专利名称：溶于复杂混合物中的不同分子靶的分离和/或分析设备的制作方法
技术领域：
本发明涉及分离和/或分析溶于复杂混合物中的不同分子靶、特别是核酸或蛋白质分子靶的设备。本发明特别涉及分离或分析分子靶的设备，其中包括由生物聚合物探针构成的芯片或阵列。这样设备用于分离和/或检测溶于复杂溶液中的多种分子靶。根据本发明的第一个实施方式，设备包括a.微型柱阵列，其包括放置在同一平面上的N个行和P个列的微型柱，每个微型柱包括一种固定的分子探针型，根据本发明的一个实施方式，通过探针/靶特异连接，能保留在复杂混合物中存在的特异分子靶，b.平行于所述微型柱阵列平面并在其上面的平面内的第一毛细管网，所述的第一毛细管网能将接到所述设备中的复杂混合物循环到如在a中定义的阵列的每个微型柱中，c.平行于该微型柱阵列平面并在其下面的平面内的第二毛细管网，所述的第二毛细管网能将洗脱后的分子靶循环到一个或多个检测器中，由此回收它们和/或对它们进行分析，d.如果必要，用于回收和/或分析不同的分子靶的检测器，优选质谱仪。
本发明还涉及分离和/或检测溶于复杂溶液中的多种分子靶的设备，所述的设备包括a.毛细管网，它能使加入所述设备的复杂混合物循环，b.两组置于毛细管网两侧的电极-官能化电极组，其中这些电极接入由点组成的探针，每种探针通过探针/靶的特异连接能保留在该复杂混合物存在的特异分子靶，-非官能化电极组。
本发明还涉及这样一种设备尤其在分离和/或分析生物试样中含有的DNA或RNA分子中的用途。
人们知道可采用质谱法分析测定大分子的质量，例如DNA、RNA或蛋白质的质量。如果采用这种方法分析伴随有分子分解，还可以测定它们的序列。不过，对于具有不同尺寸和序列的分子混合物，采用这种技术就变得很困难，甚至不可能鉴别这些不同的分子。
可采用其它方法替代质谱进行检测。
因此，表面等离子体共振(SPR)能够测定用具有自由电子金属(例如金或铂等)制成的小厚度(xnm)薄片表面上小距离(200nm以下)内的累计物质密度。事实上，在该金属薄片的其中一个面上反射波随在另一面附近物质的密度和量成比例地改变。然而，确实不可能区分引起反射波改变的不同类分子。此外，采用这种方法，检测在生物-芯片上固定靶的灵敏度目前低于使用标记分子荧光所达到的灵敏度。在该金属表面上探针存在本身因远离金属靶而降低其检测灵敏度。动力学测量靶/探针相互作用时，在该表面附近存在的自由靶分子使这种测量走样。一般而言，由于效能的缘故，采用SPR方法检测需要使用比荧光或放射性标记法多的材料量。因此，采用SPR检测还与一些实验不相容，特别在诊断领域更是如此。
另外，可以求助于测量在不同分子状态之间存在的阻抗变化。
具有一定序列的单链DNA分子的阻抗与相应的双链配对复合体的不同。这种性质用于评估DNA芯片上的杂交比例，因此可评估在生物-芯片上生成的探针-靶复合体数(ref.)。一般而言，这些阻抗变化可以用于研究分子间的相互作用，例如配体固定在其受体上，但也可以用于研究DNA或蛋白质与药物、离子等之间的相互作用。不过，对于这些生物芯片，这种检测方法受到下述因素制约1)难以制造2000个点以上的高密度芯片。事实上，由于制造这些阻抗芯片所使用的电极尺寸和连接物几何结构，点数一超过800个，杂交面积就变得非常大。然而大的杂交面积要求应该布满很大杂交面积的试样体积，因此需要大量的生物材料，以便达到这种检测的最小浓度。这与例如对于这些诊断可使用材料不多的实验有矛盾。
2)所研究分子的构象变化(探针和/或靶)会造成测量结果的假改变，导致不能解释测量的阻抗变化。例如，由于分子内序列或杂交而产生的DNA变形与杂交所引起阻抗的变化为相同的数量级。
在现有技术中采用场效应晶体管作为电流放大器，测量与DNA分子杂交相关的阻抗变化(ref.)。把探针接到晶体管栅极。这些靶固定后，它们改变了栅极阻抗，这样引起在(晶体管输入)电源与晶体管输出漏极之间的电流改变。
但是，还没有描述过这类检测器的任何网状结构。使用场效应晶体管作为电流放大器这个事实制约了为证明与杂交相关阻抗变化而可使用的交流电流频率，自此制约了检测器的灵敏度(ref.)。此外在上述说明中，这种栅极控制了晶体管中电流通过，其中植入这些探针消除了使用如电极的晶体管不同端子来控制靶运动，由此引导杂交集中在靶与探针层面上的可能。
由生物聚合物探针组成的阵列(DNA芯片、蛋白质芯片等)能够定性和定量地分离在混合物中存在的生物聚合物，这在理论上是可行的，不管其数量、序列和复杂性。但是，例如核酸网络不能绝对精确地计算杂交分子数。此外，采用实际可用的技术，检测生物芯片上的生物聚合物(微-阵列)是间接的，因此需要一个对它们进行标记的步骤(荧光、放射性等)。如果在生物聚合物中放射性标记残留物和冷残留物加入效率几乎相同时，这与使用荧光标记物不同(Martinez等人，《Nucl.Acids.Res.》2003，31，第18页；Hoen等人，《Nucleic Acids Res.》，2003年3月1日，31(5)，第20页)。合成加入荧光标记物CY3和CY5的DNA分子时尤其会遇到这些标记问题。由该后一类标记得到的立体阻塞物还可能严重地改变反应(通常的杂交、抗体-抗原反应、靶-配体反应等)的动力学和化学计算量平衡。采用放射性同位素可克服这些立体阻塞物问题；不过，这些放射性同位素牵涉到放射性废物的管理。另外，采用放射性方法标记分子的检测技术，即实质上放射性的磷成像类检测技术(Bertucci F等人，《Hum Mol Genet.》，1999年9月，8(9)，第1715-22页；Erratum in，《Hum Mol Genet.》1999年10月，8(11)，第2129页)，与不同类型的荧光检测扫描仪，对于达到进行测量的检测阈值和再现性，在芯片上待杂交生物材料量方面有一些限制。事实上，不可能使用含有低细胞数(约1000个细胞)的试样通过细胞检测以某些拷贝数存在的分子，然而，这些细胞数量却与通常的临床取样情况相对应。
使用经典DNA芯片的另一种选择在于使用沿整个毛细管长度呈环状排列的探针使该毛细管内官能化，每个环是由对一种基因特异的探针型构成的。较小的毛细管直径(约100μm)能够在理论上减少可分析试样的体积，因此例如使用较低的标记生物材料量就能够达到荧光法可检测的浓度。然而，与降低反应体积相同，在探针环中每个进行杂交靶的浓度依赖于整个毛细管的体积。探针数增加得越大，毛细管的长度就应该越长，达到检测浓度需要的材料量(例如待分析试样)就越大(毛细管的体积与其长度成正比)。使用毛细管时，与试样标记相关的这些问题依然相同。另外，使用大量不同探针生产官能化的毛细管是棘手的，费用也高。
最后，一般而言在该技术状况中描述的DNA或蛋白质芯片是单次使用，这样使每个实验点的使用成本非常高。这种使用的独特性大大制约了这些技术在为诊断所作的临床研究和试验方面的普及。
本发明提供一种设备，它能够分离和/或分析在复杂混合物中存在的特异分子靶，特别是生物聚合物分子靶，例如RNA、DNA或蛋白质分子。本发明的设备在大量实验中是可重复使用的，还能够测量约微微微摩尔(10-18)，甚至zepto摩尔(10-21)的产物浓度。使用有限细胞数，例如约千个，甚至百个细胞，这些极限能够通过细胞鉴定单拷贝存在的分子。另外，根据本发明的某些实施方式，该设备能够进行对比分析，因此能够同时分析多个试样。根据本发明的另一个实施方式，该设备能够通过探针直接测量例如保留在所述阵列每个微型柱中或在阵列杂交点中的核酸或蛋白质序列。
因此，本发明的一个方面涉及分离和/或分析溶于复杂混合物中的几种分子靶的设备，所述的设备包括a.微型柱阵列，包括放置在同一平面上的N个行和P个列的微型柱，每个微型柱包括固定的分子型探针，它能通过探针/靶特异连接保留在复杂混合物中存在的特异分子靶，b.在平行于所述微型柱阵列平面并位于其上面的平面中的第一毛细管网，所述的第一毛细管网能将加到所述设备的复杂混合物循环到如在a中定义的阵列的每个微型柱中，c.在平行于该微型柱阵列平面并位于其下面的平面中的第二毛细管网，所述的第二毛细管网能将洗脱后的分子靶循环到一个或多个检测器中，因此能回收它们和/或对它们进行分析，d.如果必要，检测器，它能回收和/或分析不同的分子靶，优选质谱仪。
如果必要，电极系统能够操作、替换在这些网中的靶。
术语“毛细管”应该理解是允许循环流体，直径小于1毫米，优选地1-100μm的任何合适管道。
在本发明的意义上，“分离复杂混合物中的分子靶”应该理解是这种操作，它能够获得富含初始复杂混合物中存在的特异分子或分子靶的不同体积的溶液。这里“富含”应该理解是在分离后所得到的溶液中至少50％，优选80％，还更优选至少90％的分子是这些分子靶。
“分析分子靶”应该理解这种操作在于鉴定在待分析复杂混合物中存在的分子靶(测定)和/或确定这种分子靶的相对或绝对量(定量分析)。
术语“复杂混合物”在本发明的意义上应该理解是含有大量不同结构分子的溶液，特别地是含有100种以上具有不同结构分子的混合物。更优选地，本发明的设备用于分离和/或分析特别在生物源试样中含有的生物学分子(或生物分子)。
更具体地，可能涉及从生物组织或液体中采集的试样，例如血液、血浆、脑脊髓液、尿或唾液。可以从动物(特别地哺乳动物，优选人)采集试样。特别可以从健康个体或患有病理学疾病的患者采集试样。该病理学疾病具体可以是癌症、神经变性病理学、感染病理学，特别是病毒、细菌或寄生虫感染病理学疾病。这种试样还可以含有组织提取物或细胞提取物，其来自真核细胞或原核细胞、细菌、蕈类或酵母，特别是培养物中的细胞或从外部环境采集的细胞。还可以从植物中采集获得这种试样。还可能涉及从农产品加工产品中进行抽取，特别是从烹饪食品中进行采集，或从谷粒、水果或粮食中进行采集。
这种设备因此可以用于各种用途，特别是用于药物诊断或农产品加工质量控制，或任何生物学分析，特别用于生态学、考古学或犯罪学领域。
本发明设备的每个微型柱包括任何形状的室，例如管状室，其直径优选地是2-1000μm，优选地20-100μm，长度2-2000μm，优选地40-200μm。
每个室通过第一端与第一毛细管网的毛细管连接，通过其相反端与第二毛细管网的毛细管连接，因而可能让在毛细管网中循环的流体通过整个室。
所述设备通常由置于同一平面中多个室的N个行和P个列的阵列构成。这些室相对于该平面可以有任何的倾斜度，但是由于实际的原因这些室优选地平行或垂直于该阵列平面。由于堵塞的原因，这些室的两行中的一行可以呈梅花形放置。
特别地，在制造本发明设备时在合适材料表面的厚度内可以凿出或模塑这些室，于是构成该阵列的平面，所述材料例如是玻璃、硅、塑料、Kapton、碳、金或任何其它材料。
