋白质分子的介电常数和电荷的空间分布进行确定，其中最后一个因素涉及蛋白质离子的大小。所观察的电荷状态分布是这些因素的结果离解的温度和发生在质谱的大气界面或在通过离子光学路径期间的离子/分子反应导致的任何进一步电价减少。原则上，喷雾过程和样品的充电可以被分离，和初始带电的液体可以在开始时通过不同的喷雾技术被细分散。这种方法通过压缩空气喷雾方法在商用ESI源中广泛采用30，通常是为了粗略分散来自标准液相色谱的大量液体样品。因为d～1/vg2，其中d是液滴的平均直径，vg是在高气体线速度和高气体/液体质量流速比下喷雾气体的线速度，理论上可以取得能与纳米喷雾相比的液滴大小。31尽管由缓冲到生理pH值的水溶液供应的配合物样品材料例如蛋白质的完全离子化已经达到了在质谱的还原气氛下能够在大气压下采样的程度，当材料为缓冲到生理pH值的水溶液中的蛋白质时，气态离子化样品以产出该溶液的各种组分的基本上单一物质在之前是未知的。对ESI的仔细研究确定实际上离子化液滴是通过现有技术方法制备的。在液滴被加热和有时经受多次碰撞后，造成蛋白质样品的某些解折叠，这导致不理想的宽电荷分布，在质谱仪中该离子化液体进行采样并完成蒸发。在质谱外完全气态离子化来自溶液的样品材料在之前未能完成，尽管通过激光辅助喷雾离子化方法已经在这一方向上取得了进步。32发明目的和发明概述本发明的目的在于提供用于在大气压下从含所述材料的液体产生样品材料的气态离子的设备和方法。本发明的另一目的在于提供用于在液体中离子化样品材料例如分子的离子发生器设备，该设备包括用于在一端接收液体而在另一端以液流发射该液体的样品毛细管，用于在毛细管的一端提供电压以建立电场的电压源，和环绕该毛细管并与该毛细管保持间距以形成环状间隙的外管，加压气体流过该环状间隙以形成以超音速流动的环绕液体流的气体喷射，形成超细带电液滴，该液滴通过气体的绝热膨胀和液体蒸发在大气压下形成材料或分子的气态离子。该设备还可以包括至少一个(i)将气体流速相对于所输送的液流速度超过超音速阈值的装置，(ii)调节电位强度的装置，(iii)调节第一毛细导管末端相对于第二毛细导管末端的位置的装置和(iv)调节设备操作温度的装置。本发明提供了一种从溶液中的样品材料产生基本上单一物质的气态离子的方法，该方法包括在电位下将该溶液输送到相对于该液体至少以超音速移动的气流中。提供了一种离子发生器设备，其包括用于接收具有在溶液中的材料样品的液体并在另一端发射液流的毛细管，用于在该毛细管的另一端产生电场的装置和用于在至少350m/s的速度下引导气体的环状喷射流经第一毛细管的另一端，与发射流体为同一方向，由此产生带电的超细液滴，该超细液滴通过气体的绝热膨胀和液体的强烈蒸发提供该样品材料的气态离子。具有可以在大气压下采样离子的采样端子的质量分析仪被安置以接收由本发明的离子发生器形成的气态离子并提供离子化样品材料的质量分析。附图简述当结合本发明附图阅读下面的描述时，将能够更清楚地理解本发明图1示意性示出了包含本发明的离子发生器设备的质量分析体系。图2示意性示出了本发明的离子发生器设备的一个实施方案的纵向横截面。图3牛蛋白激酶A催化亚单位(在10mM含水乙酸铵中为200nM，pH7.8)的(a)ESSI谱图和(b)在线纳米喷雾谱图。图4牛蛋白激酶A催化亚单位(在10mM含水乙酸铵中为200nM，pH7.8)在存在100μmATPMg盐时的ESSI谱图。该酶也在两个位点经受自发磷酸化，这导致在观察到的m/z的进一步位移。图5通过离子化10mM[Fe(bipyridl)2]2+并将一张纸暴露在该喷雾下记录作为与喷雾尖端间距离的函数的ESSI喷雾的横截面。喷雾参数1μL/min样品流速，3L/minN2喷雾气体，2kV喷雾电位。图6作为喷雾电位的函数的母鸡蛋白溶菌酶离子的(a)信号强度和(b)平均电荷，其中在ESSI和纳米喷雾的情况下使用pH7.8的溶于10mM乙酸铵的0.01mg/mL溶菌酶。图7作为喷雾气体流速的函数的牛PKAc离子的(a)作为理论值的百分数的在半峰高处的峰宽，(b)总强度(峰面积)。