专利名称：光敏离子透过性分子的制作方法
光敏离子透过性分子相关专利文献本专利文件根据美国法典第35篇第119条(e)款要求2010年3月17日提交的标题为 “Light-Sensitive Ion-Passing Molecules” 的美国临时专利申请第 61/314, 969号的权益，此专利文献和基础临时申请中提交的附录均以引用的方式全部并入本文。总览和概述本公开的各个方面整体涉及用于刺激靶细胞的系统和方法，并且更具体地涉及使用光学装置刺激靶细胞。对身体各种细胞的刺激已被用于产生多种有益效果。一种刺激方法涉及使用电极将外部产生的信号引入细胞。基于电极的脑刺激技术面临的一个问题是负责既定精神过程的神经元的分布性质。相反地，不同类型的神经元彼此靠近驻留，使得在进行特定任务时只有在脑部给定区域中的某些细胞被激活。换句话说，不仅异种神经束通过 紧密的空间范围平行移动，而且细胞体本身也可以混合、稀疏嵌入的构型存在。这种分配的处理方式似乎违背了要理解CNS内规范顺序的最大努力，并且使神经调节难以实现治疗目的。脑的这种构造为基于电极的刺激带来一个问题，因为电极在其所刺激的神经元的基本生理学方面是相对没有选择性的。相反，电极杆与神经元的物理接近度往往是哪些神经元将被刺激的唯一的最具有决定性的因素。因此，使用电极对单一种类的神经元进行绝对限制性的刺激通常是不可行的。使用电极进行刺激的另一个问题是因为电极布置决定哪些神经元将被刺激，并且机械稳定性经常不足，所以导致电极导线从目标区域迁移。此外，在体内一段时间以后，电极导线经常被胶质细胞包裹，使电极的有效电阻升高，进而使达到靶细胞所需的电功率输送增力卩。然而，对电压、频率或脉冲宽度的补偿性增加可使电流扩散并且增加对其它细胞的不希望的刺激。另一种刺激方法使用光敏生物分子结构来刺激响应于光的靶细胞。例如，可以使用光激活蛋白控制通过细胞膜的离子流动。通过促进或抑制通过细胞膜的正离子或负离子的流动，可以使细胞暂时去极化、去极化并保持该状态或超极化。神经元是一类使用由去极化产生的电流来产生通信信号(即神经脉冲)的细胞的实例。其它电激发细胞包括骨骼肌、心肌和内分泌细胞。神经元使用迅速去极化以在全身传输信号并且用于达到各种目的，如运动控制(例如肌肉收缩)、感觉响应(例如触觉、听觉和其它感觉)和计算功能(例如脑功能)。因此，细胞去极化的控制可有益于多种不同的目的，包括(但不限于)心理疗法、肌肉控制和感觉功能。本发明的各个方面针对能够抑制神经活动的蓝光感应视蛋白。所述视蛋白来自隐芽植物蓝隐藻(G. theta)。所研究的视蛋白是从蓝隐藻中分离的第三视蛋白，简写为GtR3。当用光照射时，GtR3能够调节超极化电流。对GtR3的作用光谱的表征显示最大吸收是约490nm,并且GtR3不被黄光激活。本发明的各个方面涉及能够激发神经活动的蓝光感应光敏感通道。所述光敏感通道来源于杜氏盐藻(Dunaliella salina)。所研究的光敏感通道简写为DChR。DChR可以在哺乳动物神经元中异源表达并且当用蓝光照射时可以调节强的去极化电流。DChR的作用最大值是约500nm。按照本公开的实施方案，通过工程化来源于蓝隐藻的蛋白产生抑制电流流动，所述蛋白通过产生抑制电流来阻止神经元的去极化而对光响应。将所述蛋白递送给目标神经兀并且暴露在光下。按照本公开的另一个实施方案，对表达GtR3质子泵的细胞进行光刺激的方法包括对所述细胞提供一系列刺激，各刺激使得在所述细胞中发生去极化事件的可能性增加。对所述细胞提供光以激活GtR3质子泵的表达，从而降低在所述细胞中发生去极化事件的可能性。在某些特定实施方案中，提供的光在蓝光光谱中。按照本公开的另一个实施方案，公开了用于体内控制神经元或其它细胞的动作电位的系统。所述系统包括向所述神经元或细胞引入响应于蓝光的蛋白的递送装置。响应于蓝光的蛋白对蓝光响应而产生抑制电流。所述系统包括产生用于刺激蓝光响应蛋白的光的蓝光源和控制光源产生光的控制装置。 按照本公开的另一个实施方案，公开了提供用于哺乳动物表达的光响应蛋白的方法。光响应蛋白从蓝隐藻中分离。所述分离的蛋白具有C末端和N末端。向所述分离的蛋白的C末端添加内质网(ER)输出信号以产生增强的光响应蛋白。将所述增强的蛋白放入空病毒载体中以向目标细胞递送。随后将携带所述增强的蛋白的病毒载体递送给目标细胞。按照本公开的实施方案，提供一种动物细胞。所述动物细胞包括响应蓝光表达质子泵的整合的外源分子。所述外源分子来源于蓝隐藻。在某些实施方案中，所述动物细胞是神经细胞。所述动物细胞还可以是例如肌细胞或细胞系。本公开的以上论述并不旨在描述本发明的每种说明的实施方案或每种实施方式。下文的附图和详细描述更具体地举例阐述这些实施方案。附图简述结合以下附图来考察随后本发明的各种实施方案的详细描述，可以更透彻地理解本发明图IA展示细胞器膜中的离子泵；图IB展示细胞膜中的离子泵；图2A展示表达光响应蛋白组合的细胞群体；图2B展示用于某些实施方案的刺激模式，其中将两种或两种以上光响应蛋白引入相同的细胞群体；图3展示根据本发明的示例实施方案的用于刺激靶细胞的系统的框图；图4展示根据本发明的示例实施方案的用于刺激靶细胞的植入装置的框图；图5展示根据本发明的示例实施方案的植入装置的框图；图6A展示根据本发明的示例实施方案的植入装置的框图；图6B展示根据本发明的示例实施方案的对应于图6A的框图的电路图；图7A和图7B展示根据本发明的示例实施方案的用于容纳光敏生物分子的筛孔的图形；图8A和图8B展示根据本发明的示例实施方案的病毒基质的图形；图9展示根据本发明的示例实施方案的响应于磁场产生光的电路的电路图；
图10A、10B和IOC展示根据本发明的示例实施方案的用于产生响应于RF信号的光的框图和电路；图IIA和图IlB各自展示根据本发明的示例实施方案的光纤装置的图形；图12A、12B、12C和12D描绘根据本发明的示例实施方案的在产生光敏生物部分中的各个阶段；以及图13展示根据本发明的示例实施方案的植入装置；图14A和图14B展示根据本发明的示例实施方案的另一个植入装置的图形；图15描绘根据本发明的示例实施方案的具有多个光源的装置；图16展示根据本发明的示例实施方案的用于体内控制一种或多种细胞电性质的系统； 图17展示根据本发明的示例实施方案的用于体内控制一种或多种细胞电性质的系统；图18A展示根据本发明的示例实施方案的用于光学药物筛选的系统的框图；图18B展示根据本发明的示例实施方案的用于根据本发明方法筛选药物的大型、准自动化系统的特定系统图；图19展示根据本发明的示例实施方案的根据本发明方法操作的小型、全自动化药物筛选系统的系统图；图20A描绘根据本发明的示例实施方案的发射器/检测器单元的实例的运行；图20B描绘根据本发明的示例实施方案的发射器/检测器单元的另一个实施方案的运行；图21A和21B描绘根据本发明的示例实施方案的用于激活在发射器/检测器单元内使用的LED发射器的电子电路机构；图22展示根据本发明的示例实施方案的示例筛选过程的环境中的一系列事件的时间线；图23示出根据本发明的示例实施方案的在孔板的孔内的细胞和药物样品的布局的实例；以及图24示出根据本发明的示例实施方案的可以在促进高通量药物筛选的较大系统内使用的所公开发明的环境。图2 展示在用eNpHR3. O转导的细胞和用eNpHR2. O转导的细胞中显示的代表性光电流迹线及其汇总图线；图25E展示在用eNpHR3. O转导的细胞和用eNpHR2. O转导的细胞中显示的代表性超极化电压迹线及其汇总图线；图26B展示被WGA-Cre融合激活的跨突触基因的模型。所述该示意图描绘出两个注射位点(一个具有WGA-Cre融合基因，另一个具有Cre依赖性视蛋白病毒)和长范围的投射；Cre可以从转导的细胞中跨突触释放从而只在接收Cre依赖性病毒的突触连接神经元中激活远缘基因表达。图26C展示用哺乳动物密码子优化的WGA-Cre和Cre依赖性AAV载体的构建体设计；图27A展示630纳米的光在用eNpHR3. O转导的神经元中激起强光电流(代表性的电压钳迹线在左侧)。比较表达eNpHR2. O和eNpHR3. O的神经元的汇总图线(在右侧)；eNpHR2. 