本发明设备的微型柱阵列因此由大量的室构成，例如1至1百万个室，优选地100-100000个室，因此能分离和/或分析在同一试样中会含有的如此之多的特异分子靶。
所述分子探针放置并固定在每个室中，优选地，根据探针的具体特性放置并固定在每个室中，于是构成每个都能够保留特异分子靶的色谱微型柱。
在本发明的意义上，术语“固定”表示当循环流通过有这些分子探针的微型柱时，特别是在电场、磁场存在下，或在预先注入该设备毛细管网中的循环流的存在下，这些探针保持在这些室中。
该设备因此由微型柱阵列组成，其中每个微型柱包括大量(例如106-1010)具有同样特性的探针，这些探针被固定，并能在适当条件下特异地与相应分子靶连接。下文用术语“分子探针”表示这些探针。探针与所述复杂混合物中含有靶的连接的术语“特异连接”，表示该探针与特定靶连接，但与其它分子连接不多，更特别地与该复杂混合物中存在的其它靶连接不多。
优选的探针-靶对，特别是与互补序列杂交的核酸，例如用特定的寡核苷酸探针杂交信使RNA、DNA或cDNA分子，由抗体或其的功能片段组成的探针专门识别抗原，或任何的受体-配体对，反之亦然。
本技术领域的技术人员能将所述的设备用于分离和/或分析任何类型的分子，当它们结合成为特异识别的实体时，该实体含有分子探针，所述靶分子于是能特异地与在支持物上固定的所述分子探针连接。
例如借助与一种不能从所述室出来的单元的强相互作用可以达到将探针固定在每个室中。这种偶联方式例如是这些探针固定在该室内壁上，特别是通过共价键或任何其它的强相互作用将这些探针固定在该室内壁上。
或者，这些分子探针可以固定在微粒上，该微粒结构是使得它们不可能从其室中逃逸(Huang等人，《分析化学》(Anal.Chem.)，2002年，74(14)，第3362-3371页；Ugolin等人，FR0015398，2000年，11月)。所述微粒的平均直径例如是大于每个微型柱进口或出口毛细管的直径。如果这些微粒能经受或提供磁吸引力，并且如果所述室的一部分壁能另外提供或经受磁吸引力，则通过这些微粒与该室的一部分内壁的磁相互作用或许可以将这些微粒保留在该室中。
在一个特别的实施方式中，所述分子探针在每个室中被固定在凝胶上，因此妨碍所述的分子探针迁移到所述微型柱外。例如通过与构成凝胶的分子的强相互作用或共价键保留所述分子探针。
在一个优选的实施方式中，每个室填满了凝胶，而所述分子探针与一些微粒联接，该微粒直径大于凝胶网络结构尺寸，因此允许将这些微粒固定在所述微型柱中，由此固定联接所述的分子探针。
可以采用任何合适方法将这些分子探针与这些微粒或与所述室内壁联接。作为例子，特别可以列举在同生物素联接的分子探针与用抗生物素蛋白官能化的珠之间的生物素-抗生物素蛋白型的非共价联接，例如以“dynal”销售的这些产品(Dynal全世界经销商，版权1996，DynalAS-技术手册第二版)。
一般而言，就这些色谱柱所描述的所有联接、化学键合、强相互作用类型可能都适合。
特别地，可以将所述探针直接固定在装在每个微型柱中的凝胶聚合物上。
在另一个实施方式中，特别地，在所述探针是核酸的情况下，为了使该探针与微粒共价联接，可能的是合成一种非均相聚合物polyX/探针，例如聚-吡咯/核酸。事实上，在5′端或3′端与吡咯连接的这些核酸分子探针具有与游离吡咯分子聚合的特性，于是生成一种非均相聚合物，因此，这些尺寸足够大的非均相聚合物可以起到上述微粒的作用。
另外一种选择是使用在5′端和/或3′端与桥联剂连接的核酸探针，例如补骨脂素。探针序列可以呈下述形式补骨脂素5′(Y1)Xn(Y2)3′。Xn代表严格意义的探针，而Y1和Y2是如此选择的序列，以致这些探针能够被连接，彼此无须通过互补性来制约。作为实例，这些聚合探针可以由5′(T)mXn(A)m3′补骨脂素等摩尔混合物组成，其中m＝5。在紫外辐射作用下，这些探针聚合成大分子(聚5′(T)mXn(T)m3补骨脂素3′(A)m(X)n(A)m5′等)，它可以保留在每个室中。
所有上述的相互作用类型也可能都适合探针直接固定在所述室壁上的情况。特别地，通常利用的相互作用也可能适合固定核酸探针的DNA芯片或固定多肽探针的蛋白质芯片(赖氨酸/核酸静电相互作用、硅烷固定、吡咯在其室表面上的聚合作用、补骨脂素固定等)，如同在珠或室壁上原位合成方法。同样可考虑使用尼龙或硝基纤维素将这些探针不可逆地固定在微粒或所述室壁上(这时微粒或壁是用这些材料制成的)。这种固定可以是直接的，或借助桥接进行固定，例如在尼龙微粒与分子探针之间的补骨脂素桥。
在一个特别的实施方式中，同源可考虑使用孔直径足够小的孔过滤器(例如，直径小于过滤微粒的直径)将与微粒联接的分子探针机械保留在该室中。这样一些过滤器(特氟隆过滤器等)目前使用和销售。
分子探针在其支持物上固定应该强到足以耐受在操作所述靶时所施加的不同处理与承受所采用的任选电场。
本发明的设备包括一个或两个毛细管网，它们与能够控制待分析靶的洗脱和/或迁移的电极连接，采用将所述探针固定在生物芯片支持物上的所述任何化学方法都可以将这些探针固定在所述电极上。在用ITO(或任何其它透明合金、ATO、ZNO、FTO)制成的电极的情况下，可以实现具有亲水基团探针的直接沉积，例如PO3-(参见ref.)，如这些核酸便是这种情况。
需要采用封装方法将没有接受探针植入的电极部分分开。例如，可以使用一种聚吡咯薄膜。在吡咯溶液的存在下，将这些植入的电极置于电压下时，制造出这种薄膜。这种吡咯在电流作用下自发地聚合，并离析出电极的自由部分。在植入探针后，这些电极还可以用不会被所述靶杂交的单一寡核苷酸(polyA例子)进行饱和。
本发明涉及在用ITO制成的电极上通过直接吸附固定核酸聚合物的方法。
所述设备包括两个毛细管网时，允许待分析混合物循环通过所有的微型柱。相应的所述靶特异地保留在每个微型柱上。然后洗脱该靶，即从与其特异结合的分子探针上洗脱它们，然后迁移到一个或多个检测器，同时到达在微型柱出口的毛细管网。
考虑到大量的微型柱，很容易理解到为了顺序分析靶，可能有利的是在N*P微型柱阵列的情况下，在每个微型柱中或在例如一行一行地排列的至少不同的微型柱组中，能够分别控制洗脱和/或迁移所述的靶，如作为优选实例所描述的。
按照本技术领域的技术人员已知的对于二氧化硅采用酸腐蚀技术，或对于塑料采用激光加工方法，在诸如二氧化硅、塑料(像有机玻璃)之类的材料中，例如凿出或模塑出这些毛细管网。
在一个优选的实施方式中，在合适材料板的厚度内凿出每个毛细管网。所述设备这时包括微型柱阵列和两块已凿出这些毛细管网的板，这些毛细管网粘接在阵列的每个面上(Kuo等人，《化分析学》，2003，75(10)，第2224-2230页；Kuo等人，《化分析学》，2003，75(8)，第1861-1867页)。
在一个特别的实施方式中，如上所述的本发明设备的特征在于，它包括一些工具，在阵列的一个或多个特定微型柱中，这些工具能够控制分子靶洗脱和/或在洗脱后将它们保留在这些微型柱中。
“洗脱”应该理解是消除在所述靶与所述探针之间已建立的所述特异连接的操作。
在本发明的意义上，“在特定的微型柱中控制洗脱和/或靶迁移”应该理解是，该设备能够选择一些微型柱，其中的靶会被洗脱或迁移到所述检测器中，而其它的靶没有被洗脱或仍保留在所述微型柱中，尽管或许有液流通过所述的微型柱。
如果使用同样的分析设备时，这时有可能分别分析从每个微型柱或微型柱组洗脱的靶，按照这种实施方式的设备尤其能够限制所采用检测器的数量。
在一个特别的实施方式中，当所述分子靶是带电荷的分子，例如核酸时，有可能通过施加电场控制这些靶的洗脱和/或迁移，例如使用与每个微型柱接触并在每个微型柱出口排列的电极组。在每个室中的这些电极可以是彼此独立的(室与室多路传送)或是由电极组组成的，因此每一组室形成每个电位单元。
因此，在一个特别的实施方式中，本发明的设备包括第一电极，即室或中间电极，放置在与每个微型柱接触，优选地在微型柱的中间，以及第二电极，即远侧电极，放置在每个微型柱的出口，因此能控制将保留在一个或多个特定微型柱中的分子靶洗脱和/或将它们迁移到所述检测器或洗脱后将它们保留在这些微型柱中。
设置这些室电极以便在洗脱后通过电相互作用将一些带电分子保留在该微型柱中，然后允许它们选择性迁移。这些室是管状时，例如安排所述分子与室的侧壁接触。
如果所述设备能洗脱和/或将分子靶分别迁移到检测器，所述设备可以包括一个合适的毛细管网，它尤其能把在微型柱出口的分子靶会聚到有限数量的检测器中，甚至单个检测器中。
另外，在一个优选的实施方式中，本发明的设备特征在于通达微型柱进口的第一毛细管网和通达微型柱出口的第二毛细管网，所述第一毛细管网包括加入复杂混合物的第一横向毛细管，以下称之上横向管道，其直径优选地是2-1000μm，其与通达所述阵列微型柱的所有毛细管连接，所述第二毛细管网包括将所述微型柱与所有毛细管连接的一个或多个横向毛细管，其称之下横向管道，直径优选地是2-1000μm，该下横管道与一个或多个检测器连接。
所述下和上横向管道每个优选地与电极连接，因此在待分析复杂混合物加入点与所述检测器之间能施加一个电位差，由此还能够保证带电分子在整个设备中迁移，特别是能够通过电泳保证在待分析复杂混合物含有的核酸在整个设备中迁移。
在一个特别优选的实施方式中，本发明设备的特征在于所述微型柱阵列包括安排在同一平面内的N个行和P个列的微型柱，其特征还在于它包括一些工具，它们能够控制保留在特定行微型柱上的分子靶的洗脱和/或将它们迁移到所述检测器和/或在洗脱后将它们保留在所述微型柱上，其特征还在于选择第二毛细管网的每个毛细管长度，以使在微型柱出口与下横向管道之间的距离因第二毛细管网的毛细管之间的不同而不同，优选地从连接一行第一微型柱的毛细管到连接该行最后微型柱的毛细管是递增或递减的，结果对于同一行的每个微型柱，分子靶通过微型柱出口到达检测器的时间都是不同的。
作为实例，为了达到来自同一行每个微型柱的靶的不同迁移时间，将每个微型柱与下横向管道连接的毛细管网可以包括P个平行毛细管，每个毛细管可将所述阵列中同一行的P个微型柱与下横向管道连接起来，并与不同的所述下横向管道形成角度90°。为了进一步延迟标记，在室的最后行与横向管道之间的这些毛细管部分沿着非线性路径行走。
能够通过不同靶的迁移时间鉴定所述靶来自的微型柱，因此能够采用在微型柱中的分子探针鉴定上述靶。由此选择毛细管的直径和其中使用的任意凝胶密度，从而并不从大小标准方面辨别这些迁移分子，而迁移时间只是取决于达到的途径。然而，任选地可以选择凝胶密度，以便通过毛细管电泳进行色谱分离。分子迁移时，采用适当的凝胶可使具有不同尺寸的分子有不同延迟，或使诸如在同一探针上被杂交的具有小的序列多形态的分子有不同延迟。
优选地，下横向管道以及具有不同距离第二毛细管网的不同部分都装满凝胶。因此，靶快速迁移直到第二毛细管网的毛细管不同部分，在此进行色谱分离。