图8a-d牛细胞色素C的谱图，0.01mg/ml在10mM含水乙酸铵中，在不同条件下获得。图9a-b作为喷雾尖端和大气界面之间的距离的函数的母鸡蛋白溶菌酶离子的平均电荷和峰宽。图10a-b作为(a)NaCl浓度和(b)丙三醇浓度的函数的母鸡蛋白溶菌酶离子的强度；(c)在相同体系中作为NaCl浓度的函数的基峰宽，其中对于ESSI实验使用5μmID的尖端和对于纳米喷雾实验使用2μmID的尖端。图11含有10mM乙酸铵(pH7.1)和6mMPIPES缓冲液的咪唑-3-丙三醇磷酸酯合酶(IGPS)-N-[5，-磷核酮糖基]-亚胺甲基]-5-氨基咪唑-4-羧酰胺核糖核苷酸(1，特定抑制剂)混合物的ESSI谱图。图12(a)溶菌酶(100nM在10mM乙酸铵水溶液中，pH7.8)以30cm的间距喷雾的ESSI谱图。(b)类似实验，喷雾使得与哌啶饱和蒸汽压相互作用。发明详述提供了一种配备有可变电位和高速喷雾气体的微型电喷雾33体系，并将该体系与非常完备的微型ESI和纳米喷雾ESI技术进行比较。由于其利用类似于Hirabayashi的音速喷雾技术34，35的超音速气体喷射，这种新方法称为电-音(electro-sonic)喷雾离子化或者“ESSI”。这种新方法在低温下产生超细的初始液滴(由喷雾气体的绝热膨胀和溶液的强烈蒸发造成)和随后该方法对在生理条件下离子化的蛋白质样品得到窄峰形状和窄电子价态分布。参见图1，显示了连接根据本发明的大气压电音喷离子化设备(ESSI)11以从附加装置例如液相色谱12接收液体形式的样品材料。现在详细描述的电音喷离子化设备在大气压下形成样品材料的气态离子13并将其输送到例如合适的质量分析仪14。用于实施现在描述的实验的质量分析仪14的前端部分在图1中示意性示出。图示的前端部分是从ThermoFinniganCorporation，ModelLCQClassic购买的质谱仪的前端部分。所述离子经加热的毛细管端子传输进入第一室16，该室保持较离子化源11的大气压低的压力(大约1托)。由于压力差，离子和气体流经加热的毛细管17进入室16。毛细管的末端被管透镜(tubelens)18环绕，该管透镜提供了使离开该毛细管的离子束对分离器孔19聚焦的静电场。所述离子随后在高真空下经过第二区域21并由离子导流器22引导通过第二分离器23进入质量分析仪。对于本领域技术人员显而易见的是，该ESSI设备可以和任何类型的质量分析仪一起使用，包括磁性区段、四级杆、飞秒、离子阱(2D和3D)、FT-ICR、轨道阱或它们的任意组合。此外，该源与任何类型的离子流动光谱仪兼容。现在具体参见图2，该图是电音喷离子化设备11的放大图，所述设备包括具有螺纹端的T零件24。采样毛细管26由套圈27支撑并沿着该零件在其上延伸。第二套圈28支撑第二毛细管或管29，该毛细管或管具有大于采样毛细管26的外径的内径，以提供采样毛细管和外部毛细管或管之间的环状间隙。采样毛细管的末端31延伸超过外部毛细管的末端。超过外部毛细管的采样毛细管的延伸量可以通过相对于外部毛细管移动采样毛细管进行调节，反之亦然。在操作中调节所述距离以取得最佳操作条件。T零件的其他零件与氮气罐或者其他气体罐32经高压调节器33相连，该高压调节器调节气体进入T零件和通过环绕液体毛细管的环状间隙离开的气体压力。每个套圈通过螺母拧入T零件进行夹持。根据本发明，典型的电音喷离子化设备的尺寸如下所述采样毛细管-5-100μmID，0.15mmOD外部毛细管-0.025cmID，0.40mmOD液体毛细管尖端和外部毛细管尖端之间的距离-0.1-0.2mm施加到液体毛细管和液体上的电压-±0-4kV气压-大约8-25巴样品流速-0.05-50mL/分钟毛细管的材料优选是熔融二氧化硅，尽管也可以使用其他类型的材料，优选的是采样毛细管是传导性的，由此电压可以通过毛细管施加到所述尖端。外部毛细管可以是管或者其他合适的材料。然而，已经发现熔融二氧化硅是合适的。在根据本发明的操作中，对采样毛细管施加电压，由此在该毛细管的末端建立电场。使在液体中的样品材料(例如包括生物分子例如蛋白质的分子)流经该毛细管并作为液体流从该毛细管的末端发射。