0,42. 7±4· 5pA ；eNpHR3. 0,239. 4±28. 7pA ;未配对的 t 检验，p = 0. 00004 ；n =10)。图27B展示630纳米光照激起强的超极化(代表性电压钳迹线在左侧)。比较表达eNpHR2. O 和 eNpHR3. O 的神经元的汇总图线(右侧)；eNpHR2. O 为 15. 6±3. 2mV, eNpHR3. O为 43. 3±6· ImV ;未配对的 t 检验，p = O. 00116 ；n = 10)。图27C展示由不同波长的红外线和远红外线边缘照射激起的外向光电流的汇总630mn，239. 4±28. 7pA(左侧，η = 10) ；660nm, 120. 5±16. 7pA(中间，η = 4);以及 680nm 76. 3±9. IpA (右侦|J, η = 4)。功率密度3. 5mff/mm2 (630nm)和 7mff/mm2 (660nm>680nm)。图27D展示用红外线和远红外线边缘光照射抑制了由表达eNpHR3. O的神经元中的电流注入诱导的峰值。典型的电流钳迹线显示在630nm(左上)、660nm(右上)和680nm(下部)的光抑制。功率密度3. 5mW/mm2 (630nm)和 7mW/mm2 (660nm、680nm)。
图27G展示蓝光(445nm，5ms脉冲)在20Hz (左侧)和IOHz (右侧)激起脉冲，而同时施加黄光(590nm)抑制峰值。图27F 展示 eNPAC、ChR2 (H134R)和 eNpHR3. O 单独的激发光谱；图28B展示560纳米的光诱导eBR细胞中的外向光电流，以及在电压钳中的相应样品迹线；图28C展示560纳米的光诱导eBR细胞中的超极化，以及在电流钳中的相应样品迹线；图29A展示用于使微生物视蛋白基因与后生动物完整系统生物学相匹配的一般的亚细胞靶向策略；图29B展示在组织和亚细胞水平的靶向的概括；图30A展示当暴露于间隔2. 5秒、5秒、10秒和20秒的10秒时长的黄光脉冲对时，在表达eNpHR3. O的细胞中的有效光电流的稳定和恢复；图30B展示长期连续光暴露的eNpHR3. O标准化的光电流的时程；图30C展示超过10分钟以上的eNpHR3. O的外向电流的稳定；以及图31C展示在472nm光下的GtR3功能的样品电流钳和电压钳迹线及汇总图线数据。虽然本发明可具有多种改良和替代形式，但其实施例已在附图中通过举例来展示并且将对其进行详细描述。然而，应理解的是，不希望将本发明限制于所展示和/或描述的特定实施方案。相反，希望覆盖落入本发明的精神和范围之内的所有改良、等价和替代形式。详细描述本发明被认为可用于促进多种光敏生物分子结构的实际应用，并且已经发现本发明特别适于在处理细胞膜电压控制和刺激的装置和方法中使用。虽然本发明不一定局限于这些应用，但通过使用上下文论述各种实施例可以领会本发明的各个方面。如本文所用，靶细胞的刺激通常用于描述细胞性质的改变。例如，刺激靶细胞可引起细胞膜性质的变化，该变化可以导致靶细胞的去极化或极化。在一种特定情况下，所述靶细胞是神经元，并且所述刺激通过促进或抑制神经元产生脉冲来影响脉冲的传输。按照本发明的一个示例实施方案，在细胞中将光响应蛋白工程化。所述蛋白响应于光而影响穿过细胞膜的离子(阴离子、阳离子或质子)流动。离子流中的这种变化在所述细胞的电性质(包括例如流经所述细胞膜的电压和电流)中产生相应的变化。在一种情况下，所述蛋白使用内源性辅因子调节穿过所述细胞膜的离子流而在体内起作用。在另一种情况下，所述蛋白改变穿过所述细胞膜的电压从而阻止或促进所述细胞中的动作电位的触发。在又一种情况下，所述蛋白在引入光的几毫秒内就能够改变所述细胞的电性质。抑制蛋白通过使所述细胞的电位远离细胞的动作电位出发水平来阻止动作电位的触发。在许多神经元中，这意味着所述蛋白增加穿过所述细胞膜所观察到的负电压。在一种特定情况下，所述蛋白作为主动将质子转移出细胞的质子泵。以这种方式，所述蛋白产生穿过所述细胞膜的抑制电流。更具体地讲，所述蛋白通过降低穿过所述细胞的电压对光响应，从而降低发生动作电位或去极化的概率。本发明的某些方面基于起质子泵作用的分子/蛋白的识别和开发。该质子泵来源于隐芽植物蓝隐藻并且已经被开发用于在靶细胞中表达。在某些更特定的实施方案中， 所述细胞是神经元。工程化的蛋白(GtR3)通过产生抑制电流来阻止细胞的去极化而对蓝光响应。当在神经细胞中表达时，所述质子泵(GtR3)可以响应蓝光刺激而用于抑制神经活动。GtR3泵通过产生穿过所述神经膜的抑制电流对光刺激响应。当修饰的细胞暴露于(蓝)光时，该电流就抑制动作电位。本公开还提供在细胞中表达的光激活蛋白的修饰，所述修饰通过添加一个或多个增强向哺乳动物细胞质膜转运的氨基酸序列基序来实现。来源于进化上更简单的有机体的光激活蛋白可能不被哺乳动物细胞表达或耐受，或在哺乳动物细胞中以高水平表达时可能显示受损的亚细胞部位。因此，在一些实施方案中，将在细胞中表达的光激活蛋白与选自由信号肽、内质网(ER)输出信号、膜运输信号和N末端高尔基输出信号组成的组的一个或多个氨基酸序列基序融合。可以将一个或多个增强向哺乳动物细胞质膜的光激活蛋白转运的氨基酸序列基序与所述光激活蛋白的N末端、C末端或N末端和C末端两者融合。所述光激活蛋白和一个或多个氨基酸序列基序可以任选由接头间隔。可以增强向细胞质膜的光激活蛋白转运的其它蛋白质基序在美国专利申请第12/041，628号中描述，所述申请全部并入本文。本公开还提供在天然光激活蛋白(例如但不限于天然GtR3、NpHR, DChR和BR)的氨基酸序列中含有氨基酸置换、缺失和插入的光激活蛋白。光激活蛋白包括那些其中一个或多个氨基酸残基已进行氨基酸置换而仍保留对光响应的能力以及控制质膜极化状态的能力的蛋白。例如，可以通过将一种或多种氨基酸置换到所述蛋白的天然或野生型氨基酸序列中来制备光激活蛋白。在一些实施方案中，本发明包括含有与天然氨基酸序列相比氨基酸序列改变的蛋白，其中所述改变的光激活蛋白仍保留特有的光激活性质和/或调节穿过前体蛋白质膜的离子流的能力，但是在一些特定方面可能具有改变的性质(例如，与天然蛋白质相比，对光敏感性的增加或降低、对特定波长的光的敏感性增加或降低和/或调节哺乳动物细胞质膜极化状态的能力增加或降低)。天然蛋白序列中的氨基酸置换可以是保守性或非保守性置换，并且这些置换的氨基酸残基可以是或不是由遗传密码统一编码的。根据其侧链的化学性质，将标准的二十种氨基酸“字母”分成化学家族。这些家族包括具有以下侧链的氨基酸碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支链侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳基的侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。“保守性氨基酸置换”是其中的氨基酸残基被化学上相似的侧链置换的氨基酸置换(即，用具有碱性侧链的另一种氨基酸置换具有碱性侧链的氨基酸)。“非保守性氨基酸置换”是其中的氨基酸残基被化学上不同的侧链置换的氨基酸置换(即，用具有芳族侧链的氨基酸置换具有碱性侧链的氨基酸)。本发明的某些方面涉及表达GtR3分子的动物细胞。以这种方式，所述动物细胞包括表达响应蓝光的质子泵的整合外源分子。在某些非限制性实施方案中，所述动物细胞可以是神经细胞、肌细胞、杆状或锥状细胞或细胞系。在一些实施方案中，所述动物细胞是哺乳动物细胞。本文中提供一种动物细胞,所述动物细胞包含在所述细胞膜上表达的光激活蛋白，其中所述蛋白对蓝光敏感并且来源于蓝隐藻，其中当用光照射所述细胞时所述蛋白能够调节所述细胞中的超极化电流。在一些实施方案中，所述光具有介于约450nm和495nm之间的波长。在一些实施方案中，所述光具有约490nm的波长。