为了控制所述设备微型柱每行的靶的洗脱和/或迁移，同一行的所有P个微型柱都可以与同一电极连接，本发明的设备因此包括N个行电极(室行电极)，优选地在微型柱中间的行电极，和第二组与行电极平行的电极(远侧的行电极)，同时在同一行的微型柱出口将P个毛细管连接起来。
于是得到一种室或中间行电极网一种微型柱阵列行电极。除了在每个室中允许靶的毫微-操作外，这些电极可以催化探针固定，例如与吡咯连接的探针，在电场作用下其固定在每个电极中。第二组远侧的行电极，即室行电极的镜面电极，安排在微型柱阵列的室的出口。所述行电极对确定了N*P微型柱阵列的电位单位。所述电极对能够向微型柱的每行施加所期望的电位。
根据所述设备的一个优选实施方式，第一和第二毛细管网位于平行于微型柱阵列平面的平面中，优选地它们分别在由该微型柱阵列构成的平面之上和之下，而第一毛细管网，称之上毛细管网，包括N个平行的毛细管，每个毛细管将上横向管道与该阵列同一行的P个微型柱连接起来，而第二毛细管网，称之下毛细管网，包括P个平行毛细管，每个毛细管将该阵列同一列的N个微型柱与下横向管道连接起来，在上下两个毛细管网之间形成的角度不是0，优选地是90°。因此，通过微型柱阵列的每行P个室将上毛细管网的每个毛细管与该下毛细管网的所有这些毛细管连接起来。反之亦然，通过微型柱阵列的每列N个室将下毛细管网的每个毛细管与该上毛细管网的所有毛细管连接起来。
在一个特别的实施方式中，其中包括N*P微型柱的这样一种阵列，与上横向管道相反的上毛细管网的毛细管末端，优选地与该微型柱阵列行的第P个和最后一个微型柱最后连接而中止，以及下横向管道相反的下毛细管网的毛细管末端，优选地与该微型柱阵列微型柱的列的第N个和最后一个室最后连接而中止。
在另一个实施方式中，让与横向管道相反的下毛细管网的毛细管末端与第二横向毛细管(副下横向管道)连接，这个管道能在通过所述微型柱阵列的两个下、上毛细管网之间确立流，这样能够加速和更精确地控制在下毛细管网中迁移。事实上，如果主下横向管道装满一种凝胶以使微毛细管电泳达到这个水平，这时总有可能在上横向管道与副下横向管道之间建立封闭循环流。
一般而言，这些毛细管网可以装填凝胶，例如聚丙烯酰胺或任何其它凝胶，这种凝胶能够调节这些流，分子迁移时还能够控制它们扩散，特别是毛细管电泳使用的液体凝胶。
在装有N*P微型柱阵列的设备的一个特别实施方式中，上和下横向管道装有有或没有螺纹的活塞，因此能够控制所述流通过的微型柱的行数。往后移动时，该活塞使所述阵列的微型柱行越来越多。
在制作有槽的空心活塞时，可能任选地使微型柱的行逐行移动。
在一个特别的实施方式中，在无流动的杂交期间进行靶循环，同时在上、下横向管道的这些电极与相继的行电极之间建立交变电场。这个电场能够有规律地使这些未杂交靶混合，以使杂交溶液均匀。此外，通过调节电场力有可能控制杂交的特异性(Cluzel P，1996，《科学》(Science)，Vol.2071(5250)，第792-794页)。
一个使用叠置双毛细管网的较简单的替代办法是使用单个毛细管网和行电极对组，构成本发明的设备。
所述设备这时呈由点组成的探针阵列形式(相应于一个杂交单位)，其中每个点由分子型探针构成，例如核酸聚合物型，其序列对于一种基因是特异性的(蛋白质应涉及抗体型或特异配体)。将该阵列点的每个行放在金或ITO(或任何其它合适的金属或合金)表面上，同时规定了电极的范围，这时整个阵列由对应于行数n的n个电极构成，每个行电极包括植入探针的P个点(参见图7)。在绝缘材料，例如玻璃、kapton、氧化铝等上通过薄层镂蚀这些电极(参见示意图)。
制作第一组电极的镜面第二组电极，但是这次该电极不用接入探针，这些电极是所述的非官能化的。两组电极与P个平行毛细管网彼此相对放置，结果有一个电极组在上面，另一个电极组在下面(图8和9)。第一官能化电极组具有植入由点组成的探针的电极，每种探针存在于所述复杂混合物中时，通过探针/靶特异连接能保留特异性的分子靶。第二电极组具有非官能化的电极。在一个特别的实施例中，所述官能化电极组位于所述毛细管网上面，而所述非官能化电极组位于所述毛细管网下面。每个毛细管与该官能化电极组的n个电极和该非官能化电极组的n个电极垂直(图9、10、11)。该构造如此实现，以致n个官能化电极的第一点是在该毛细管网的第一毛细管中，n个官能化电极的第二点是在该毛细管网的第二毛细管中，依此类推(图11)。电极对是由在该毛细管网上面接入由点组成的探针的电极和在该毛细管网下面的非官能化电极相对而成的。这些电极的厚度可以非常小，能够采用SPR进行检测。在毛细管网的每个末端，这些毛细管会聚到一个圆形容器。该容器包括在与该官能化电极组相同的平面内的电极(容器电极)(图11)。在一个特别的实施例中，这个电极是圆的。在一个特别的实施例中，这个电极处在每个容器顶部的中心。所述官能化电极组(植入探针的电极)是由两个补充连接电极完成的第一弯曲电极位于第一容器电极与第一官能化电极之间，第二弯曲电极位于第二容器电极与最后的官能化电极之间。该连接电极是弯曲的，其曲率如此确定，以致于该连接电极与该容器中心(容器电极)之间的距离在任何电极点都是相同的。
第一补充连接电极位于第一容器电极与第一官能化电极之间，第二补充连接电极位于第二容器电极与最后官能化电极之间，结果在该连接电极与该容器电极之间的最短距离在任何电极点都是相同的。
上面对本发明的设备作了描述，该设备包括所述网构成单元的双毛细管网，该单元例如是毛细管、电极、检测器等，这种描述可适用于制作包括单一网的设备，前提是其与具有单一网的这个设备运行相容，如果需要这个结构还可改动。
类似地，对待分析分子和使用的探针以及它们的制备、使用和检测方式所作的描述都可适用于制作包括单一网的设备，前提是其与具有单一网的这个设备运行相容，如果需要这个结构还可改动。
包括唯一一个毛细管网的设备运行原理是利用活性杂交(ha)，并可描述如下
1)把待分析试样(图12)接到第一容器中。这些分析的分子是核酸时，在第一连接电极(正)与第一容器电极(负)之间施加一个电位。在分析蛋白质时，这个电位可以交替地颠倒。本说明书下面涉及这些核酸的作用。这些待分析分子以等摩尔方式迁移到每个毛细管中，并浓缩在所述连接电极上。
2)然后，切断容器电极与连接电极之间的电位，而在第一官能化电极(+)与连接电极(-)之间施加一个电位。这时，每个毛细管的这些分子迁移到第一官能化电极，在这里第一电极点的互补靶(通过毛细管的点)可能被杂交(这种电场加速其杂交)。在每个点的浓度是最大的(它只是取决于毛细管的数量，不再取决于管道化总体积)。
3)为了将这些靶限制在点内，可以把第二行电极(非官能化的)调到负电位；达到一种电荷分布(-+-)，其中+电荷的中心在每个毛细管的第一点上。为了改善这种杂交作用，这些电位可以是不连续的。无电位的时间间隔相应于松驰时间，在这个时间里这些靶可以无限制地进行杂交。为了增加待分析靶的混合，有利于少量存在靶的杂交，在松驰时间里，在所述毛细管网上面和下面的第一电极对之间可以建立间断的交变电位(这还改善杂交的特异性)。
一旦这些靶在点的第一行水平进行杂交，第一行就会去除这些电位。连接电极位置记为0，接入探针的第一、第二和第三官能化电极的位置分别记为1、2和3时，施加的电位顺序可以如此描述4)第二官能化电极处于正电位，电荷的分布是(0-、1+、2+)(任选地，第三电极处在负电位)，电荷分布(0-、1+、2+、3-)；5)第一官能化电极处于负电位，电荷分布是(0-、1-、2+)，任选地(0-、1-、2+、3-)；6)连接电极处于0，电荷分布(1-、2+)，任选地(1-、2+、1-)；7)在官能化电极2与非官能化电极2之间的间断交变电位。
在点的第一行中所有非杂交探针会迁移到点的第二行中。全部的迁移、松驰、混合顺序(点4-6)逐步应用于使在分析试样中有互补靶的所有行的所有点杂交。一旦到达第二容器，已迁移到不同毛细管中的这些靶再进行混合。这时有可能按照一种实施方案沿着另一方向达到这些电位顺序，以便沿着相反方向通过这个毛细管网。靶在两个容器之间来回通过这些毛细管能够提高该设备的检测稳定性。
根据前面就具有双毛细管网的设备所描述的，使用具有唯一一个毛细管网的设备对这些杂交靶进行量化，可考虑有多个检测可能性。关于SPR·可以直接就这种官能化电极网对这些靶进行量化。为了能进行SPR测量(参见用SPR检测章节说明)，在官能化电极网的每行电极背后安装呈三棱体状的棱镜。
·为了减少检测本底噪声和解决灵敏度的问题，可以对所述非官能化电极组进行SPR测量，其中与每个电极毛细管相反的这个面同三棱镜联接(参见spr章)。在这个检测方法中，该官能化电极组可以与一种结构联接，或每个点被小室分隔开并限定其范围(图13)。每个室是一个小槽，其底是由官能化电极构成的，并且它是在非官能化电极对面朝着该毛细管敞开的(在毛细管网的毛细管一侧敞开的室)。这些室间隔避免了其中一个靶在官能化电极与非官能化电极之间迁移过程中一个点靶与另个点靶混合。
在使用有侧边和单个毛细管网的敞开室的情况下，有可能使横向管道适合于毛细管系统和迁移延迟系统(参见如有关具有双毛细管网设备的下毛细管网所描述的章节)。在使用单个毛细管网的情况下，有可能取消第二容器，用毛细管系统的横向管道和迁移延迟系统取代该容器(图14)。因此，具有两个叠置毛细管网的这个系统的所述同样检测类型也可应用于简化系统。
在这种构型中，第一连接电极是如此弯曲的，以致在连接电极与容器中心之间的距离在该电极任何点处都是相同的，还在于第二连接电极不是弯曲的。杂交时，这个电极用于确定这些探针不可越过的电边界，然后在检测步骤，这个电极应能够借助由靶电极和连接电极所确定的电位将这些靶引向该延迟系统。
如果所述电极相对于横向管道有一个凸角，则延迟效果被放大。关于荧光-如果所述靶用一种荧光标记物进行标记，则有可能用扫描仪在所述官能化电极组上直接读出这些杂交的靶。同样地，可以采用荧光与SPR(用SPR的损耗波激发荧光分子)的联用方法。
-所述靶没有标记时，使用靶或复合物的荧光配体时可以评价探针/靶复合物比率。对于DNA芯片，列举吖啶类，特别是吖啶橙，它是一种带正电荷DNA的插入子(intercalant)。吖啶橙能够有区别地标记单或双DNA，通过由这些电极系统产生的电场的作用消除其游离分子。借助能够控制所有带电荷分子的电极组，可以在杂交或络合反应过程中进行所有的测量。这个方法，可以估计组成该点的探针分子数和已杂交的靶数；这两种测量能够确定靶在溶液中的真实浓度。
为了避免来自电极的干扰荧光，使用ITO类的合金可以制作全部的连接物，这些合金在可见光区是透明的(氧化铟和氧化锡或任何其它等效合金等)。这些合金是非常亲电子的，它们严格能耐受在化学离析章中所描述的化学离析方法。