所述气压经调节使得在液体毛细管和外部毛细管之间的环状间隙末端提供以大于350m/s、优选330-1000m/s、更优选400-700m/s的速度的环状喷射，由此产生带电的超细液滴或者微粒，这些超细液滴或微粒随后经受气体的绝热膨胀和液体的强烈蒸发以在大气压下提供样品材料的气态离子。所述的所有谱使用配备有类似于电音喷离子化设备的ESSI源(在图1中示出)或者纳米喷雾源的ThermoFinniganLCQClassic质谱进行记录。对液体样品通过铜鳄鱼夹施加0-4kV的电压，该铜鳄鱼夹固定到用于样品注入的注入器的不锈钢尖端上。实验进行的温度是室温；然而，所述温度范围是从环境温度到溶剂的沸点，即对于水来说是20℃-100℃。除非另外指出，所述离子源对质谱仪14的大气界面仔细校准以获得最高的灵敏度和最窄的峰宽。典型的仪器参数总结于表1。表1用于LCQ仪器的仪器设定纳米喷雾谱通过使用PicoTipTM的内部直径为1±0.5μm或2±0.5μm的电喷雾尖端(NewObjectiveInc.，Woburn，MA)获得。溶菌酶、细胞色素c、醇脱氢酶、牛血清清蛋白、肌红蛋白、脱辅基肌红蛋白和胰岛素从Sigma(StLouis，MO)购买，己糖激酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶从Worthington(Lakewood，NJ)获得，蛋白激酶，催化亚单位(PKAc)由Promega(Madison，WI)获得。PKAc是使用MicroconYM-10离心分离单元(Millipore，Billerica，MA)从350mMKH2PO4初始溶液置换200mM乙酸铵溶液的缓冲液。其他蛋白质是简单地溶于含水乙酸铵缓冲液。缓冲液的pH值经添加1M氢氧化铵或者乙酸水溶液调节。牛蛋白激酶A催化亚单位(PKAc)的电子喷雾质谱图和用于对比目的的纳米喷雾质谱图在接近生理溶液相条件下记录(pH7.8，含水乙酸铵缓冲液)，分别在图3a和3b中示出。在两个谱图间在观察到的峰宽度和电子价态分布方面具有显著区别。如在表2中所总结的，对于一些其他蛋白质也观察到类似的现象。在ESSI的情况下，对于丰富(相对丰度大于10％)的蛋白质离子所观察到的半高全宽(FWHM)值为由同位素分布计算得出的理论值的100-150％，而在纳米喷雾离子化的情况下，典型的FWMK值比理论值高2-8倍。表2使用ESSI和纳米喷雾(nS)的蛋白质谱图特性比较*由于仪器的高质量限定没有观察到其他离子所述两种离子化方法的比较的第二点是电子价态分布。取决于所研究的蛋白质，使用ESSI所观察到的电子价态分布与使用纳米喷雾记录到的电子价态分布相似或者更窄。在大多数情况下，在离子化时由于其他气态离子没有超过25％的相对丰度，单种电子价态在ESSI谱图上占主导地位。在纳米喷雾的情况下，不论是在我们的实验中还是在文献数据中，都仅在少数蛋白质中观察到相似的情况。相对于ESSI的情况下几乎完全除去溶剂添加物，特定生物配合物的存活是优异的。这一结果由图4得以说明，图中显示，蛋白激酶A催化亚单位通过加入过量ATP/Mg盐转化为其ATP/Mg加合物(在两个位点发生自发磷酸化)，导致在所观察到的m/z值的进一步迁移。所得配合物使用ESSI完整地输送到气相中。应注意，该配合物的存活率高于95％，而且高的ATP和Mg浓度在谱图特性上没有可观察到的影响。对于其他蛋白质配体配合物包括溶菌酶-六-N-乙酰基-壳六糖(chitohexaose)，醇脱氢酶-NADH和己糖激酶-葡萄糖取得了类似的结果。ESSI和纳米喷雾的特性特征示于表3。表3ESSI的分析性能与纳米喷雾的比较尽管纳米喷雾的绝对响应因子较好，这两种工艺的检测限是可相比较的(对于相同的样品，纳米喷雾得到较高的信号强度但S/N比率相似)。响应因子之间的差异与ESSI的喷雾发散有关，其数据在图5中展示。使用0.5mm的采样口(ThermoFinnigan加热毛细管的标准值)，纳米喷雾液滴的50-90％在最优条件下进入仪器，而ESSI的采样效率仅为5-25％。