在一些实施方案中，所述光激 活蛋白包含与SEQ ID NO :I中所示序列至少95%相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述光激活蛋白包含与SEQ ID NO :1中所示序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述光激活蛋白包含引入天然氨基酸序列以增加或降低对光的敏感性、增加或降低对特定波长的光的敏感性和/或增加或降低光激活蛋白调节细胞质膜极化状态的能力的置换、缺失和/或插入。在一些实施方案中，所述光激活蛋白含有一个或多个保守性氨基酸置换。在一些实施方案中，所述光激活蛋白含有一个或多个非保守性氨基酸置换。包含引入所述天然氨基酸序列的置换、缺失和/或插入的光激活蛋白适当地保留超极化响应于光的神经细胞质膜的能力。本文中还提供一种动物细胞,所述动物细胞包含在所述细胞膜上表达的光激活蛋白，其中所述蛋白包含与SEQ ID NO :1中所示序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核心氨基酸序列和内质网(ER)输出信号。所述ER输出信号可以融合到所述核心氨基酸序列的C末端或融合到所述核心氨基酸序列的N末端。在一些实施方案中，所述ER输出信号通过接头与所述核心氨基酸序列连接。所述接头可具有 5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400 或 500 个氨基酸中的任一长度。接头可以进一步包含荧光蛋白，例如但不限于黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，所述ER输出信号包含氨基酸序列FXYENE，其中X可以是任一氨基酸。在一些实施方案中，所述ER输出信号包含氨基酸序列VXXSL，其中X可以是任一氨基酸。在一些实施方案中，所述ER输出信号包含氨基酸序列FCYENEVο本文中还提供一种动物细胞,所述动物细胞包含在所述细胞膜上表达的光激活蛋白，其中所述蛋白包含与SEQ ID NO :1中所示序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97 %、98 %、99 %或100 %相同的核心氨基酸序列和信号肽(例如，增强向质膜转运的信号肽)。信号肽可以融合到所述核心氨基酸序列的C末端或融合到所述核心氨基酸序列的N末端。在一些实施方案中，所述信号肽通过接头与所述核心氨基酸序列连接。所述接头可具有 5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400 或 500 个氨基酸中的任一长度。接头可以进一步包含荧光蛋白，例如但不限于黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，所述信号肽包含氨基酸序列MDYGGALSAVGRELLFVTNPVVVNGSVLVPEDQCYCAGWIESRGTNG。在一些实施方案中，可以使用其它信号肽(如来自其它视蛋白的信号肽)。本文中还提供一种动物细胞,所述动物细胞包含在所述细胞膜上表达的光激活蛋白，其中所述蛋白包含与SEQ ID NO :1中所示序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核心氨基酸序列和运输信号(例如，增强向质膜转运的运输信号)。信号肽可以融合到所述核心氨基酸序列的C末端或融合到所述核心氨基酸序列的N末端。在一些实施方案中，所述信号肽通过接头与所述核心氨基酸序列连接。所述接头可具有 5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400 或 500个氨基酸中的任一长度。接头可以进一步包含荧光蛋白，例如但不限于黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，所述运输信号来源于人内向整流钾通道Kir2. I的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述运输信号包含氨基酸序列K SRITSEGEYIPLDQIDINV。
本文中还提供一种动物细胞,所述动物细胞包含在所述细胞膜上表达的光激活蛋白，其中所述蛋白包含与SEQ ID NO :1中所示序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、
96%、97 %、98 %、99 %或100 %相同的核心氨基酸序列和增强向哺乳动物细胞质膜转运的两个或两个以上氨基酸序列基序，其选自由信号肽、ER输出信号和膜运输信号组成的组。在一些实施方案中，所述光激活蛋白包含N末端信号肽和C末端ER输出信号。在一些实施方案中，所述光激活蛋白包含N末端信号肽和C末端运输信号。在一些实施方案中，所述光激活蛋白包含N末端信号肽、C末端ER输出信号和C末端运输信号。在一些实施方案中，所述光激活蛋白包含C末端ER输出信号和C末端运输信号。在一些实施方案中,所述C末端ER输出信号和所述C末端运输信号通过接头连接。所述接头可具有5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400或500个氨基酸中的任一长度。接头可以进一步包含荧光蛋白，例如但不限于黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，所述ER输出信号比所述运输信号更靠近C末端。在一些实施方案中，所述运输信号比所述ER输出信号更靠近C末端。本文中还提供编码本文中描述的任何蛋白的分离的多核苷酸，所述蛋白如包含与SEQ ID NO :1 中所示序列至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100 %相同的核心氨基酸序列。本文中还提供包含编码本文中描述的任何蛋白的表达载体(如本文中描述的病毒载体)，所述蛋白如包含与SEQ ID NO :1中所示序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核心氨基酸序列。所述多核苷酸可以用于表达动物细胞中的光激活蛋白。本文中提供一种动物细胞,所述动物细胞包含在所述细胞膜上表达的光激活蛋白，其中所述蛋白对蓝光响应并且来源于杜氏盐藻，其中当用光照射所述细胞时所述蛋白能够调节所述细胞中的去极化电流。在一些实施方案中，所述光具有介于约450nm和495nm之间的波长。在一些实施方案中，所述光具有约490nm的波长。在一些实施方案中，所述光激活蛋白包含与 SEQ ID NO 2 的残基 25-365、24-365、23-365、22-365、21-365、20-365、
19-365、18-365、17-365、16-365、15-365、14-365、13-365、13-365、12-365、11-365、10-365、9-365、8-365、7-365、6-365、5-365、4-365、3-365、2-365或 1-365 中所示序列至少 95%相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述光激活蛋白包含与SEQ ID NO :2的残基25-365、24-365、23-365、22-365、21-365、20-365、19-365、18-365、17-365、16-365、15-365、14-365、13-365、13-365、12-365、11-365、10-365、9-365、8-365、7-365、6-365、5-365、4-365、3-365、2-365 或 1-365 中所示序列至少 90%、91 %、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100 %相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述光激活蛋白包含引入天然氨基酸序列以增加或降低对光的敏感性、增加或降低对特定波长的光的敏感性和/或增加或降低光激活蛋白调节细胞质膜的极化状态的能力的置换、缺失和/或插入。在一些实施方案中，所述光激活蛋白含有一个或多个保守性氨基酸置换。在一些实施方案中，所述光激活蛋白含有一个或多个非保守性氨基酸置换。包含引入所述天然氨基酸序列的置换、缺失和/或插入的光激活蛋白适当地保留去极化响应于光的神经细胞质膜的能力。本文中还提供一种动物细胞,所述动物细胞包含在所述细胞膜上表达的光激活蛋白，其中所述蛋白包含与 SEQ ID NO :2 的残基 25-365、24-365、23-365、22-365、21-365、 20-365、19-365、18-365、17-365、16-365、15-365、14-365、13-365、13-365、12-365、11-365、