在一种本发明设备的特定结构中，这些探针可以放在该官能化电极组的这些电极之间(图7)。
在使用双毛细管网的情况下，本发明的设备包括一个或多个分开收集所述分子靶和/或分开分析所述分子靶的合适检测器，下面称之这个或这些检测器。
在一些优选的实施方式中，将所述检测器与下横向管道的出口相连，而下横向管道连接第二毛细管网的毛细管。在本文下面详细地描述了一种设备，它包括检测器和连接第二毛细管网所有毛细管的下横向管道。当然，其它的变化也是可考虑的，特别地，可以使用多个检测器，将每个检测器与下横向管道的出口相连，而下横向管道连接第二毛细管网的一部分毛细管。
在第二毛细管网的出口可以装配所有的检测系统，特别是能够区分诸如来自不同试样的分子靶的所述分子靶所使用的标记类型。
作为实例，如果这些靶可用荧光标记，特别是在用荧光探针标记后，可以使用分光光度计进行这种检测，该分光光度计能够激发或获得标记分子荧光或研究分子的固有荧光。为此，在一个特定的实施方式中，可能的是在下横向管道出口添加一种在石英晶体或任何其它透明材料中凿成的毛细管，该透明材料能够激发和获得这种荧光(例如塑料)。这种荧光通过该石英毛细管时被激发而可阅读。研究分子的自然荧光可以用于这种检测。同样地，在红外光谱法和喇曼光谱法中可以使用NaCl或KCl晶体进行研究。
或者，如果一些靶是用顺磁标记物标记的，则可利用顺磁或电子共振进行这些靶的检测和量化。
采用SPR进行检测时，远侧或内行电极是由厚度几十μm的金(或具有自由电子的其它金属)箔构成。每个远侧电极的外面(与管道相反)是与三棱镜(玻璃、石英、塑料或任何其他可以适合于该SPR的透明材料)的三个面拼接的。该三棱镜是由一种三面体构成的，其三个矩形面中的一个矩形面是与远侧行电极的外面联接的，三面体的长度相应于该电极的长度(图15)。
在靶杂交后，在所述微管道回路中进行漂洗与除去所有未杂化的靶，而杂化靶保留在每个室中或每个点中，以便简化概念。给该系统施加电压，以便在每行电极对中，分别在官能化和非官能化电极概念中，中间电极的电位是正的，而远侧电极的电位是负的。我们在描述时把官能化电极比作中间电极，而把非官能化电极比作远侧电极。对于这些蛋白质、抗体或分子受体芯片，这些电位随研究分子的电荷而改变。把能解开探针-靶复合体的离液剂加到该介质中。将这些探针与靶分开，但依然因中间电极的负电荷而保留在每个室或点中(图16)。在第一电极对中的电位颠倒过来，例如远侧电极的电位是正的，而中间电极的电位是负的。依赖于电极对的室或点每行的靶，迁移到该毛细管网中，进入与毛细管网垂直的远侧电极中(两个叠置网系统中的下毛细管网)，例如每个室或点的这些探针再处于不同的毛细管中。
本发明还涉及一种SPR分析方法，该方法包括-靶在电极上杂交，-用离液剂去杂交，-通过电位保持靶，
-颠倒电位使这些靶迁移到非官能化电极上，-测量非官能化电极上的SPR。
让光在远侧电极的外面上反射通过放在每个电极上的这些三棱镜进行SPR测量。通过观测所测量的SPR信号随着时间而改变的速度，有可能估算离解常数。将交变电流施加在一对行电极之间时，有可能测量探针/靶的结合常数和离解常数。在这种特定的情况下，这些实验中不使用变性剂，从而电场诱发的局部浓度变化能够实现探针和靶的这些结合和离解。
施加在电极上的电流可能干扰SPR信号。为了减少这种干扰，在行电极对之间施加的电场可以是间断的。这时只在电场中断阶段进行SPR测量。我们可以讲采用SPR脉冲与电场频率联用测量，有可能通过分析SPR信号随着行电极对之间电场中断时间而变化的速度测定分子的扩散系数。每对行电极都重复进行同样的操作。
由于金属表面没有官能化，这些靶可以与该金属直接接触，这样于是增加了检测的灵敏度。此外，该电场能够将这些靶最大地集中于该金属表面，这样也提高了检测灵敏度。由于SPR检测取决于质量，所以待检测分子越重，这种检测就越有效。因此增加分子量能够降低检测限。使用这些用重同位素置换的靶原子能够增加分子量，于是能够降低检测限。
在相应于使用单毛细管网的可替换办法的情况下，可能的是采用直接电检测法直接测量固定在靶上的分子阻抗。除了通过电场控制探针和靶的作用外，植入这些芯片中的电极系统还能够直接测量固定在靶上的分子阻抗。为了达到高的点密度，在低于20cm2表面上为103-106，生产一种交叉电极系统。该系统由位于在探针点的阵列下面和上面两个不同平面中的两个叠置电极组组成。所述非官能化电极组的方向垂直于所述官能化电极组的方向(图17)。例如在官能化电极与非官能化组的电极上平面投射的每个交点将这些点植插在该官能化电极组。探针联接取决于电极的性质和探针分子的性质(参见探针植入和电极绝缘章)。在DNA分子的范围内，为了降低因DNA弯曲和分子内杂交而产生的测量伪差，可考虑的是最大地限制分子构象，这些伪差会引起与杂交相同数量级的阻抗变化。一种限制DNA的办法是采用分子梳理将其吸收在电极上。在该电极上这些拉长分子不再可能发生它们自身的弯曲或杂交，相反地，它们还保持在溶液中与互补序列杂交的能力。另一种解决办法是在所述官能化电极组与所述非官能化电极组之间绷紧所述探针分子，同时通过这些末端将该分子固定在电极上。使用探针寡核苷酸，在5′和3′两个末端被官能化。在5′端选择的官能化不同于在3′端选择的官能化。两类官能化具有不同的激活和/或催化作用。例如在5′端选择具有化学或光激活作用的官能Hs、NH2，在3′端选择具有电催化的吡咯官能。在官能化电极组与非官能化电极组之间的距离如此选择，以致这些分子被绷紧，不能改变特定的弯曲或进行分子内杂交。一种替代办法是使所述探针的5′末端官能化，使其接在官能化的电极上，还在于在3′(3′附着位点)端添加一个短序列(10-20个碱基对)。选择特异性的附着3′位点的序列，以便它不与这些靶杂交。将在附着3′位点的互补序列接在对面的非官能化电极上。借助化学键通过其5′末端将这些探针与所述官能化电极组联接起来，借助在附着位点与接在电极上的互补序列之间形成的10-20对碱基复合体，通过3′末端将这些探针与所述非官能化电极联接起来。这些探针于是在这两个电极之间被绷紧，这样降低了分子内杂交和弯曲。
带有这些植入的探针的电极芯片，通过靶简单扩散到每个点中可以被动地杂交，例如对这些实际生物-芯片进行的杂交。然而，优选的是按照上述方法的活性杂交。为此目的，一个毛细管网和两个与前面章节所描述的类似容器，放置在官能化与非官能化电极组之间。把两个容器电极以及两个连接电极接到官能化电极组(参见示意图)中。一旦该芯片被杂交，根据每个点的阻抗变化就能够测定固定靶的量。官能化电极与非官能电极的投射(在上平面中)之间的交点是唯一的，相应于唯一一个点。对由非官能化电极和官能化电极构成的任何可能电极对相继地施加电位差和电流时，可测量点与点的阻抗。
两组叠置电极之间垂直设置，在理论上能够进行这种测量。然而，使用交流电或不连续电流与一个电极连接多个点这个事实，会带来干扰电容问题，这些问题会干扰这种测量。事实上，这使得正确地测量电流和电压变得很困难，甚至变得不可能，从而也难以确定每个点的阻抗。为了解决这个问题，需要加进能够确定点与点的电压和电流的断路器。为了制作与生物芯片尺寸相容的断路器，在同一平面中用电极格子代替所述官能化电极组(或所述非官能化电极组)，该格子由绝缘的第一组电极(水平的)，和与第一组电极垂直的第二组电极(垂直的)组成。格子的网孔限定了空间范围，或按照格子尺寸安排侧边10-500μm的小电极(点电极)。在每个格子网孔中放置一个或两个场效应晶体管，以致该晶体管的栅极与该格子网孔侧边的水平电极连接，晶体管的输入端子(电源)与该格子网孔侧边的垂直电极连接，而晶体管的输出端子(漏极)与点电极连接。
简言之，我们得到一个格子，其由水平和垂直电极确定的网孔被小的点电极占据。使用一个或两个场效应晶体管将这些点电极与格子网孔四个侧边中的两个侧边连接起来(图17、18)。将这些分子探针接到每个点电极中。这些非官能化电极组放置在每个“点电极”列对面，并且平行于官能化格子的垂直电极。这个非官能化电极组的每个电极是与其本体连接的。这个非官能化电极组可以用与其本体连接的单个板代替。
在用不连续电流测量阻抗的情况下(这种电流总是沿着同一方向流动)，使用“点电极”的单个晶体管对于发挥断路器的作用是必不可少的。把这些水平电极置于电压下时，所有这些晶体管的栅极都供电，这样切断了所有这些晶体管输入与输出之间的电流，这些点电极因此被隔开了。切断唯一一个水平电极中的电流时，在对单个垂直电极施加电流与不连续电场时，只是在两个电极交点处的晶体管让电流在其输入与输出之间通过。让单个点处于电压下时，可以使用其它的点测量在点电极中的阻抗变化而没有干扰。
在采用交变电流测量阻抗的情况下(电流沿着两个方向流动)，不管电流的方向，都应该给点电极供电。因此需要在该格子网孔放置两个场效应晶体管，它们具有相反的特征，即晶体管栅极的电压是零或负的时，让所述电流对于第一晶体管沿着一个方向，对于第二晶体管沿着另一个方向在输入与输出之间通过。不管电流通过的方向怎样，都给点电极供电。有利的是添加能让电流沿着两个方向在输入与输出之间通过的晶体管，例如“nmos”或“pmos”类型的晶体管，但这些晶体管有附加端子，因此需要通过格子网孔进行这种水平电极的连接，这样制约了小型化。
可能的是进行荧光和阻抗的混合检测或只是荧光的检测(这时只使用这些电极按照前面活性杂交(ha)的说明进行杂交)。为了不妨碍这些探针或靶发射的荧光，所有的电路和电极都可以用例如ITO的透明合金制成。在用荧光检测这些核酸的情况下，用发色团标记靶的一种替代变化包括使用这些核酸的荧光插入物。吖啶是良好的候选者，特别是吖啶橙，它与单链DNA分子或DNA/DNA复体结合时具有发出不同荧光的特性。此外，吖啶橙带正电，这样能够使它在电场中移动。通过用吖啶标记并测量发射的荧光可以测定在每个点的探针密度，同时施加不同的电场能够除去未与DNA探针结合的吖啶分子。施加电场的顺序与ha章所描述的类似，但可以将电场的方向适合于希望被移动的分子电荷。一旦把这些靶加到所述芯片上，相对于DNA/DNA复合物生成的荧光测量，通过将它与探针荧光比较能够测定每类靶的浓度。这种方法能够实现动态测量杂交，还能够测量这些靶与这些探针之间的离解常数(kd)和结合常数(ka)。可以将靶的kd和ka测量结果与天然序列所得到的测量结果进行比较，这样就有可能证明多形性。更一般而言，进行混合测量时，例如使用一种插入物和靶荧光标记与发色团，或测量阻抗和插入物等等时，有可能证明这种探针与这种靶不配对。