这可能通过使用具有不同几何形状的大气界面来克服这种缺陷。在不同浓度下通过离子化蛋白质溶液获得响应因子。在表3中显示的检测限值反映了对于最高丰度的蛋白质离子观察到信噪比为3∶1的蛋白质浓度。在ESSI和纳米喷雾的情况下高电压(HV)下信号强度和谱图特性的依赖型是显著不同的(图6a和图6b)。因为喷雾形成和液滴充电是独立的过程，ESSI离子源在任何电压设定条件下产生离子，而在纳米喷雾的情况下只有在特定开始电压下喷雾是稳定化的。能够“调谐”电压对于ESSI是一个显著的实际优势。在0V下观察到纯的音速喷雾谱图，而且通过在低电压范围增加电位，ESSI中的强度和谱图特性(峰宽，平均电子价态)急剧改变。在不存在电场的情况下多电荷离子的出现在之前没有报导。在纳米喷雾的阈值附近，ESSI信号稳定，除了在强度上有微弱影响外，谱图对于典型蛋白质在0.8-4kV范围内是不依赖于电压的。因为ESSI在整个电压范围内产生可测量的离子电流，在这种情况下无需离子化的“点火”。ESSI的另一优点在于不存在弧烧，这可能是因为氮气的湍流阻止了电晕放电的形成。使ESSI最显著地区别于其他电喷雾变型方案的因素在于气体流速。ESSI峰宽和总信号强度对于喷雾气体流速的依赖性示于图7a和7b。峰宽随着喷雾气体流速的上升急剧下降，并收敛于理论值，即同位素包层的宽度。可以看出，峰宽的急剧变化发生在约0.35L/min的流速及以上，并在0.4L/min处变化最为剧烈。气体速度通过将体积流速除以在大气压下环状通道的横截面积计算得到。在ESSI设备中通常获得的数据1L/min代表943.14米/秒(m/s)。这种大于330m/s的流速适合实施本发明从而获得尖锐的峰。已经发现优选速度范围为400-700m/s。总强度(峰面积)随着喷雾气体流速升高而下降，尽管这种效果通过改善的峰形状部分得以平衡。喷雾气体流速的改变使初始液滴形成机理从纯电喷雾向纯气动喷雾迁移。增加的气体流速还通过气体的绝热膨胀改变了喷雾温度并允许更有效的溶液蒸发。在谱图特性上的改变伴随着这两个因素，而所观察到的信号强度下降是因为离开加热毛细管的离子的较高线速度。后一因素降低了管镜透镜-分离器体系的采样效率。ESSI离子化的又一值得注意的特征是谱图特性对于不同大气界面设定的弱依赖性，包括温度和电位梯度。在使用商用离子源的纳米喷雾或者ESI的情况下，去溶剂化效率和电子价态分布受到这些参数的强烈影响。在使用ESI或纳米喷雾离子化的情况下使用陡峭电位梯度(高管镜透镜或者锥电压)时，如图8a和b所示，平均电荷可能向较高值迁移。相应的ESSI数据(图8c和d)表现出较弱的影响。ESSI的谱图特性显示出对沿着轴的喷雾位置的强烈依赖性(图9a和9b)。在尖端太靠近于进入锥道时发生质谱峰变宽，并伴随有大量溶剂进入质谱仪，导致离子在仪器中再次溶剂化。这种解释受到分辨率依赖于样品流速的支持，这显示在高样品流速下去熔剂化程度同样变差(在表1中列出的条件下＞50μL/min)。在较大距离时，完全去溶剂化经常伴随着平均电子价态的少量迁移，意味着离子的电荷下降发生在大气压范围内。多电荷蛋白质离子在仪器的高压区域与溶剂和缓冲液分子相互作用时经受氢键键合的加合物形成和离解。由于从特定电荷位点的离子离解中性溶剂分子是可逆的过程而电荷降低则不是，尽管这些电荷位点具有高于任何其他种类的GB值，其将会经受缓慢的电荷降低24，26。尽管存在这种电荷降低过程，蛋白质溶液可以使用ESSI从大于3m(米)的距离喷雾，在通常情况下仍然得到具有S/N～30的信号。这种观察开辟了用于在大气压下研究生物化合物的离子-分子反应的新的可能性。ESSI的样品流速与纳米喷雾的样品流速重叠；然而，后者的平均样品消耗量通常较低，而这便于离线实验。(使用10μmID喷雾毛细管和1μL注射器，ESSI的死体积仍为2-3μL，而纳米喷雾谱可以轻易地从亚微升样品体积进行记录。)如表3所示，样品流速的下限取决于喷雾毛细管的横截面。这种现象表明在ESSI中阻止流速不断降低的主要因素是从毛细管尖端蒸发溶剂。因为许多感兴趣的分析物(蛋白质和其他生物高分子)被假定为通过电荷残留(CR)工艺离子化，液滴形成对于其离子化是必要的。