专利名称：一种热休克蛋白提取柱的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及生物医药领域用的器材，特别是涉及一种用于分离纯 化热休克蛋白的分离提取柱。
背景技术：
将单 一蛋白从蛋白混杂的溶液中纯化出来需要经历 一 系列很复杂和繁 瑣的分离提取过程，耗费时间长而最终收率却很低。随着生化技术的发展 出现一种操作简便、分离特异性高、用于分离纯化生物大分子的方法一亲
达到快速纯化目标蛋白的目的。
发明内容
本发明的目的是要为从事生物学、医学临床应用、基础研究、企业生 产或科研开发单位提供出 一种能够方便快捷地从杂蛋白溶液中分离纯化出
高纯度的热休克蛋白(Heat Shock protein,缩写HSP ),以及热休克蛋白-多月太复合物(Heat Shock Protein Peptide Complexes,缩写HSPPC )的亲 和柱。
热休克蛋白是一类同源性极高、序列非常保守的存在于细胞内的家族 蛋白，才艮据其分子大小和结构特性可分为多个家族成员，如HSP-27 、 HSP-40、
HSP-60、 HSP-70、 HSP-90、 HSP gp96、 HSP-110等。热休克蛋白主要存在于 胞浆内，HSP gp96蛋白主要存在于内质网腔内。它们平时处于低水平的表 达状态， 一旦细胞出现生理性、病理性或环境的突发性变化时HSP的表达 便会急剧提高，因此热休克蛋白又被称为"应激蛋白"。HSP通过参与蛋白 质的结合、折叠、亚单位的装配、跨膜转运及抗原递呈对细胞的生长、分 化、基因转录和自我保护发挥重要作用。HSP的另一个重要特性是其具有结 合入侵机体内部的外源病原体及机体内源细胞变异蛋白质和多肽的能力。 它们与外源蛋白和多肽、内源变异蛋白和多肽分子群结合，形成HSPPC参 与抗原递呈而其HSP本身并不产生抗原性，因此HSP又被称为"分子伴估"。 制备出一种能使生物学实验室、临床医学实验室、生物制药企业快速、便 捷和高效的分离纯化HSP或HSPPC的分离^是取柱在实际应用中有着迫切的 需求和重要的实际意义。
根据抗体与抗原结合、受体与配体结合、酶与底物结合、物质之间有 特异性亲和或结合的原理，将可亲和或结合特定HSP类型的物质偶联到固 相树脂上，然后将树脂装入管状容器层析管中。层析管的特征为一端的底 部有溶液流出口，其上安置有滤过装置，可为尼龙网、陶覺筛或滤膜等， 其目的在于允许溶液流出但阻止树脂流失。层析管的两端可用塞子或盖子 封闭以防止树脂泄露、污染和干燥。
使用本热休克蛋白分离提取柱能够从杂蛋白溶液中方便快捷地分离纯 化出高纯度的特定类型的HSP及HSPPC。
本发明涉及的是制备"一种热休克蛋白提取柱"，它的特征是由"层析 柱"和"柱内填充物"组成。
第一部分的特征是层析柱，它是一种中空型的管状容器1,其下端有溶 液流出口2，流出口的上部放置滤过装置3，其作用是允许溶液流过但阻止
树脂流失。滤过装置可以是尼龙网、陶瓷板、玻璃纤维、滤膜等，也可由 任何能达到阻止树脂流失的材料替代。层析柱的上下两端可分别被盖子封 闭4、 5。
第二部分的特征"柱内填充物"是由一种与热休克蛋白家族中的任何一 种蛋白具有特异性亲和或结合能力的物质相偶联的固相树脂形成。将与HSP
家族成员中任意成员相亲和或结合物偶联的固相树脂6填充入层析柱内即
制备成分离纯化热休克蛋白或热休克蛋白复合物的提取柱。
填充的树脂可以是与能特异性亲和或结合人或动物的热休克蛋白的抗 体、或受体、或其它物质相偶联的固相树脂。与树脂相偶联的抗体可以是 结合热休克蛋白家族中的一种蛋白的单一抗体，或可结合同一种蛋白的多
种抗体的混合抗体；与树脂相偶联的抗体也可以是由可结合热休克蛋白家 族中不同成员的多种混合抗体。根据以上的设计可以制备快速分离纯化热 休克蛋白的提取柱，如