特别地，在本发明设备中使用的检测器是一种质谱仪。该质谱仪能够同时为使用者检测靶分子数和这些分子的性质(分子量和在某些条件下它们的化学式)。所述设备例如可以包括与质谱仪的离子化电喷(ElectroSpray Ionisation，ESI)连接的下横向管道(Kebarle等人，《分析化学》，1993，65(22)，第972-986页)。优选地，该下横向管道通过压电或热小管与检测器连接，该小管允许有规律的注入电喷(ElectroSpray)中。ESI的所有这些改进都是可调节的，例如微喷雾(microESI)、毫微喷雾(nanoESI)、微微喷雾(pico ESI)(Smith等，T.Matsuo等人编辑，1995年，John Wiley and son；Baffinslane、Chischester、West Sussex，UK，第41-74页；Emmett等人，《J.AM Soc.MassSpectrom》，1994年，5，第605-613页；Valaskovic等人，《分析化学》，1995年，67(20)，第3802-3805页)。其它类型的检测器，例如在直角加速的飞行时间里四极子分析仪(aoTOF或QTOF)(Chernushevich等人，第43届MS和Allied Topics的ASMS会议会议录，1995年，亚特兰大，乔治亚州；Sanzone，G，《Rev.SCi.Instrum》，1970年，41(5)，第741页)，是可用于本发明设备中的。
这些分子离子的质量和电荷数据与分子离子数能够推导出特异性地保留在一定微型柱中的每类分子靶性质与数量。特别地通过靶的特异性标记和在采用MS/MS方法获得谱的期间分子分解，可以推导出在每个微型柱中特异性地与探针连接的分子的化学式(Chernushevich等人，第43届MS和Allied Topics的ASMS会议会议录，1995年，亚特兰大，乔治亚州)。在一个特定的实施方式中，还可能考虑同时安装两套能进行荧光分析和电喷的石英毛细管，采用质谱法实现双荧光检测。同样地，可以协同安装多个不同类型的检测器或分析仪。
根据本发明设备的一个特别实施方式，可能的是平行分析不同试样的不同转录组。
在该设备的一个特别实施方式中，该设备包括包括转录组的代表，集合的核酸为特征的核酸[固定在这些室中或微粒上]。
关于“转录组的代表”，应该理解包括固定在该室中的核酸，其具有相同或互补的序列，或在严格条件下特异性地与信使RNA杂交，该信使RNA是一定细胞或全体细胞的基因组核酸序列转录产物，并且对于所述的细胞或前提细胞，其比例是与在特定条件下所得到转录产物的比例相当的。
下面的实施例中描述了转录组的代表性核酸的制备方法。
优选地，转录组的代表集合核酸被固定在微粒上，而采用适当的方法将所述的微粒固定在微型柱中。采用具体地在下面实施例3描述的方法，所述设备能够平行地分析不同的转录组。
本发明特别地涉及含有固定了转录组的代表、集合核酸的这样这些微粒。
本发明还涉及按照实施例3中确定的标准选择的一组核酸分子。在每个微型柱中含有转录组的集合代表性核酸的微型柱芯片，特别地可以使用这组核酸分子。
在另一个实施方式中，本发明设备的特征在于这些分子探针是肽或多肽，优选地连接所述抗原的抗体或片段。
本发明自然地涉及所述设备在生物试样，特别是细胞提取物的特异RNA和/或DNA分子的检测和/或定量分析中的用途，应选择与生物试样中的RNA或DNA进行特异性地杂交的那些分子探针。例如根据在实施例4中描述的方法，使用尤其能够对比分析至少两种生物试样中的特异RNA和/或DNA分子的这样一种设备。
根据基因选择适当方式的多种探针，例如根据外显子选择特异探针时，探针量化能够提供基因拼接形式的特异信号。
本发明还涉及溶于复杂混合物中的分子靶的分离和分析方法，所述的方法包括a.把含有待分离分子靶的复杂混合物加到例如上述本发明的设备中，b.在能将靶特异性连接在微型柱的探针上的适当条件下，让该复杂混合物循环通过该设备微型柱的阵列，c.洗脱特异性保留在微型柱探针上的靶，d.将从微型柱洗脱的靶循环到检测器，e.使用检测器回收和/或分析每种靶。
在一个特定的实施方式中，本发明涉及比较分析在两种生物试样中含有的至少两种特异DNA或RNA分子群体的方法，所述的方法包括a.标记来自第一试样的DNA或RNA分子，例如用重同位素标记，以便将在第一试样中含有的标记DNA或RNA分子的质量与在第二试样中含有的具有同样结构、但没有标记的DNA或RNA分子的质量区分开；b.将两种待比较DNA或RNA群体等摩尔混合；
c.把该等摩尔混合物加到本发明的适当设备中，该设备包括由质谱仪构成的检测器；d.在能将靶特异连接在微型柱探针上的适当条件下，让该等摩尔混合物循环通过该设备微型柱的阵列；e.洗脱特异性保留在微型柱探针上的靶，f.将从微型柱洗脱的靶循环到检测器，g.使用质谱仪检测和/或定量分析每种靶。
在这个方法的一种特定实施方式中，选择使用的设备特别地由如前面描述的行电极对构成，因此能够控制在微型柱的每行中洗脱和/或洗脱靶的迁移。在这种情况下，该方法的优选实施方式包括下述步骤a.把含有待分离DNA和/或RNA分子的复杂混合物加到本发明的适当微型柱设备中，b.在能将靶特异性连接在微型柱探针上的适当条件下，优选地在封闭的回路中，让所述复杂混合物循环通过该设备微型柱的阵列；c.如果必要，在开放回路中，让洗液循环通过该微型柱阵列，这样能够除去未杂交或未特异性杂交的分子，d.在微型柱行电极对之间施加电位差，室电极为正的，而远侧的电极为负的，在横向管道电极对之间施加电位差，下横向管道为负的，而上横向管道为正的，使得在步骤e变性后DNA或RNA分子保留在每个微型柱，e.在能使探针/靶复合物变性的条件下，让变性溶液循环通过微型柱阵列的一个或多个行，因此洗脱DNA或RNA分子，f.将施加在该阵列微型柱行的行电极对上的电位差颠倒或取消，g.将所述阵列行的微型柱中的变性靶循环到检测器，h.使用检测器回收和/或分析每种靶。
通过采用电场，上述方法的优选替代办法能够实现仅仅分子靶的变性和迁移步骤。这样一种方法的特征在于它包括a.把含有待分离DNA和/或RNA分子的复杂混合物加到本发明的适当微型柱设备中，
b.在能将靶特异性连接在微型柱探针上的适当条件下，优选地在封闭的回路中，如果必要，如上述在横向管道电极与相继的行电极之间的交变电场作用下，让复杂混合物循环通过所述设备的微型柱阵列，c.如果必要，在开放的回路中，让能除去未杂交或未特异性地杂交分子的洗涤溶液循环通过所述微型柱阵列，d.下横向管道与第一容器连接，该容器装有变性溶液，其含有的负离子能在电场中迁移，上横向管道与第二容器连接，该容器装有变性溶液，其含有同样的负离子，e.在下和上横向管道与远侧的行电极上施加负电位，而在室行电极上施加正电位，结果所述溶液中的负离子迁移到带正电荷的微型柱中，并使分子靶变性，这些如此变性的分子靶因远侧行电极的负电位而被固定在这些微型柱中。
f.在横向管道电极对之间施加电位差，在上横向管道为负的，而在第二下横向管道为正的，g.将施加在所述阵列微型柱行的行电极对上的电位差颠倒或取消，以便通过电泳能够将该阵列行的微型柱中的变性靶迁移到检测器，h.使用所述检测器回收和/或分析每种靶。
本发明还涉及一种方法，其中包括a.本发明设备的构造，其中每个微型柱装有转录组代表的成比例的RNA或DNA靶，b.加入固定在该阵列每个微型柱中的RNA或DNA靶的特异互补探针化学计算量混合物，一种靶的每种特异探针的分子量与其它探针是不相同的，因此在质谱仪中彼此是可鉴定的，c.在能将探针特异性连接在这些靶上的适当条件下，而靶固定在这些微型柱上，让探针混合物循环通过该设备微型柱的阵列中，d.洗脱微型柱上固定的特异保留的探针，e.让从微型柱洗脱的探针迁移到由质谱仪构成的检测器，f.使用质谱仪分析每种探针。
替代上述方法时，能够使用由特异探针组成的探针组，一个靶的每个特异探针大小与其它探针是不相同的，和/或每个特异探针用特异荧光标记物进行标记，在探针的毛细管电泳后采用合适的分光光度法进行这种检测。
本发明还涉及复杂混合物中分子靶的分离和定量分析方法，所述方法包括a.把含有待分离分子靶的复杂混合物加到本发明的设备中，该设备一方面包括一个能循环复杂混合物的毛细管网，另一方面包括根据上面描述的两个电极组，b.在所述设备的电极之间施加电位，以便所述靶能够从毛细管网末端迁移到其它毛细管网末端，并且探针能够杂交这些与其互补的靶，c.原位分析或回收，接着使用检测器分析探针中的每个杂交靶。
本发明的实施例和图都说明了这种方法的实施。
本发明还涉及分析转录组的方法，该方法包括使用a.磁微粒组，在微粒上固定了待分析转录组的代表性靶的集合，以及b.探针的不同类型组，其中化学计算量混合物的所述探针组中每种探针型与靶型是特异性的和互补的。
本发明涉及一种如此定义的方法，其特征在于化学计算量混合物中所述探针组中的每种探针型对于靶型是特异性的和互补的。
本发明还涉及如上所述的方法，其特征在于通过其分子量毫无歧义地可鉴定在所述混合物中存在的每种探针型，将下述三个标准结合可达到其鉴定经验式、尺寸和用重原子的任选标记。
本发明还涉及一种如上所述的方法，其特征在于通过其尺寸与荧光标记物毫无歧义地确定在该混合物中存在的每种探针型。
如此描述的转录组分析方法可以转用于分析蛋白质组或分析患者的一种或多种基因的缺失或增加。在这些其它分析中，这些探针还可确定所研究靶的代表的存在，并且与其它探针型相比，可毫无歧义地鉴定在该探针组中的每种探针型。
下面的实施例能够说明本发明设备的某些优选实施方式，更易于理解它们的用途，然而这些实施例还不限制本发明的保护范围。
图1A是在合适的材料中模塑微型柱的N个行和P个列的阵列(1)俯视图。
图1B表示通过中间行电极(21)和远侧行电极(22)连接的微型柱一行。
图2表示所述设备的示意图，它包括微型柱阵列(2)、上毛细管网(3)，它与有活塞(6)的上横向管道(31)连接，下毛细管网(4)，它与下横向管道(41)和与检测器(5)连接。该设备还包括副横向管道(7)，便于在杂交和/或洗涤步骤时循环这些流。
图3是下横向管道(41)的连接详图，它包括下管道电极(42)、压电(pietzo-électrique)管(43)、ElectroSpray器(44)和检测器。
图4表示使用有活塞的设备，在带负电荷分子靶变性步骤时电极的极性。金属活塞(6)盖的电极带负电荷。把变性溶液加在上横向管道(31)的自由端，这些箭头表示该流的循环方向。这些电极在微型柱水平是正的(+)，而在微型柱出口是负的(-)。
图5表示在第一行分子靶迁移步骤时电极的极性。消除了在第一行电极中的电位差。下横向管道(41)装满凝胶。该设备还包括副横向管道(7)。
图6说明在使用装有在电场中能迁移的离液剂的变性缓冲液容器(8)的设备内，带电荷分子靶的变性步骤。
图7说明了官能化与植入探针的电极组实例。