10-365、9-365、8-365、7-365、6-365、5-365、4-365、3-365、2-365或 1-365 中所示序列至少90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100%相同的核心氨基酸序列和内质网(ER)输出信号。所述ER输出信号可融合到融合到所述核心氨基酸序列的C末端或融合到所述核心氨基酸序列的N末端。在一些实施方案中，所述ER输出信号通过接头与所述核心氨基酸序列连接。所述接头可具有5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400或500个氨基酸中的任一长度。接头可以进一步包含荧光蛋白，例如但不限于黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，所述ER输出信号包含氨基酸序列FXYENE，其中X可以是任一氨基酸。在一些实施方案中，所述ER输出信号包含氨基酸序列VXXSL，其中X可以是任一氨基酸。在一些实施方案中，所述ER输出信号包含氨基酸序列FCYENEV。本文中还提供一种动物细胞,所述动物细胞包含在所述细胞膜上表达的光激活蛋白，其中所述蛋白包含与 SEQ ID NO :2 的残基 25-365、24-365、23-365、22-365、21-365、20-365、19-365、18-365、17-365、16-365、15-365、14-365、13-365、13-365、12-365、11-365、10-365、9-365、8-365、7-365、6-365、5-365、4-365、3-365、2-365 或 1-365 中所示序列至少90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100%相同的核心氨基酸序列和信号肽(例如，增强向质膜转运的信号肽)。信号肽可以融合到所述核心氨基酸序列的C末端或融合到所述核心氨基酸序列的N末端。在一些实施方案中，所述信号肽通过接头与所述核心氨基酸序列连接。所述接头可具有5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400或500个氨基酸中的任一长度。接头可以进一步包含荧光蛋白，例如但不限于黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，所述信号肽包含氨基酸序列 MDYGGALSAVGRELLFVTNPVVVNGSVLVPEDQCYCAGWIESRGTNG。在一些实施方案中，可以使用其它信号肽(如来自其它视蛋白的信号肽)。本文中还提供一种动物细胞,所述动物细胞包含在所述细胞膜上表达的光激活蛋白，其中所述蛋白包含与 SEQ ID NO :2 的残基 25-365、24-365、23-365、22-365、21-365、20-365、19-365、18-365、17-365、16-365、15-365、14-365、13-365、13-365、12-365、11-365、10-365、9-365、8-365、7-365、6-365、5-365、4-365、3-365、2-365 或 1-365 中所示序列至少90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100%相同的核心氨基酸序列和运输信号(例如，增强向质膜转运的运输信号)。信号肽可以融合到所述核心氨基酸序列的C末端或融合到所述核心氨基酸序列的N末端。在一些实施方案中，所述信号肽通过接头与所述核心氨基酸序列连接。所述接头可具有5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400或500个氨基酸中的任一长度。接头可以进一步包含荧光蛋白，例如但不限于黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，所述运输信号来源于人内向整流钾通道Kir2. I的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述运输信号包含氨基酸序列KSRITSEGEYIPLDQIDINV。本文中还提供一种动物细胞,所述动物细胞包含在所述细胞膜上表达的光激活蛋白，其中所述蛋白包含与 SEQ ID NO :2 的残基 25-365、24-365、23-365、22-365、21-365、20-365、19-365、18-365、17-365、16-365、15-365、14-365、13-365、13-365、12-365、11-365、10-365、9-365、8-365、7-365、6-365、5-365、4-365、3-365、2-365 或 1-365 中所示序列至少90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100%相同的核心氨基酸序列 和增强向哺乳动物细胞质膜转运的两个或两个以上氨基酸序列基序，其选自由信号肽、ER输出信号和膜运输信号组成的组。在一些实施方案中，所述光激活蛋白包含N末端信号肽和C末端ER输出信号。在一些实施方案中,所述光激活蛋白包含N末端信号肽和C末端运输信号。在一些实施方案中，所述光激活蛋白包含N末端信号肽、C末端ER输出信号和C末端运输信号。在一些实施方案中，所述光激活蛋白包含C末端ER输出信号和C末端运输信号。在一些实施方案中，所述C末端ER输出信号和所述C末端运输信号通过接头连接。所述接头可具有 5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400 或 500个氨基酸中的任一长度。接头可以进一步包含荧光蛋白，例如但不限于黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，所述ER输出信号比所述运输信号更靠近C末端。在一些实施方案中，所述运输信号比所述ER输出信号更靠近C末端。本文中还提供编码本文中描述的任何蛋白的分离的多核苷酸，所述蛋白如包含与 SEQ ID NO 2 的残基 25-365、24-365、23-365、22-365、21-365、20-365、19-365、18-365、17-365、16-365、15-365、14-365、13-365、13-365、12-365、11-365、10-365、9-365、8-365、7-365、6-365、5-365、4-365、3-365、2-365 或 1-365 中所示序列至少 90% ,91 % ,92% ,93%,94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核心氨基酸序列。本文中还提供包含编码本文中描述的任何蛋白的表达载体(如本文中描述的病毒载体)，所述蛋白如包含与 SEQ ID NO :2 的残基25-365、24-365、23-365、22-365、21-365、
20-365、19-365、18-365、17-365、16-365、15-365、14-365、13-365、13-365、12-365、11-365、