蒸发可以通过降低液体在毛细管尖端的暴露面积而被抑制。在ESSI中样品流速的上限已经在常规HPLC洗提液流速的范围内，这意味着所述离子源可以在LC-MS界面中使用。使用含有不同浓度的氯化钠和丙三醇的水溶液对ESSI技术对基体效应的敏感度进行了测试。数据示于图10a和10b。信号强度对NaCl浓度显示，ESSI对无机盐的敏感性与纳米喷雾的敏感性相类似。然而，较之纳米喷雾或者微喷雾ESI，ESSI对于高丙三醇浓度更不敏感。20％的丙三醇浓度似乎与纳米喷雾不相容，这可能是因为样品的高粘度，ESSI在高达70％的丙三醇含量下得到稳定的信号。在某些情况下，比如溶菌酶，从纯的基于丙三醇的缓冲溶液由ESSI离子化是成功的。ESSI也能良好地耐受高浓度(0.1-0.5M)的2-氨基-2-(羟甲基)-1，3-丙二醇(三羟甲基氨基甲烷(Trisbase))。这种特征与液滴的快速蒸发有关。因为初始液滴大小和液体/气体比都小，蒸发发生在高比表面上并因此尤其是不可逆的。在这些条件下，甚至具有低蒸汽压的物质都可能蒸发。ESSI的三个主要优点是有效地消除峰变宽(图3)，在多电荷折叠蛋白质离子的情况下窄的、通常是单峰电子价态分布，有效离子化蛋白质配合物的能力(见下文)。在电喷雾质谱仪中记录蛋白质离子的峰变宽是众所周知、然而相对较少研究的现象。这通常归因于离子在大气界面中的去溶剂化不足或者归因于缓冲盐在蛋白质离子的电荷位点上聚集。(在此不考虑不挥发组分例如金属盐或者碳水化合物的影响，因为这些干扰通常可以通过缓冲液置换或者透析容易地消除。)在两种情况下共价或者离子簇存在于蛋白质离子的某些位点。为了消除这些额外的物质，可以改变溶液相的组成或者系统的平均内能。然而，如果实验的主要目标是研究来自生理来源的蛋白质或者蛋白质配合物的折叠构造，两种替代方案都存在严重的局限性。溶剂或者溶剂pH值的改变诱发溶液中蛋白质解折叠或者沉淀，而在大气界面的前端真空区域内的高电位梯度或者高离子源温度在电喷雾纳米液滴中诱发类似的过程。不完全去溶剂化的气态蛋白质离子的进一步激发也可能涉及感兴趣的结构的解折叠或者离解。因此，大多数这类研究被强制在低解析度条件下实施。在图3和11和表2中的结果明确表明，ESSI避免了作出这种妥协的要求。图11显示，ESSI高效地从蛋白质配合物产生离子并由此表现出其由单电子价态占主导地位的极窄的峰的特性。应注意在该图中出现的另一优点。在某些条件下，例如在此所用的条件，一些蛋白质碎片是变性的；这些蛋白质分子不能与配体结合而形成配合物且它们作为在一些不同电子价态中的一系列变宽的峰出现，用星号标记。这种在ESI谱图中常见的特征也能在ESSI谱图中观察到。剩余的蛋白质离子可以并确实形成配合物和它们作为单富配合物峰。区分天然和变性的蛋白质的能力是ESSI的另一优点。在ESSI中电子价态分布对大气界面设定的弱依赖性强烈表明，ESSI和ESI(或者纳米喷雾)的主要区别在于气态离子形成发生的位置。在传统电喷雾技术的情况下，被检测高分子离子的形成发生在仪器的大气界面-离子引导区。在ESSI中，这一过程似乎发生在仪器的大气压区域。为了提供这一假设的其他证据，使用ESSI喷雾溶菌酶(100fm/μL)，且所述喷雾暴露于强碱哌啶。如图12a和12b所示，平均电子价态从7迁移到6，并观察到大量的加合物形成。在液相中仅以1mM浓度存在的哌啶(pKa＝11.8)成功地抑制了溶菌酶的离子化。这些结果明确显示气态蛋白质离子已经存在于大气压区域。由于在大气压下ESSI产生完全去溶剂化的高分子离子，这种特征向用户提供了在高压下对这些离子改性的能力。这些改性包括基于移动性、离子/分子反应性、碰撞碎裂性的不同的分离和其他工艺。大气压操作离子的主要优点是这些过程的热力学性质。ESSI显示出两个现象，这使得其区别于其他的电喷雾离子化方法，即折叠蛋白质体系的高去溶剂化效率和观察到占主导地位的一种电子价态。良好的去溶剂化效率可能与小的初始液滴大小相关，后者是由超音速喷雾气体和从小液滴的高比表面快速溶剂蒸发造成的。因为高的喷雾气体流速和这使得重新溶剂化速率低，蒸发发生在溶剂分压低的环境中。