在薄玻璃板上镂蚀用金或用ITO制成的电极。
按照在这些电极上或在这些电极之间的情况进行探针沉积(点或杂交单元)。在这种方法中，将描述在这些电极上唯一应用沉积物。
图8说明行电极对的装配。
将两个相对的镂蚀电极薄板排列起来可得到这些行电极对。其中一个薄板已官能化，另一个薄板没有官能化。
图9说明插在两组官能化和非官能化电极之间的毛细管网。
图10说明官能化电极，它用连接弯曲电极和容器电极完成。
图11说明在毛细管网周围装配两组官能化和非官能化电极。
图12说明施加到电极的电荷顺序，以便使一个电极的这些靶相继迁移到另一个电极的这些靶，因此由一个点迁移到另一个点。
图13说明有由这些官能化电极构成的底板的半敞开室。
它们向该毛细管网的这些毛细管敞开。这些室避免了因扩散而使靶分散。
图14说明只有一个毛细管网的设备的方案。
除去第二容器，有利于横向管道和延迟系统。
第二连接电极(V)是直线的。它用于规定带电荷靶不可越过静电的范围。电极(V)相对于横向管道(W)是凸起的时，这种延迟效果被增强。第二连接电极能够选择性地将这些探针移动到该横向管道中。
图15说明了一种原位SPR检测的设备。
把三棱镜与未官能化的电极连接起来。
图16说明了采用SPR检测未官能化电极的原理。
1)通过电场把去杂交靶保持在适当位置。
2)这些靶借助电场迁移到未官能化的电极。
3)进行SPR检测。
4)为改进检测可以交替切断电流。
图17说明了一种两组交叉叠置电极的设备，以实现测量阻抗。
图18说明了一种代替该官能化电极组的格子，以测量间断电流的阻抗。
图19说明了一种代替该官能化电极组的格子，以测量交流电流的阻抗。
实施例1.检测在生物试样中含有的DNA或RNA分子的设备实施例。
1.A微型柱阵列微型柱阵列(1)是由直径50μm、长度100μm的微型柱的N个行和P个列构成的，沿着玻璃、硅或塑料类材料的厚度凿出或模塑这些微型柱(图1A)。这些室垂直于该芯片的主平面。每个室装满聚丙烯酰胺凝胶，所述特异性分子探针固定在微粒上，其微粒直径大于凝胶网格。用一个公用电极将该微型柱阵列每行的这些室连接起来，形成一个室的行电极(21)。这个电极是由处在室中间的金薄层构成的，因此将每个室分成两个半室。第二组电极，中间行电极的镜面，放置在该微型柱阵列的室出口处，设置远侧的行电极(22)。每个远侧的行电极平行于中间的行电极，形成行电极对(图1B)。这些电极对在室的每个行高度施加期望的电位。这些远侧电极是以与中间电极同样方式制成的。
1.B层叠置的毛细管网通过两个管道将每个室与分别位于室平面上与下的层叠置毛细管网连接起来(参见图2)上毛细管网由N个平行的毛细管(上毛细管)(3)构成，下毛细管网由P个平行的毛细管(下毛细管)(4)构成，当然N/P排列可以在两层毛细管之间颠倒。上毛细管网的相同毛细管与所述微型柱阵列的行的P个室连接，而下毛细管网的相同毛细管则分别与该微型柱阵列的列的N个室连接。这些连接都是用上述连接管道实现的，例如上和下两个毛细管网的方向应该是垂直的。因此，通过该微型柱阵列的P个室的行，将上毛细管网的每个毛细管与下毛细管网的所有毛细管连接起来。相互地，通过该微型柱阵列的N个室的列，将下毛细管网的每个毛细管与上毛细管网的所有毛细管连接起来。
这些毛细管的直径是1-100μm。上毛细管网的所有毛细管通到直径2-1000μm的横向毛细管(31)(上横向管道)中。该上横向管道因此连接了上毛细管网的所有毛细管，它垂直于上毛细管网的方向。与横向管道相反的上毛细管网的毛细管末端，在与该微型柱阵列室的行的第P个和最后室最后连接时中断。下毛细管网的所有毛细管通到直径为2-1000μm的横向毛细管(41)(下横向管道)中。该下横向管道因此连接了下毛细管网的所有毛细管。所述下毛细管网的毛细管如此设置，以致在室列的第一室的连接处与下横向管道之间的行程是不同毛细管的不同长度。下毛细管网的这部分毛细管称之延迟。这种延迟让下横向管道与下毛细管网不构成90°角度。根据选择的角度，这些延迟在这些连续的下毛细管之间是增加或减少的。
将与横向管道相反的下毛细管网的毛细管末端与第二横向毛细管(7)(第二下横向管道)连接，因此能够在两个上与下毛细管网之间建立通过所述室阵列的流。主下横向管道填满毛细管电泳的液体凝胶，以便在这个水平进行毛细管电泳，这时可能的是在上横向管道与第二下横向管道之间建立一种闭合环状流(图2)。
在上和下横向管道中安置一些电极。
上横向管道装有螺纹或无螺纹的活塞(6)，它可能允许选择所述流通过室的行数。向外推移时，该活塞移动的越多，微型柱阵列室的行越多。
1.C检测器使用质谱仪(5)检测在下横向管道出口的分子。
下横向管道是与质谱仪(图3)的电离电喷(ESI)(44)邻接的。它通过压电小管(43)或热小管与检测器连接，该管允许有规律注入电喷中。
2.无活塞设备的实施例2该实施例说明本发明设备的另一个实施方式，该方式适合于分离和分析在生物试样中含有的核酸分子，还能使保留在这些微型柱上的分子靶变性，并且只是通过施加电场使它们迁移到检测器中。
所述微型柱阵列和毛细管网与实施例1基本相同，只是有如下差别该设备在上横向管道中没有活塞。另一方面，该下横向管道和上横向管道与装有氢氧化铵(NH4OH)盐的变性缓冲液容器连接起来。
3.实施例3，制备装有转录组代表性核酸集合的微型柱及其分析转录组的用途。
本发明设备的每个微型柱，例如像实施例1或2所描述的微型柱，包括其上固定了待分析转录组的代表性核酸集合的支持物或微粒(DNA、RNA或寡核苷酸等等)。
为了避免大尺寸polyA(多聚腺嘌呤)尾的存在，使用引物，例如5′(T)19X3′，其中X可以是A、C或G，进行待分析信使RNA试样的逆转录。因此使用在polyA尾后遇到的与A不同的第一核苷酸开始进行这种逆转录。
为了得到固定在支持物或微粒上的基因组的代表性cDNA试样，将上述的这些引物预先固定在所述的支持物或所述的微粒上，再进行这种逆转录。在这种支持物上逆转录后可以联接逆转录产物。使用在5′端生物素化的引物5′(T)19X3′时(还可能利用这些微粒与靶之间的化学络合作用)，通过生物素-抗生物素蛋白偶联可以保证这种联接。
本发明涉及一种分离和/或检测溶于复杂混合物中的多个分子靶的设备，所述的设备包括在其上固定待分析转录组的代表性靶集合的磁微粒组和探针组。
化学计算量混合物的探针组中的每种探针型对于靶型是特效的和互补的。
把含有基因组的代表性cDNA集合的这些微粒或支持物再放到本发明设备的微型柱。于是得到微型柱芯片，按照下述方法，它的每个微型柱都能够分析一个转录组采用该设备要使用探针组，其中组成该混合物的每类探针对于固定在这些微型柱上的这些类靶中的一类靶和唯一一类靶是特效的和互补的，从而这些探针形成化学计算量混合物。
因此，所述混合物中存在的每种探针型可毫无歧义地用其分子量鉴别。将三个准则结合起来可获得这种分子量的特异性经验式、尺寸和用重原子标记可能性。这三个准则结合起来能够产生极大量的探针。对于等于M的DNA的聚合物尺寸，例如M＝n+m+l+j，有可能得到大量的经验式(AnCmTiGj)，它等于(n+m+l+j)/(n！*m！*l！*j！)。
特别对于保留在所述支持物或微粒上的靶分子，这些互补探针都被杂交；涉及分离步骤。一旦该系统已漂洗和这些未杂交探针被除去，可控地使在支持物或微粒上的这些杂交探针分子变性。这时可能对在含有这些固定靶的支持物或微粒上的每类杂交探针分子进行定量分析。
为了减少非特异杂交，在小核苷酸聚合物(X)n的存在下使这些序列杂交，式中X代表A、T、G或C，N为3-7个核苷酸，生成n个核苷酸的所有可能序列。
这种方法也可以应用于蛋白质组研究领域中的蛋白质。将待研究蛋白质混合物固定在支持物或微粒上。这些靶是由抗体或任何其它特异配体组成的，每种探针型的分子量允许毫无歧义地进行鉴定。
为了消除具有相同分子量的不同探针型间的不确定性，这些探针可以与改变该探针分子量的惰性分子联接。为了再提高这种检测的鉴别能力，在注到质谱仪之前进行毛细管色谱分离。这种毛细管色谱法能够按照其大小分离这些探针。可用压电小管将质谱仪与毛细管电泳联接起来。
前面实施方式的另一种选择是使用荧光标记物区分这些探针。毫无歧义地采用其大小和荧光标记物定义每类探针。例如将五种不同的荧光标记物与其大小分为20-200碱基的探针结合时，这两个标准结合能够达到复杂度约千位。当然，通过增加这些探针的许可大小范围和使用荧光标记物的数量，有可能扩大探针混合物的复杂性。
使用一组其上固定待分析转录组的代表性靶集合的磁微粒和一组如上所述的化学计算量探针时，可以直接在溶液中使用而不采用这种方法。这些磁微粒用于分离这些杂交探针。事实上，采用由单纯磁铁产生的磁场分离这些杂交微粒。一旦这种系统被漂洗和这些未杂交探针被除去，就可控地使这些杂交探针去杂交，采用上述方法中的一种方法分析洗脱物就能够确定分析转录组的组成。
这种方法代替了经典的DNA芯片，尤其在研究转录组和CGH(比较基因组杂交)时更如此。
4.实施例4使用如实施例1描述的微型柱芯片分析RNA试样。
实施例1中描述的设备能够分析核酸分子混合物。可以使用细胞RNA单一提取物，但也可以使用两种不同的提取物进行这种分析。
为了采用质谱法检测分析两种不同的RNA提取物，合适的是将两种群体中的至少一个mRNA群体标记。采用加入重同位素的逆转录进行这种标记。这些重同位素选自O18、O17、N15、C13、H2或任何其它可以采用普通形式质量区分的重同位素。将这些重同位素加到参与合成核酸的核苷酸中。第二种待分析mRNA群体反转录成cDNA而没有加入重原子，或加入与第一群体不同的重原子。
为了避免与可能分解产物的任何混杂，可用重原子标记这些引物5′(T)19X3′，其中X可以取值A、G或C，而这些重原子不同于在采用质谱仪检测的情况下该分子余下部分任选使用的重原子。采用荧光检测时，使用发色团标记这些引物。
在过早的时间内突然停止这种逆转录，因此所有的cDNA的延长时间是相同的，以缩小尺寸比例的更易鉴定的分子量得到cDNA分子。这种方法还可以用于制备通常DNA芯片使用的cDNA靶。
一旦得到两种cDNA群体，将它们等摩尔混合起来(还可能的是处理mRNA/cDNA不均匀混合物)。将这种混合物加到在每个微型柱中多次循环的闭合回路中(参见图2)。在它们通过这些微型柱期间，这些靶与互补探针进行杂交。在闭合回路内循环在每次通过微型柱后能够使这种混合物均化。在进入管内的阻抗例如能够调节杂交溶液的温度，而且在杂交循环过程中还能够发生这些热变化，这样可以控制杂交特异性。任选地，一种超声室由于将这些靶cDNA破碎成更小尺寸的分子而能够使待杂交分子尺寸均匀，由寡核苷酸(20-100pb)构成的探针事实上有利于等效尺寸靶的杂化。