10-365、9-365、8-365、7-365、6-365、5-365、4-365、3-365、2-365 或 1-365 中所示序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%相同的核心氨基酸序列。所述多核苷酸可以用于表达动物细胞中的光激活蛋白。本文中提供一种动物细胞,所述动物细胞包含在所述细胞膜上表达的光激活蛋白，其中所述蛋白对黄光以及红光响应并且来源于法老嗜盐碱单胞菌(Natronomonaspharaon is),其中当用光照射所述细胞时所述蛋白能够调节所述细胞中的超极化电流。在一些实施方案中，所述光具有介于约580nm和630nm之间的波长。在一些实施方案中，所述光具有约589nm的波长。在一些实施方案中，所述光具有大于约630nm(例如小于740nm)的波长。在一些实施方案中，所述光具有约630nm的波长。在一些实施方案中，所述光激活蛋白包含与SEQ ID NO 3中所示序列至少95%相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述光激活蛋白包含与SEQ ID NO :3中所示序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、
97%、98 %、99 %或100 %相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述光激活蛋白包含引入天然氨基酸序列以增加或降低对光的敏感性、增加或降低对特定波长的光的敏感性和/或增加或降低光激活蛋白调节细胞质膜的极化状态的能力的置换、缺失和/或插入。在一些实施方案中，所述光激活蛋白含有一个或多个保守性氨基酸置换。在一些实施方案中，所述光激活蛋白含有一个或多个非保守性氨基酸置换。包含引入所述天然氨基酸序列的置换、缺失和/或插入的光激活蛋白适当地保留超极化响应于光的神经细胞质膜的能力。本文中还提供一种动物细胞,所述动物细胞包含在所述细胞膜上表达的光激活蛋白，其中所述蛋白包含与SEQ ID NO :3中所示序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核心氨基酸序列和内质网(ER)输出信号。所述ER 输出信号可以融合到所述核心氨基酸序列的C末端或融合到所述核心氨基酸序列的N末端。在一些实施方案中，所述ER输出信号通过接头与所述核心氨基酸序列连接。所述接头可具有 5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400 或 500 个氨基酸中的任一长度。接头可以进一步包含荧光蛋白，例如但不限于黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，所述ER输出信号包含氨基酸序列FXYENE，其中X可以是任一氨基酸。在一些实施方案中，所述ER输出信号包含氨基酸序列VXXSL，其中X可以是任一氨基酸。在一些实施方案中，所述ER输出信号包含氨基酸序列FCYENEVο本文中还提供一种动物细胞,所述动物细胞包含在所述细胞膜上表达的光激活蛋白，其中所述蛋白包含与SEQ ID NO :3中所示序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核心氨基酸序列和运输信号(例如，增强向质膜转运的运输信号)。信号肽可以融合到所述核心氨基酸序列的C末端或融合到所述核心氨基酸序列的N末端。在一些实施方案中，所述信号肽通过接头与所述核心氨基酸序列连接。所述接头可具有 5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400 或 500个氨基酸中的任一长度。接头可以进一步包含荧光蛋白，例如但不限于黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，所述运输信号来源于人内向整流钾通道Kir2. I的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述运输信号包含氨基酸序列K SRITSEGEYIPLDQIDINV。本文中还提供一种动物细胞,所述动物细胞包含在所述细胞膜上表达的光激活蛋白，其中所述蛋白包含与SEQ ID NO :3中所示序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97 %、98 %、99 %或100 %相同的核心氨基酸序列和增强向哺乳动物细胞质膜转运的两个或两个以上氨基酸序列基序，其选自由信号肽、ER输出信号和膜运输信号组成的组。在一些实施方案中，所述光激活蛋白包含C末端ER输出信号和C末端运输信号。在一些实施方案中，所述C末端ER输出信号和所述C末端运输信号通过接头连接。所述接头可具有5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400 或 500 个氨基酸中的任一长度。接头可以进一步包含荧光蛋白，例如但不限于黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，所述ER输出信号比所述运输信号更靠近C末端。在一些实施方案中，所述运输信号比所述ER输出信号更靠近C末端。本文中还提供一种动物细胞,所述动物细胞包含在所述细胞膜上表达的光激活蛋白，其中所述蛋白包含与SEQ ID NO :3中所示序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核心氨基酸序列，其中SEQ ID NO :3的N末端信号肽缺失或被置换。在一些实施方案中，所述光激活蛋白包含与SEQ ID NO: 3的残基40-291、39-291、38-291、37-291、36-291、35-291、34-291、33-291、32-291、31-291、30-291、29-291、28-291、27-291、26-291、25-291、24-291、23-291、22-291、21-291、20-291、19-291、18-291、17-291、16-291、15-291、14-291、13-291、13-291、12-291、10-291、10-291、9-291、8-291、7-291、6-291、5-291、4-291、3-291、2-291或1-291中所示序列至少95%相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，可以使用其它信号肽(如来自其它视蛋白的信号肽)。所述光激活蛋白可以进一步包含本文中描述的ER转运信号和膜运输信号。
本文中还提供编码本文中描述的任何蛋白的多核苷酸，所述蛋白如包含与SEQ IDNO 3 中所示序列至少 90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100%相同的核心氨基酸序列、ER输出信号和膜运输信号。所述多核苷酸可以在表达载体(如本文中描述的病毒载体)中。所述多核苷酸可以用于表达动物细胞中的光激活蛋白。本文中提供一种动物细胞,所述动物细胞包含在所述细胞膜上表达的光激活蛋白，其中所述蛋白对绿光敏感并且来源于极端嗜盐古菌(Halobacterium salinarum),其中当用光照射所述细胞时所述蛋白能够调节所述细胞中的超极化电流。在一些实施方案中，所述光具有介于约520nm和570nm之间的波长。在一些实施方案中，所述光具有约560nm的波长。在一些实施方案中，所述光激活蛋白包含与SEQ ID NO :4中所示序列至少95%相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述光激活蛋白包含与SEQ ID NO :4中所示序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述光激活蛋白包含引入天然氨基酸序列以增加或降低对光的敏感性、增加或降低对特定波长的光的敏感性和/或增加或降低光激活蛋白调节细胞质膜的极化状态的能力的置换、缺失和/或插入。在一些实施方案中，所述光激活蛋白含有一个或多个保守性氨基酸置换。