这有助于解释下面的事实在蛋白质溶于生理pH范围的含水缓冲液的情况下，在ESSI谱图中观察到单一电子价态。喷雾气体的绝热膨胀和溶剂的强烈蒸发造成的喷雾的低温有助于保持这些分子的原始结构。折叠的蛋白质结构含有精确限定数量的嵌入电荷(buriedcharge)，其能够在其表面携带特定数量的电荷。后一数字通过表面上的碱性位点的表观气相碱度(GB)值相对于溶剂/缓冲液的气相碱度(GB)来确定。因为去溶剂化发生在高压下，该体系可以被假定为处于热力学平衡形式，使得这些GB值为可确定的量，所述可确定的量严格限定了蛋白质分子的表面电荷容量。容易理解的是在包含一个单一蛋白质分子的最终液滴上电荷的数量将高于蛋白质分子的电荷容量。因此，在完全去溶剂化期间，某些电荷被离解的缓冲液或者溶剂离子或者作为带电荷的簇被带走。结果是去溶剂化的蛋白质离子被充电直到其容量，而进一步的电荷降低是可忽略的，因为溶剂或者缓冲液分子的分压足够低。电喷雾和使用超音速喷雾气体的组合产生了一种新的电喷雾变型方案-电音喷离子化-具有将该方法区别于其他基于电喷雾或者音速喷雾的方法的独特特征。结果是具有一些独特分析优点和一些缺点的新方法。该技术的分析性能，包括样品消耗量或灵敏度，与其说能与传统ESI相比较，不如说能够与广泛应用的纳米喷雾离子化技术相比较。此外，ESSI显示出比纳米喷雾更好的重现性和更稳定。与纳米喷雾相反，ESSI的主要参数(样品流、喷雾气流、高电压)可以任意改变，这提供了在谱图特性上的更多控制。ESSI最显著的特征是去溶剂化的程度和观察到的极窄的电子价态分布。这些特征是特别重要的，因为它们意味着折叠蛋白质结构的离子化。这些现象被假定为与离子形成的位置向仪器的大气压区域迁移相关。这使得ESSI成为允许蛋白质分子完全去溶剂化而不损失三级结构和允许保持特定非共价结构的有希望的方法。类似的，多电荷蛋白质离子的连续电荷降低逐渐发生；各个电荷下降步骤根据各个电荷位点的不同质子亲和力(PA)值被分离产生所观察到的窄电荷位点分布。由于这些特征，本发明可以成功地允许甚至更加复杂和脆弱的结构从溶液输送到气相，使得可以通过质谱仪进行更加完全的生化系统研究。参考文献(1)ElectrosprayIonizationforMass-SpectrometryofLargeBiomolecules.Fenn，J.B.；Mann，M.；Meng，C.K.；Wong，S.F.；Whitehouse，C.M.Science1989，246，64-71.(2)ElectrosprayIonization-PrinciplesandPractice.Fenn，J.B.；Mann，M.；Meng，C.K.；Wong，S.F.；Whitehouse，C.M.MassSpectrometryReviews1990，9，37-70.(3)ProbingConformational-ChangesinProteinsbyMass-Spectrometry.Chowdhury，S.K.；Katta，V.；Chait，B.T.JournaloftheAmericanChemicalSociety1990，112，9012-9013.(4)Evaluationofheat-inducedconformationalchangesinproteinsbynanoelectrosprayFouriertransformioncyclotronresonancemassspectrometry.Fligge，T.A.；Przybylski，M.；Quinn，J.P.；Marshall，A.G.EuropeanMassSpectrometry1998，4，401-404.(5)DynamicproteincomplexesInsightsfrommassspectrometry.Hemandez，H.；Robinson，C.V.JournalofBiologicalChemistry2001，276，46685-46688.