一旦实现杂化，该回路是开放的，并且大量用除去非杂交或非特异杂交分子的溶液漂洗(洗涤步骤)。
该系统这时与质谱仪的电喷器联接起来，在该阵列微型柱的行电极对之间建立起电位差，在中间处为正电位，而在远侧为负电位。同样地，在横向管道的电极处建立起电位差，在上横向管道为负电位，而在下横向管道为正电位。由于电极的极性，这些杂交分子保持在每个杂交室中。设置所述活塞使得只能通过该阵列微型柱的第一行的微型柱在上和下两个网之间进行这种循环(图4)。由阻抗控制温度的变性溶液(例如位于上横向管道)这时以层流方式注入，并扩散通过最靠近下横向管道的第一行的微型柱，该活塞阻止进入微型柱的其它行。所述变性剂使这些探针-靶配合物变性，所述电场阻止靶扩散到室之外。
在抉择时也可考虑这种热变性。在提高每个微型柱中缓冲液温度时，产生了在固定探针与该靶之间形成的复合体变性，靶重新进入溶液，而探针依然固定在该阵列上。
第一行电极对之间的电场然后反转或简单截断，保持横向管道电极对之间的电位差(图5)。第一行每个微型柱的靶这时通过下毛细管网的相应毛细管，通过电泳使这些探针输送或迁移通过这些毛细管，直到下横向管道。不同微型柱的靶随着下毛细管网的毛细管各自延迟而以不同的时间到达下横向管道。事实上，对于分析而言，这些不同的靶以不同的时间到达与下横向管道联接的检测器(ElectroSpray)毛细管。为了不使来自不同微型柱的靶之间混合，一般而言需要以非常缓慢的层流方式进行。使用微型柱的多种探针能够确定基因片段的任何形式。
5.实施例5使用如实施例2所描述的微型柱芯片分析RNA试样。
在下面的方法中，为了使靶变性和让它们迁移到质谱仪中，不需要让任何流体在毛细管中循环。
在这个方法中，将使用实施例2描述的设备。采用的杂交和漂洗步骤与实施例4中描述的相同。在杂交和漂洗后，让上横向管道与装有能迁移到缓冲液电场中的离液剂(chaotrope)的缓冲液容器相连，下横向管道与装有同样缓冲液的第二容器连接。上和下横向管道的电极以及远侧的行电极保持在负电位，而相对的中间的行电极保持在正电位。离子和离液剂迁移、阳极和阴极、缓冲剂的pH以及电位差都会引起探针-靶生物聚合物的复合物的变性(图6)。
这些探针由于与该阵列强键合而依然固定在其阵列上，带负电荷的自由靶也依然在带正电荷的中间行电极中。一旦探针/靶复合物变性，横向管道电极之间设置电位差，对于上横向管道的电位为负的，而对于下横向管道的电位为正的，中间电极的电位保持在正的，而远侧的保持在负的，因此这些靶被限制在每个微型柱的静电室中，于是停止了任何迁移。
这时，相继逐行地使该微型柱阵列行电极之间的电位差置零，因此电泳会引起在下毛细管网的毛细管中的每个行的靶相继迁移。这些靶按照其毛细管各自途径的距离迁移直到下横向管道。在下横向管道出口，进行这种分析。
6.实施例6在每个微型柱中分离与离析的生物聚合物的微序列化本发明的方法允许在所述质谱仪中分离和分析核酸或蛋白质靶的序列化。
所述微序列化是在核酸序列中进行随机分裂，然后采用质谱仪鉴定这些得到的产物。这些随机分裂可以是化学的、物理的、机械的或酶的。例如，通过由微型柱中固定酶组成的酶混合物的作用可以得到这些酶切物，这个微型柱例如放置在检测毛细管与下横向管道之间。这些生物聚合物穿过这个微型柱时，它们部分被降解。能够由分析降解产物推导出这种序列。这些酶例如是核酸的核酸内切酶或蛋白质的肽链内切酶，例如它们能够在这些生物聚合物中得到随机酶切物。使用核酸的核酸外切酶或蛋白质的肽链外切酶有可能部分消化。分析这些反应产物能够得到特异性地保留在每个微型柱中的生物聚合物序列。使用酸、碱或任何其它化学产品时，谨慎化学降解生物聚合物可产生的化学分裂。
例如使用能使这些生物聚合物分裂的超声波、微波或或微-频率达到这些机械降解。最后，通过电子流或通过与生物聚合物相互作用的重原子轰击可以达到物理分解。所有这些处理能够按照可以预言的组合，通过例如核酸的磷酸酯键和蛋白质的肽键断裂使这种生物聚合物打碎。进行这些处理只是在统计上诱发每个分子随机分裂。为了测定生物聚合物序列，必需在它们的至少一个末端有标记物。对所得到的含有这种标记物的分解物的所有离子的研究能够确定这种序列。在生物聚合物中末端标记物以天然状态存在，或者它是采用人工方法加入的。例如，mRNA的3′末端系统地含有polyA尾。这个polyA尾可以作为末端标记物使用例如5′(T)19X3′之类的引物通过逆转录得到其cDNA，其中X可以是A、C或G。于是使用在polyA尾后遇到的与A不同的第一核苷酸开始这种逆转录。为了避免有任选分解产物的任何散乱性，使用与所述分子其余部分任选使用的重原子不同的重原子标记这些5′(T)19X3′引物。由于知道标记物的严格质量，所以应很容易推导出分裂产物，在该序列中残留物顺序。在蛋白质的情况下，使用化合物，例如苯基异硫氰酸酯、1-氟-2，4-二硝基苯或densyle氯，标记N端的末端能够测定序列。还可能在每个末端对生物聚合物进行双标记，以增加该方法的分辨能力。在配合物的情况下，这些MSMS方法能够在第二步选择待分析分子离子，例如像在多嵌合体蛋白质的情况下。最后，有可能直接通过分析连续分解的产物，例如允许这种分析采用MSMS方法，测定生物聚合物的序列，例如对于蛋白质，借助N端和C端的末端测定这些序列末端的标记物。
7.分析多肽混合物时使用微型柱芯片以类似于实施例1或2所描述的方式生产这些设备。所述阵列每个微型柱装有多肽类的特异性抗体。这些抗体对自然或变性蛋白质是特异性的。这些抗体直接固定在室壁上或保留在每个室中的微粒上。例如对于核酸，应可能使用与吡咯分子结合的抗体。就核酸所描述的与吡咯结合的这些探针全部应用方法都可应用于与吡咯结合的抗体。使用微型柱网制出一个封闭回路时，使细胞的多肽提取物络合。这样在每个微型柱中能生成抗原/抗体特异性复合物。为了洗脱保留在每个微型柱中的多肽，需要使用只是根据蛋白质大小能使它们迁移的缓冲液。这些缓冲液还能够破坏这种抗原/抗体复合物。为此，列举SDS(十二烷基硫酸钠)碱缓冲液，它们能够使所有的蛋白质向正极迁移，而不管其等电点。
附图标记说明说明书附图中标记的定义如下A＝弯曲的连接电极(例如有用ITO制成的透明电极的玻璃薄板)B＝官能化行电极(例如有用ITO制成的透明电极的玻璃薄板)C＝容器电极(例如有用ITO制成的透明电极的玻璃薄板)D＝既没有底层也没有顶层的毛细管(例如在kapton中凿孔)中间平面E＝没有顶层而有底层的毛细管(例如在kapton中凿孔)中间平面F＝既没有底层也没有顶层的容器(例如在kapton中凿孔)中间平面G＝非官能化行电极(例如有用ITO制成的透明电极的玻璃薄板)H＝非杂交靶I＝官能化电极J＝非官能化电极K＝探针点杂交单位L＝三棱镜M＝栅极的水平电极N＝电源的垂直电极O＝点电极P＝栅极Q＝电源R＝漏极T＝既没有底也没有底层的室S＝电流循环方向U＝有延迟的毛细管网V＝用于分析的行电极W＝副横向管道
权利要求
1.分离和/或分析溶于复杂混合物中的不同分子靶的设备，所述的设备包括a.微型柱阵列，其包括放置在同一平面上的N个行和P个列的微型柱，每个微型柱包括固定的分子探针型，通过探针/靶特异连接，以保留复杂混合物中存在的特异分子靶，b.平行于所述微型柱阵列平面、并位于所述微型柱阵列平面之上的平面内的第一毛细管网，所述的第一毛细管网可将接到该设备中的复杂混合物循环到a中定义的阵列的每个微型柱中，c.平行于微型柱阵列平面、并位于所述微型柱阵列之下的平面内的第二毛细管网，所述的第二毛细管网可将洗脱后的所述分子靶循环到一个或多个检测器中，以此对其回收和/或分析，d.如果必要，检测器，其回收和/或分析所述不同的分子靶，优选其为质谱仪。
2.根据权利要求1所述的设备，其特征在于它还包括一个或多个检测器，该检测器可回收和/或分析不同的分子靶。
3.根据权利要求1或2所述的设备，其中每个微型柱包括直径2-1000μm，优选为约20-100μm；长度2-2000μm，优选为40-200μm的管形室。
4.根据权利要求3所述的设备，其中所述微型柱阵列包括在形成阵列平面材料的厚度模塑或凿出的室。
5.根据权利要求1-4中任一权利要求所述的设备，其中在合适材料板的厚度内凿出每个毛细管网。
6.根据权利要求1-5中任一权利要求所述的设备，其特征在于所述阵列是由1至1百万个微型柱，优选为100-100000个微型柱构成的。
7.根据权利要求1-6中任一权利要求所述的设备，其中所述分子探针固定在微型柱的内壁上。
8.根据权利要求1-7中任一权利要求所述的设备，其中每个微型柱装有所述分子探针联接的微粒，所述微粒通过适当方法保留在每个室中。
9.根据权利要求8所述的设备，其中所述分子探针联接的微粒的直径大于每个微型柱进口与出口的毛细管直径。
10.根据权利要求1-9中任一权利要求所述的设备，其特征在于每个微型柱由装有凝胶的室构成，其中固定了所述分子探针以阻止所述的分子探针迁移到室外。
11.根据权利要求10所述的设备，其中所述分子探针与直径大于凝胶网结构的微粒联接以阻止它们迁移到室外。
12.根据权利要求10所述的设备，其特征在于它包括过滤器，置于每个室的进口和出口，其特征还在于所述微粒的直径大于所述过滤器孔的直径。
13.根据前述权利要求中任一权利要求所述的设备，其特征在于它包括在该阵列的一个或多个特异微型柱中能够控制分子靶洗脱和/或向检测器迁移和/或洗脱后将其保留在这些微型柱中的工具。
14.根据权利要求13所述的设备，其特征在于它包括第一电极，即室电极，该电极设置成与每个微型柱接触，优选地在所述微型柱的中间；以及第二电极，即远侧电极，该电极设置在每个微型柱出口，从而能够控制洗脱保留在一个或多个特定微型柱中的分子靶和/或将其迁移到检测器或在洗脱后将其保留在所述微型柱中。
15.根据权利要求13或14所述的设备，其特征在于第一毛细管网包括加入所述复杂混合物的第一横向毛细管，以下面称之为上横向管道，其直径优选为2-1000μm，与通到所述阵列微型柱的所有毛细管连接，其特征还在于第二毛细管网包括将每个微型柱与第二横向毛细管连接起来的所有毛细管，第二横向毛细管称之为下横向管道，它的直径优选为2-1000μm，所述的下横向管道与电极连接，且所述的上横向管道与电极连接。
16.根据权利要求15所述的设备，其特征在于包括能够控制洗脱保留在特定行微型柱上的分子靶和/或将其迁移到检测器和/或洗脱后将其保留在这些微型柱上的工具，其特征还在于选择第二毛细管网的每个毛细管长度，以便在所述微型柱出口与下横向管道之间的距离因第二毛细管网的毛细管的不同而不同，优选地从连接一行的第一微型柱的毛细管到连接该行最后微型柱的毛细管的距离是增加或减少的，因而分子靶从微型柱出口直到检测器的通过时间对于同样行的每个微型柱都是不同的。