在一些实施方案中，所述光激活蛋白含有一个或多个非保守性氨基酸置换。包含引入所述天然氨基酸序列的置换、缺失和/或插入的光激活蛋白适当地保留超极化响应于光的神经细胞质膜的能力。本文中还提供一种动物细胞,所述动物细胞包含在所述细胞膜上表达的光激活蛋白，其中所述蛋白包含与SEQ ID勵4中所示序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核心氨基酸序列和内质网(ER)输出信号。所述ER输出信号可以到融合到所述核心氨基酸序列的C末端或融合到所述核心氨基酸序列的N末端。在一些实施方案中，所述ER输出信号通过接头与所述核心氨基酸序列连接。所述接头可具有 5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400 或 500 个氨基酸中的任一长度。接头可以进一步包含荧光蛋白，例如但不限于黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，所述ER输出信号包含氨基酸序列FXYENE，其中X可以是任一氨基酸。在一些实施方案中，所述ER输出信号包含氨基酸序列VXXSL，其中X可以是任一氨基酸。在一些实施方案中，所述ER输出信号包含氨基酸序列FCYENEVο本文中还提供一种动物细胞,所述动物细胞包含在所述细胞膜上表达的光激活蛋白，其中所述蛋白包含与SEQ ID勵4中所示序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核心氨基酸序列和运输信号(例如，增强向质膜转运的运输信号)。信号肽可以融合到所述核心氨基酸序列的C末端或融合到所述核心氨基酸序列的N末端。在一些实施方案中，所述信号肽通过接头与所述核心氨基酸序列连接。所述接头可具有 5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400 或 500个氨基酸中的任一长度。接头可以进一步包含荧光蛋白，例如但不限于黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，所述运输信号来源于人内向整流钾通道Kir2. I的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述运输信号包含氨基酸序列K SRITSEGEYIPLDQIDINY。本文中还提供一种动物细胞,所述动物细胞包含在所述细胞膜上表达的光激活蛋 白，其中所述蛋白包含与SEQ ID勵4中所示序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97 %、98 %、99 %或100 %相同的核心氨基酸序列和增强向哺乳动物细胞质膜转运的两个或两个以上氨基酸序列基序，其选自由ER输出信号和膜运输信号组成的组。在一些实施方案中，所述光激活蛋白包含C末端ER输出信号和C末端运输信号。在一些实施方案中，所述C末端ER输出信号和所述C末端运输信号通过接头连接。所述接头可具有5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400 或 500 个氨基酸中的任一长度。接头可以进一步包含荧光蛋白，例如但不限于黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，所述ER输出信号比所述运输信号更靠近C末端。在一些实施方案中，所述运输信号比所述ER输出信号更靠近C末端。本文中还提供一种动物细胞,所述动物细胞包含在所述细胞膜上表达的光激活蛋白，其中所述蛋白包含与SEQ ID勵4中所示序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核心氨基酸序列，其中SEQ ID NO :4的N末端信号肽缺失或被置换。在一些实施方案中，所述光激活蛋白包含与SEQ ID NO :4的残基40-262、39-262、38-262、37-262、36-262、35-262、34-262、33-262、32-262、31-262、30-262、29-262、28-262、27-262、26-262、25-262、24-262、23-262、22-262、21-262、20-262、19-262、18-262、17-262、16-262、15-262、14-262、13-262、13-262、12-262、10-262、10_262、9-262、8_262、7-262、6-262、5-262、4-262、3-262、2-262或1-262中所示序列至少95%相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，可以使用其它信号肽(如来自其它视蛋白的信号肽)。所述光激活蛋白可以进一步包含本文中描述的ER转运信号和/或膜运输信号。本文中还提供编码本文中描述的任何蛋白的多核苷酸，所述蛋白如包含与SEQ IDNO 4 中所示序列至少 90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100%相同的核心氨基酸序列、ER输出信号和膜运输信号。所述多核苷酸可以在表达载体(如本文中描述的病毒载体)中。所述多核苷酸可以用于在动物细胞中表达光激活蛋白。在某些更特定的实施方案中，提供一种提供用于哺乳动物表达的光响应蛋白的方法。光响应蛋白是从蓝隐藻(GtR3)中分离的。GtR3具有C末端和N末端。GtR3的C末端加入了启动子。在某些实施方案中，所述启动子是内质网(ER)输出信号。关于优化在哺乳动物细胞中表达的GtR3的更多说明，参见在所述基础临时申请且标题为“Molecular andCellular Approaches for Diversifying and Extending Optogenetics，，中提交的附录A0激发蛋白通过使细胞的电位向所述细胞的动作电位触发水平移动来促进动作电位的触发。在许多神经元中，这意味着所述蛋白降低穿过所述细胞膜所观察到的负电压。在一种特定的情况下，所述蛋白作用于将阳离子转移到细胞中的另外的离子通道。以这种方式，所述蛋白产生穿过所述细胞膜的激发电流。更具体地讲，所述蛋白通过升高穿过所述细胞的电压对光响应，从而增加发生动作电位或去极化的可能性。在某些情况下，可以将穿过细胞膜的电压增加到动作电位出发水平或更高，从而引起所述细胞的去极化。本发明的某些方面基于来源于杜氏盐藻的通道(DChR)的识别和开发。当用蓝光照射时，光敏感通道DChR调节强的去极化电流。所述去极化电流可能使细胞响应于蓝光照射而激发。在某些实施方案中，DChR在目标细胞中被表达为外源蛋白。对于神经细胞，当递送给目标细胞时，DChR可以起利用内源性辅因子的激发蛋白的作用。
向光遗传学领域引入GtR3和DChR为多种应用提供了可能。例如，GtR3和DChR可以与其它光遗传学离子透过性分子如ChR2 (从莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)中开发)组合使用。GtR3和DChR相对于其它光响应分子具有不同的操作参数。这促进了对不同波长的光具有精确调整的响应的细胞或细胞群体的发展。可以调整的参数包括但不限于电流密度、超极化水平、膜电导、刺激频率、静息电位、光波长和/或光强度。在另一个示例实施方案中，用于控制神经元的动作电位的方法包括以下步骤在所述神经元中工程化第一光响应蛋白；在所述神经元中且从第一光响应蛋白响应于光产生抑制电流；在所述神经元中工程化第二光响应蛋白；以及在所述神经元中从第二光响应蛋白响应于光产生激发电流。第一光响应蛋白和第二光响应蛋白可以对不同波长的光响应。在某些情况下，使用DChR或GtR3可以促进该激发或抑制电流的特定的电流密度和/或产生该电流的光波长。在另一个示例实施方案中，用于控制神经元的动作电位的方法包括以下步骤在所述神经元中工程化第一光响应蛋白；在所述神经元中且从第一光响应蛋白响应于光产生抑制电流；在所述神经元中工程化第二光响应蛋白；以及从第二光响应蛋白响应于光产生第二抑制电流，所述两个电流的组合比单个光响应蛋白更强地抑制所述神经元。