(6)Proteinfoldingandinteractionsrevealedbymassspectrometry.Last，A.M.；Robinson，C.V.CurrentOpinioninChemicalBiology1999，3，564-570.(7)PeptideandProtein-AnalysisbyElectrosprayIonizationMass-SpectrometryandCapillaryElectrophoresisMass-Spectrometry.Loo，J.A.；Udseth，H.R.；Smith，R.D.AnalyticalBiochemistry1989，179，404-412.(8)Proteincomplexestakeflight.Robinson，C.V.NatureStructuralBiology2002，9，505-506.(9)DissociationofintactEscherichiacoliribosomesinamassspectrometer-Evidenceforconformationalchangeinaribosomeelongationfactorgcomplex.Hanson，C.L.；Fucini，P.；Ilag，L.L.；Nierhaus，K.H.；Robinson，C.V.JournalofBiologicalChemistry2003，278，1259-1267.(10)Atandemmassspectrometerforimprovedtransmissionandanalysisoflargemacromolecularassemblies.Sobott，F.；Hernandez，H.；McCammon，M.G.；Tito，M.A.；Robinson，C.V.AnalyticalChemistry2002，74，1402-1407.(11)Probingthenatureofnoncovalentinteractionsbymassspectrometry.Astudyofprotein-CoAligandbindingandassembly.Robinson，C.V.；Chung，E.W.；Kragelund，B.B.；Knudsen，J.；Aplin，R.T.；Poulsen，F.M.；Dobson，C.M.JournaloftheAmericanChemicalSociety1996，118，8646-8653.(12)Thermaldissociationofmultimericproteincomplexesbyusingnanoelectrospraymassspectrometry.Benesch，J.L.P.；Sobott，F.；Robinson，C.V.AnalyticalChemistry2003，75，2208-2214.(13)Mass-SpectrometricDetectionoftheNoncovalentGdp-BoundConformationalStateoftheHumanH-RasProtein.Ganguly，A.K.；Pramanik，B.N.；Tsarbopoulos，A.；Covey，T.R.；Huang，E.；Fuhrman，S.A.JournaloftheAmericanChemicalSociety1992，114，6559-6560.(14)ObservationoftheNoncovalentQuaternaryAssociationsofProteinsbyElectrospray-IonizationMass-Spectrometry.Lightwahl，K.J.；Schwartz，B.L.；Smith，R.D.JournaloftheAmericanChemicalSociety1994，116，5271-5278.(15)CoexistingStableConformationsofGaseousProteinIons.Suckau，D.；Shi，Y.；Beu，S.C.；Senko，M.W.