17.根据权利要求16所述的设备，其特征在于将每个微型柱与下横向管道连接的毛细管网包括P个平行毛细管，每个毛细管将所述阵列同一列的N个微型柱与下横向管道连接起来，并与所述的下横向管道形成不是90°的角度。
18.根据权利要求16或17所述的设备，其特征在于对于每行，所述设备包括第一电极，其将同一行的所有P个微型柱连接起来，于是形成N个行电极，优选地在微型柱中的中间行电极，和第二组平行于行电极的电极，将在同一行微型柱出口的所有P个毛细管连接起来，从而能够控制微型柱每行的靶洗脱和/或迁移。
19.根据权利要求16或17或18所述的设备，其特征在于第一毛细管网，称之上毛细管网，包括N个平行的毛细管，每个毛细管将该上横向毛细管与所述阵列同一行的P个微型柱连接起来，其特征在于第二毛细管网，称之下毛细管网，包括P个平行的毛细管，每个毛细管将所述阵列同一列的N个微型柱与下横向毛细管连接起来，两个下和上毛细管网之间形成的角度不是0，优选地是垂直的。
20.根据权利要求19所述的设备，其特征在于与上毛细管网连接的横向管道连接有活塞，能将加入该上横向管道中的混合物循环到上毛细管网的一个或多个特定毛细管中。
21.根据前述权利要求中任一权利要求所述的设备，其特征在于包括由质谱仪构成的检测装置。
22.根据前述权利要求中任一权利要求所述的设备，其特征在于所述分子探针是核酸，优选为寡核苷酸或DNA片段。
23.根据权利要求22所述的设备，其中每个微型柱的所述分子探针是由一种基因的特异核酸型构成的。
24.根据权利要求22或23所述的设备，其特征在于每个微型柱包括转录组的代表性核酸的集合。
25.根据权利要求24所述的设备，其特征在于所述转录组的代表性核酸的集合固定在微粒上，同时所述的微粒通过适当的方法固定在这些微型柱中。
26.根据权利要求1-21中任一权利要求所述的设备，其特征在于这些探针是多肽，优选为抗体片段。
27.分离和/或检测溶于复杂混合物中的多种分子靶的设备，所述的设备包括a.毛细管网，使加入该设备的复杂混合物循环，b.两组电极，置于所述毛细管网两侧-官能化电极组，其中这些电极接入了由点组成的探针，使得每种探针通过探针/靶特异连接将所述复杂混合物中存在的特异分子靶保留，-非官能化的电极组。
28.根据权利要求27所述的设备，其特征在于所述官能化电极组位于毛细管网上面，其特征还在于所述非官能化电极组位于毛细管网下面。
29.根据权利要求27和28所述的设备，其特征在于还包括在每个毛细管网末端的容器。
30.根据权利要求29所述的设备，其特征在于所述容器包括圆形电极。
31.根据权利要求30所述的设备，其特征在于在每个容器中的所述圆形电极位于与所述官能化电极组相同的平面中。
32.根据权利要求27-31中任一权利要求所述的设备，其特征在于它还包括在第一容器电极与第一官能化电极之间的第一补充连接电极，以及在第二容器电极与最后官能化电极之间第二补充连接电极，使得在连接电极与容器电极之间的最短距离在任何的电极点都是相同的。
33.根据权利要求32所述的设备，其特征在于第一连接电极是弯曲的，其特征还在于第二连接电极不是弯曲的，因而杂交时，该电极用于确定这些探针不可越过的电边界，然后在检测步骤，能够借助由靶电极和连接电极所确定的电位将这些靶朝向所述延迟系统。
34.分离和/或检测溶于复杂混合物中的多种分子靶的设备，所述的设备包括a.磁微粒组，其上固定了待分析转录组的代表性靶集合，以及b.探针组。
35.根据前述权利要求所述的设备，其特征在于在使用所述的靶时，形成化学计算量混合物的所述探针组中每种探针型对于靶类型是特异性的、互补的。
36.根据前述权利要求所述的设备，其特征在于通过分子量可毫无歧义地鉴定所述混合物中存在的每种探针型，将下述三个标准结合可达到其鉴定经验式、尺寸和用重原子的任选标记。
37.根据前述权利要求所述的设备，其特征在于通过其尺寸和荧光标记物可毫无歧义地确定在混合物中存在的每种探针型。
38.根据前述权利要求中任一权利要求所述的设备在检测和/或定量分析在生物试样中，特别在细胞提取物中所含有特异RNA和/或DNA分子中的用途，其中选择分子探针以使它们与所述生物试样中的RNA或DNA型进行特异性杂交。
39.根据权利要求38所述的用途，其用于对比分析两种生物试样中的特异RNA和/或DNA分子。
40.在复杂混合物中分子靶的分离和定量分析方法，所述方法包括a.把含有待分离分子靶的复杂混合物加入到根据权利要求1-26中任一权利要求所述的设备中，b.在能将所述靶特异连接在微型柱探针上的适当条件下，让所述复杂混合物循环通过所述设备的微型柱阵列，c.洗脱特异保留在所述微型柱探针上的靶，d.将从微型柱洗脱的靶循环到检测器，e.使用所述检测器回收和/或分析所述每种靶。
41.两种生物试样中所含有的两种特异DNA或RNA分子群体的对比分析方法，所述的方法包括a.标记来自第一试样的DNA或RNA分子，例如用重同位素标记，从而区分在第一试样中含有的标记DNA或RNA分子的质量与在第二试样中含有的具有同样结构，但没有标记的DNA或RNA分子的质量；b.形成两种待对比DNA或RNA群体的等摩尔混合物；c.把该等摩尔混合物加入到根据权利要求14-18中任一权利要求所述的分离和/或检测溶于复杂混合物中的多个分子靶的设备中，该设备包括由质谱仪构成的检测器；d.在能将所述靶特异连接在微型柱探针上的适当条件下，让所述等摩尔混合物循环通过所述设备微型柱的阵列；e.洗脱特异保留在所述微型柱探针上的靶；f.将从微型柱洗脱的靶循环到所述质谱仪；g.如果必要，在下横向管道中采用毛细管色谱法分离洗脱靶；h.采用质谱仪检测和/或定量分析每种标记或未标记的靶。
42.根据权利要求40或41中任一权利要求所述的方法，其特征在于包括a.把含有待分离DNA和/或RNA分子的复杂混合物加入到根据权利要求18-20中任一权利要求所述的设备中，b.在能将所述靶特异连接在微型柱探针上的适当条件下，优选地在封闭的回路中，让所述复杂混合物循环通过所述设备的微型柱阵列，c.如果必要，在开放回路中，让洗液循环通过该微型柱阵列，以除去未杂交或未特异性杂交的分子，d.在微型柱行电极对之间施加电位差，室电极为正，而远侧的电极为负；在横向管道电极对之间施加电位差，下横向管道为负，而上横向管道为正，以使在步骤e变性后DNA或RNA分子保留在每个微型柱，e.在能使探针/靶复合物变性的条件下，让变性溶液循环通过微型柱阵列的一个或多个行，以洗脱DNA或RNA分子，f.将施加在所述阵列微型柱行的行极对上的电位差颠倒或取消，g.从所述阵列行的微型柱洗脱的靶循环到检测器，h.使用检测器回收和/或分析每种靶。
43.根据权利要求41或42中任一权利要求所述的方法，其特征在于包括a.把含有待分离DNA和/或RNA分子的复杂混合物加入到根据权利要求18-20中任一权利要求所述的设备中，b.在能将靶特异连接在微型柱探针上的适当条件下，优选地在封闭的回路中，让所述复杂混合物循环通过所述设备的微型柱阵列，c.如果必要，在开放的回路中，让能除去未杂交或未特异性地杂交分子的洗涤溶液循环通过所述微型柱阵列，d.下横向管道与第一容器连接，该容器装有变性溶液，它含有的负离子能在电场中迁移，上横向管道与第二容器连接，该容器装有变性溶液，它含有同样的负离子，e.在下和上横向管道以及远侧的行电极上施加负电位，而在室的行电极上施加正电位，使得所述溶液中的负离子迁移到带正电荷的微型柱中，并使所述分子靶变性，f.在横向管道电极对之间施加电位差，上横向管道为负，而在第二下横向管道为正，g.将施加在所述阵列微型柱行的行电极对上的电位差颠倒或取消，以便通过电泳能够将该阵列行的微型柱的变性靶迁移到检测器，h.使用所述检测器回收和/或分析每种靶。
44.根据权利要求42或43中任一权利要求所述的方法，其特征在于所述的方法包括a.根据权利要求24或25所述设备的构造，其中每个微型柱装有代表性比例的转录组的RNA或DNA靶，b.加入固定在所述阵列每个微型柱中的RNA或DNA靶的特异互补探针化学计算量混合物，每种对靶特异的探针的分子量与其它探针是不相同的，使得在质谱仪中彼此可鉴定，c.在能将所述探针特异连接在所述靶上的适当条件下，而所述靶固定在这些微型柱上，让所述探针混合物循环通过所述设备微型柱阵列，d.洗脱在这些微型柱中固定的靶上特异性保留的探针，e.让从所述微型柱洗脱的探针迁移到由质谱仪构成的检测器中，f.使用质谱仪分析每种探针。
45.复杂混合物中分子靶的分离与定量分析方法，所述的方法包括a.把含有待分离分子靶的复杂混合物加入到根据权利要求27-33中任一权利要求所述的设备中，b.在根据权利要求27-33中任一权利要求所述设备的电极之间施加电位，以便这些靶能够从一个毛细管网末端迁移到其它末端，以及这些与探针互补的靶能够被杂交，c.使用检测器原位分析或回收和分析每个与探针的杂交靶。
46.分析转录组的方法，该方法包括使用a.磁微粒组，在其微粒上固定了待分析转录组的代表性靶集合，以及b.不同类型的探针组，其中在该探针组中每种探针型对于与所述靶的靶型是特异性的和互补的以生成化学计量混合物。
47.根据前述权利要求所述的方法，其特征在于形成化学计量混合物的所述探针组的每种探针型对于靶型是特异性的、互补的。
48.根据前述权利要求所述的方法，其特征在于通过分子量可毫无歧义地鉴定在所述混合物中存在的每种探针型，将下述三个标准结合可达到其鉴定经验式、尺寸和用重原子的任选标记。
49.根据前述权利要求所述的方法，其特征在于通过其尺寸和荧光标记物可毫无歧义地确定在所述混合物中存在的每种探针型。
50.采用直接吸收将核酸聚合物固定在用ITO制成的电极上的方法。
51.SPR的分析方法，包括在电极上靶杂交，采用离液剂去杂交，通过电位保持靶，电位颠倒，使所述靶迁移到非官能化电极上，测量所述非官能化电极上的SPR。
全文摘要
本发明涉及分离和/或分析溶于复杂混合物中的一些靶分子的设备，其特征在于其包括a)微型柱阵列，其中每个微型柱(2)包括固定的分子探针，其通过特定探针/靶连接能保留在该复杂混合物中含有的特异分子靶，b)第一毛细管网(3)，将加到本发明设备的复杂混合物循环到在a)定义的阵列的每个微型柱中，c)第二毛细管网(4)，在洗脱后将保留在所述微型柱上的分子靶循环到进行其回收和/或分析的检测器(5)中，以及d)如果必要，用于回收和/或分析不同的分子靶的检测器(5)，优选为质谱仪形式。
文档编号B01J19/00GK1882839SQ200480034294
公开日2006年12月20日 申请日期2004年8月27日 优先权日2003年9月24日
发明者尼古拉斯·乌戈林, 西尔维·舍维拉尔, 卡特琳·奥里, 热罗姆·勒博 申请人:原子能委员会