例如，第一光响应蛋白可以是NpHR且第二光响应蛋白可以是GtR3。用于控制穿过细胞的细胞膜的电压水平的另一种方法包括测量所述细胞膜的电压水平。工程化光响应蛋白且将所述光响应蛋白引入所述细胞中，并且在其中表达。提供特定波长的光，所述光通过所述光响应蛋白在所述细胞中产生反应。所述光响应蛋白的响应产生穿过所述细胞膜的电流。所述电流对测量的电压水平响应。本发明的另一个方面涉及用于在体内控制神经元的动作电位的系统。所述系统包括递送装置、光源和控制装置。所述递送装置将光响应蛋白引入所述神经元中，所述光响应蛋白产生抑制电流。光源产生刺激光响应蛋白的光，控制装置控制光源产生的光。在其他实施方案中，被引入神经元的光响应蛋白产生激发电流。在更详细地实施方案中，将所述系统进一步修改以使得递送装置通过转染、转导和显微注射之一引入光响应蛋白，和/或从而使光源通过植入光发生器和光纤之一将光引入神经元。关于基因递送和表达方法的其它细节，参见PCT公布第W02010/019619A1号(PCT/US2009/053474),标题为“Method and Composition for Controlling GeneExpression”,将其以引用的方式全部并入本文。本公开的另一个方面涉及用于治疗病症的方法。所述方法靶向与所述病症相关的一组神经元；并且在该组中，所述方法包括工程化抑制蛋白以响应于光，通过产生抑制电流阻止神经元的去极化，并且将所述神经元暴露于光下，从而阻止所述神经元的去极化。本公开的又一个方面针对用于治疗病症的又一种方法。所述方法靶向与所述病症相关的一组神经元；并且在该组中，所述方法包括工程化激发蛋白以响应于光，通过产生激发电流促进神经元的去极化，并且将所述神经元暴露于光下，从而促进所述神经元的去极化。在本发明的其它方面中，将抑制蛋白和激发蛋白(响应于不同波长的光)两者引入目标神经元组。所述神经元被交替地暴露于不同波长的光进行激发，并且抑制所述神经元的去极化。更详细的实施方案详细地说明这些技术。例如，本发明的另一个方面在物种(例 如小鼠和秀丽隐杆线虫(C. elegans))中共表达具有其它已知视蛋白的GtR3和DChR，如NpHR和VChRl。此外，产生反极化电流并且具有不同颜色敏感性的视蛋白在灵敏的哺乳动物大脑切片中与钙成像整合以用于双向光调制和神经活动的读取。同样地，可以将耦合的视蛋白靶向秀丽隐杆线虫肌肉和胆碱能运动神经元以双向控制移动。可以将共同耦合的视蛋白用作带电神经回路的多模式、高速、基因靶向、全光探查(all-opticalinterrogation)的完全和互补的光遗传学系统。此外，可以用不同的视蛋白I禹合祀向一组以上细胞，允许精确控制多组相互独立的细胞。除了 GtR3和DChR之外，还有可以工程化以光学调节离子流或在细胞内的第二信使的若干光敏感通道、氯视紫红质蛋白和微生物视蛋白。本发明的各种实施方案包括优化、突变、截短的密码子、融合蛋白、靶向型或此外这些离子光学调节剂的改进型。例如，GtR3和DChR(例如在所述基础临时申请中提交的附录B和C)。提到的视蛋白作为若干不同实施方案的代表使用。除非规定，否则不希望特定地识别GtR3和DChR的论述将本发明限制于光学调节剂的这些特定的实例。关于上述序列的更多细节，可以参考Feng Zhang等Nature (2007 年 4 月 5 日)446 卷633-639 的“Multimodal fast optical interrogationof neural circuitry”,将其以引用的方式全部并入本文。表I展示用于横跨可见光谱抑制细胞活动的识别的视蛋白
权利要求
1.一种动物细胞，所述动物细胞包含在细胞膜上表达的光激活蛋白，其中所述蛋白对蓝光响应并且来源于蓝隐藻，其中当用光照射所述细胞时所述蛋白能够调节所述细胞中的超极化电流。
2.根据权利要求I所述的动物细胞，其中所述蛋白包含与SEQID NO :1中所示序列至少95 %相同的核心氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的动物细胞，其中所述蛋白包含所述核心氨基酸序列和在所述核心氨基酸序列的C末端的内质网(ER)输出信号。
4.根据权利要求3所述的动物细胞，其中所述核心氨基酸序列通过接头与所述ER输出信号连接。
5.根据权利要求3所述的动物细胞，其中所述ER输出信号包含氨基酸序列FCEYENEV。
6.根据权利要求3所述的动物细胞，其中所述蛋白包含SEQID NO :5中所示氨基酸序列。
7.根据权利要求I所述的动物细胞，其中所述动物细胞是神经细胞、肌细胞或干细胞。
8.根据权利要求I所述的动物细胞，其进一步包含在所述细胞膜上表达的第二光激活蛋白。
9.根据权利要求8所述的动物细胞，其中所述第二光激活蛋白是当用光照射所述细胞时能够调节所述细胞中的去极化电流的蛋白。
10.根据权利要求9所述的动物细胞，其中所述第二光激活蛋白选自由VChRl、DChR,SFO和ChR2组成的组。
11.一种细胞群体,所述细胞群体包含根据权利要求1-10中任一项所述的细胞。
12.—种分离的多核苷酸,所述多核苷酸包含编码含有与SEQ ID NO :1中所不序列至少95 %相同的核心氨基酸序列的光激活蛋白的核苷酸序列。
13.一种表达载体，所述表达载体包含编码含有与SEQ ID NO :1中所示序列至少95%相同的核心氨基酸序列的光激活蛋白的核苷酸序列。
14.根据权利要求13所述的表达载体，其中所述表达载体是病毒载体。
15.根据权利要求14所述的表达载体，其中所述病毒载体是AAV载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、HSV载体或慢病毒载体。
16.一种使用根据权利要求1-7中任一项所述的细胞的方法，所述方法包括用光激活所述光激活蛋白。
17.一种使用根据权利要求8-10中任一项所述的细胞的方法，所述方法包括将所述光激活蛋白在其各自的波长激活。
18.一种非人动物，所述非人动物包含根据权利要求1-10中任一项所述的细胞。
19.一种动物细胞,所述动物细胞包含在所述细胞膜上表达的光激活蛋白，其中所述蛋白对蓝光响应并且来源于杜氏盐藻，其中当用光照射所述细胞时所述蛋白能够调节所述细胞中的去极化电流。
20.根据权利要求19所述的动物细胞，其中所述蛋白包含与SEQID NO :2的残基25-365中所不序列至少95%相同的核心氨基酸序列。
21.根据权利要求20所述的动物细胞，其中所述蛋白包含所述核心氨基酸序列和在所述核心氨基酸序列的C末端的内质网(ER)输出信号。
22.根据权利要求21所述的动物细胞，其中所述核心氨基酸序列通过接头与所述ER输出信号连接。
23.根据权利要求22所述的动物细胞，其中所述ER输出信号包含氨基酸序列FCEYENEVο
24.根据权利要求19所述的动物细胞,其中所述动物细胞是神经细胞、肌细胞或干细胞。
25.根据权利要求19所述的动物细胞，其进一步包含在所述细胞膜上表达的第二光激活蛋白。
26.根据权利要求25所述的动物细胞，其中所述第二光激活蛋白是当用光照射所述细胞时能够调节所述细胞中的超极化电流的蛋白。
27.根据权利要求25所述的动物细胞，其中所述第二光激活蛋白选自由NpHR、BR、AR和GtR3组成的组。
28.—种细胞群体，所述细胞群体包含根据权利要求19-27中任一项所述的细胞。
29.—种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码含有与SEQ ID NO :2的残基25-365中所示序列至少95%相同的核心氨基酸序列的光激活蛋白的核苷酸序列。
30.一种表达载体，所述表达载体包含编码含有与SEQ ID NO :2的残基25-365中所示序列至少95%相同的核心氨基酸序列的光激活蛋白的核苷酸序列。
31.根据权利要求29所述的表达载体，其中所述表达载体是病毒载体。