；Quinn，J.P.；Wampler，F.M.；McLafferty，F.W.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica1993，90，790-793.(16)Theeffectofthesourcepressureontheabundanceofionsofnoncovalentproteinassembliesinanelectrosprayionizationorthogonaltime-of-flightinstrument.Tahallah，N.；Pinkse，M.；Maier，C.S.；Heck，A.J.R.RapidCommunicationsinMassSpectrometry2001，15，596-601.(17)ElectrosprayandTaylor-ConeTheory，DolesBeamofMacromoleculesatLast.Wilm，M.S.；Mann，M.InternationalJournalofMassSpectrometryandIonProcesses1994，136，167-180.(18)Analyticalpropertiesofthenanoelectrosprayionsource.Wilm，M.；Mann，M.AnalyticalChemistry1996，68，1-8.(19)Nanoelectrospray-Morethanjustaminimized-flowelectrosprayionizationsource.Juraschek，R.；Dulcks，T.；Karas，M.JournaloftheAmericanSocietyforMassSpectrometry1999，10，300-308.(20)Effectofdifferentsolutionflowratesonanalyteionsignalsinnano-ESIMS，orWhendoesESIturnintonano-ESI？Schmidt，A.；Karas，M.；Dulcks，T.JournaloftheAmericanSocietyforMassSpectrometry2003，14，492-500.(21)MechanisticInterpretationoftheDependenceofCharge-StateDistributionsonAnalyteConcentrationsinElectrospray-IonizationMass-Spectrometry.Wang，G.D.；Cole，R.B.Anal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的气态离子的方法，该方法包括a.在权利要求24的设备中，引导来自第一毛细导管末端的溶液进入在第二毛细导管的末端提供的气体流，该气体流相对于溶液至少以超音速运动。32.权利要求31的方法，其中所述材料是缓冲到生理pH值的水溶液中的蛋白质，大部分气态离子产生对应于溶液的各组分的单一化学物质。33.权利要求31的方法，其中所述材料是在缓冲到生理pH值的水溶液中的生物分子或者分子配合物，且所产生的气态离子是对应于溶液各组分的基本单一的物质。34.权利要求31的方法，其中样品材料的气态离子经受气相大气压操作。全文摘要本发明记载了用于在大气压力下在溶液中形成样品材料例如分子的气态离子的设备和方法。该设备包括用于接收含有该材料的溶液的导管以离子化和形成流。将超音速气体喷射引导向该流并相互作用。形成了液滴和通过气体的绝热膨胀和溶液的强烈蒸发产生气态离子。在该方法中样品溶液流从具有电位的导管输送。在超音速下的气体喷射与所输送的溶液相互作用并通过气体的绝热膨胀和溶液的蒸发的作用形成了气态离子。文档编号B01D59/00GK1830056SQ200480021444公开日2006年9月6日申请日期2004年7月23日优先权日2003年7月24日发明者Z·塔卡茨,R·G·库克斯申请人:普渡研究基金会