32.根据权利要求30所述的表达载体，其中所述病毒载体是AAV载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、HSV载体或慢病毒载体。
33.一种使用根据权利要求19-24中任一项所述的细胞的方法，所述方法包括用光激活所述光激活蛋白。
34.一种使用根据权利要求24-27中任一项所述的细胞的方法，所述方法包括将所述光激活蛋白在其各自的波长激活。
35.一种非人动物，所述非人动物包含根据权利要求19-27中任一项所述的细胞。
36.一种动物细胞，所述动物细胞包含在所述细胞膜上表达的光激活蛋白，其中所述蛋白包含与SEQ ID NO :3中所示序列至少95%相同的核心氨基酸序列、ER输出信号和膜运输信号。
37.根据权利要求36所述的动物细胞，其中所述光激活蛋白从所述N末端至所述C末端包含所述核心氨基酸序列、所述ER输出信号和所述膜运输信号。
38.根据权利要求36所述的动物细胞，其中所述光激活蛋白从所述N末端至所述C末端包含所述核心氨基酸序列、所述膜运输信号和所述ER输出信号。
39.根据权利要求36所述的动物细胞，其中所述ER输出信号包含氨基酸序列FCEYENEVο
40.根据权利要求36所述的动物细胞，其中所述膜运输信号包含氨基酸序列KSRITSEGEYIPLDQIDINV。
41.根据权利要求36所述的动物细胞,其中所述动物细胞是神经细胞、肌细胞或干细胞。
42.根据权利要求36所述的动物细胞，其进一步包含在所述细胞膜上表达的第二光激活蛋白。
43.根据权利要求42所述的动物细胞，其中所述第二光激活蛋白是当用光照射所述细胞时能够调节所述细胞中的去极化电流的蛋白。
44.根据权利要求42所述的动物细胞，其中所述第二光激活蛋白选自由VChRl、DChR,SFO和ChR2组成的组。
45.一种细胞群体，所述细胞群体包含根据权利要求36-44中任一项所述的细胞。
46.—种用于制备根据权利要求36-44中任一项所述的细胞或根据权利要求45所述的细胞群体的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码含有与SEQ ID NO :3中所示序列至少95%相同的核心氨基酸序列的光激活蛋白的核苷酸序列、ER输出信号和膜运输信号。
47.根据权利要求46所述的多核苷酸,其中所述多核苷酸在表达载体中。
48.根据权利要求47所述的多核苷酸，其中所述表达载体是病毒载体。
49.根据权利要求48所述的多核苷酸，其中所述病毒载体是AAV载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、HSV载体或慢病毒载体。
50.一种使用根据权利要求36-41中任一项所述的细胞的方法,所述方法包括用具有介于约580nm和约630nm之间的波长的光激活所述光激活蛋白。
51.一种使用根据权利要求42-44中任一项所述的细胞的方法，所述方法包括将所述光激活蛋白在其各自的波长激活。
52.—种非人动物，所述非人动物包含根据权利要求36-44中任一项所述的细胞。
53.一种动物细胞，所述动物细胞包含在所述细胞膜上表达的光激活蛋白，其中所述蛋白包含与SEQ ID NO :4中所示序列至少95%相同的核心氨基酸序列、ER输出信号和膜运输信号。
54.根据权利要求53所述的动物细胞，其中所述光激活蛋白从所述N末端至所述C末端包含所述核心氨基酸序列、所述ER输出信号和所述膜运输信号。
55.根据权利要求53所述的动物细胞，其中所述光激活蛋白从所述N末端至所述C末端包含所述核心氨基酸序列、所述膜运输信号和所述ER输出信号。
56.根据权利要求53所述的动物细胞，其中所述ER输出信号包含氨基酸序列FCEYENEVο
57.根据权利要求53所述的动物细胞，其中所述膜运输信号包含氨基酸序列KSRITSEGEYIPLDQIDINV。
58.根据权利要求53所述的动物细胞,其中所述动物细胞是神经细胞、肌细胞或干细胞。
59.根据权利要求53所述的动物细胞，其进一步包含在所述细胞膜上表达的第二光激活蛋白。
60.根据权利要求59所述的动物细胞，其中所述第二光激活蛋白是当用光照射所述细胞时能够调节所述细胞中的去极化电流的蛋白。
61.根据权利要求59所述的动物细胞，其中所述第二光激活蛋白选自由VChRl、DChR,SFO和ChR2组成的组。
62.—种细胞群体，所述细胞群体包含根据权利要求53-61中任一项所述的细胞。
63.一种用于制备根据权利要求53-61中任一项所述的细胞或根据权利要求62所述的细胞群体的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码含有与SEQ ID NO :4中所示序列至少95%相同的核心氨基酸序列的光激活蛋白的核苷酸序列、ER输出信号和膜运输信号。
64.根据权利要求63所述的多核苷酸,其中所述多核苷酸在表达载体中。
65.根据权利要求64所述的多核苷酸,其中所述表达载体是病毒载体。
66.根据权利要求65所述的多核苷酸，其中所述病毒载体是AAV载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、HSV载体或慢病毒载体。
67.一种使用根据权利要求53-58中任一项所述的细胞的方法，所述方法包括用光激活所述光激活蛋白。
68.一种使用根据权利要求59-61中任一项所述的细胞的方法，所述方法包括将所述光激活蛋白在其各自的波长激活。
69.一种非人动物，所述非人动物包含根据权利要求59-61中任一项所述的细胞。
70.一种识别动物或组织中的神经细胞之间的跨突触连接的方法，所述方法包括a)对所述动物或组织的区域A中的神经细胞施用编码融合到跨细胞示踪蛋白的Cre重组酶的第一病毒载体山)对所述动物或组织的区域B中的神经细胞施用编码光激活蛋白的第二病毒载体，其中所述光激活蛋白的表达取决于所述Cre重组酶的存在；以及c)识别在区域B中表达所述光激活蛋白的神经细胞，其中在所述神经细胞中的光激活蛋白的表达指示所述细胞与区域A中的所述细胞跨突触连接。
71.—种产生动物或组织中的靶标神经细胞的光控制的方法，所述方法包括a)对所述动物或组织的区域A施用表达融合到跨细胞示踪蛋白的第一病毒载体；b)对所述动物或组织的区域B施用编码光激活蛋白的第二病毒载体，其中所述光激活蛋白的表达取决于所述Cre重组酶的存在，并且其中在区域A和区域B中的神经细胞跨突触连接；以及c)用激活所述蛋白的光控制区域B中的神经细胞的动作电位。
72.—种控制动物中的神经元的动作电位的方法，所述方法包括用光激活所述神经元中的光激活蛋白以产生动作电位的改变，其中所述神经元中的光激活蛋白的表达通过以下步骤产生a)对所述动物的区域A施用表达融合到跨细胞示踪蛋白的Cre重组酶的第一病毒载体，b)对含有所述神经元的动物的区域B施用编码光激活蛋白的第二病毒载体，其中所述光激活蛋白的表达取决于所述Cre重组酶的存在，其中在区域A和区域B中的所述神经元跨突触连接。
73.根据权利要求70-72中任一项所述的方法，其中所述病毒载体是选自由AAV、HSV和慢病毒组成的组的病毒载体。
74.根据权利要求70-72中任一项所述的方法，其中所述跨细胞示踪蛋白是麦胚凝集素(WGA)或破伤风毒素-片段C(TTC)。
75.一种动物细胞，所述动物细胞包含表达对蓝光响应的质子泵的整合外源分子，所述外源分子来源于蓝隐藻。
76.根据权利要求75所述的动物细胞,其中所述动物细胞是神经细胞、肌细胞或细胞系O
77.根据权利要求75所述的动物细胞，其中所述外源分子含有表3中所示GtR3氨基酸序列。
全文摘要
本发明提供多核苷酸和用于在动物细胞中表达光激活蛋白以及通过光刺激改变所述细胞的动作电位的方法。本发明还提供动物细胞和包含表达所述光激活蛋白的细胞的非人动物。
文档编号C12N5/071GK102844427SQ201180014303
公开日2012年12月26日 申请日期2011年3月17日 优先权日2010年3月17日
发明者K·戴塞鲁斯, 张峰, V·格拉蒂纳鲁 申请人:小利兰·斯坦福大学托管委员会