1. 将层析柱内填充与抗人HSP-70抗体偶联的树脂可以制备成分离纯化 人热休克蛋白-70 (HSP-70)或人热休克蛋白复合物-70 (HSPPC-70) 的提取柱。
2. 将层析柱内填充与抗人HSP gp96抗体偶联的树脂可以制备成分离纯 化人热休克蛋白gp96( HSP gp96 )或人热休克蛋白复合物gp96( HSPPC gp96 )的提取柱。
3. 将层析柱内填充与抗人HSP-27和HSP-90抗体偶联的树脂可以制备成 分离纯化人热休克蛋白-27和热休克蛋白-90或人热休克蛋白复合物 -27和热休克蛋白复合物-90的提取柱。
4. 将层析柱内填充ADP-树脂可以制备成分离纯化人或动物的热休克蛋 白-70 (HSP-70)或热休克蛋白复合物-70 (HSPPC-70)的提取柱。
偶联到固相树脂上的抗热休克蛋白的抗体可以是从鼠、兔、羊、马等动 物身上制备而成的抗多克隆抗体，也可以是单克隆抗体。
根据层析柱的大小和填充树脂的多少可制备出不同规格的"热休克蛋 白提取柱"。应用本方式制备的分离纯化热休克蛋白提取柱可以大幅度地减
轻人们为纯化各类HSP或HSPPC所付出的劳动强度、简化了操作程序、缩
短了纯化时间、提高了被分离蛋白的纯度。
应用者可根据各自实验室的条件、操作经验而调整提取条件而不必拘 限于本发明所叙述的实验条件。
图l是本实用新型结构示意图。
具体实施方式
组装层析柱(以分离纯化HSP-70为例)
(1) 偶联热休克蛋白-70抗体的固相树脂。
(2) 层析柱的材质不限，柱的规格不限。常用的尺寸有lx5cm、 1. 5xl0cm、 2x20cm等，可根据实际需求选用并可大批量制备。可分别向层析柱内 填充柱床体积为5ml、 l(M、 15ml或20mr的固相树脂,由此可制备 出柱床^见才各为5ml、 10ml、 15ml或20ml的分离才是取4主。
(3) 制备分离提取柱
使用千燥洁净的空置层析柱，将平衡液(PBS緩沖液pH 7.2， 0.01% 叠氮钠)浸泡偶联了 HSP-70抗体的树脂并用吸管将树脂与平衡液一 起灌装入层析柱中。使树脂在柱中自然沉降直至所需柱床体积，柱床 中不得留有气泡。
(4)柱的包装灌装完毕的HSP-70分离提取柱其内的树脂需浸泡在适量 的平衡液中，柱的两端用膜或盖子密封以防止树脂泄露、污染和干燥。 将封闭好的层析柱装入铝塑包装袋内封口后连同使用说明书一并放 入包装盒中。
(5 )柱的保存
组装完成的提取柱可放置在4。C保存一年。
实施例1
分离提取人肿瘤组织内的热休克蛋白复合物-70 ( HSPPC-70 ): 组织的处理
取实体瘤患者手术切除的肿瘤大约2cm3,用生理盐水沖净血污，修 剪去正常组织、结締组织和脂肪组织放入-80。C冰箱中冷冻2小时 或过夜。取出解冻后剪碎并置入匀浆器中。向匀浆器中加入适量预 冷的研磨緩冲液(10mM NaHCO" 0. 5mM PMSM, pH 7. 5 )研磨匀浆1 分钟。研磨后的组织匀浆液经过冷冻离心才几8000 rpm 15分钟离心 后取其上清液过抗人HSP-70分离提取柱。 亲和提取
将柱床规才各为5ml的HSP-70分离提取柱用平纟軒液冲洗并液面流至 树脂顶部，取离心后的肿瘤组织匀浆上清液直接加到分离提取柱上。 在室温下4吏匀浆液与树脂充分混合1小时，或4吏匀浆液流经柱的流 速控制在lml/10分钟。
洗涤
使用20倍柱床体积的平衡液充分冲洗提取柱，达到清除柱中所有杂 蛋白的目的。
洗脱
用25ml (5X柱床体积的)0. 1M甘氨酸-盐酸pH2. 7冲洗提取柱并收集 流出液。收集液迅速用1/10体积的lMTris-HC1 pH8. 0中和至中性。 蛋白的浓缩和分装
收集的洗脱液含有大量的人肿瘤HSPPC-70蛋白，可用Millipore公 司出品的Amicon Ultra-15 50Kd离心超滤管在4°C， 6000rpm，离心 10分钟/次。待溶液体积浓缩至1-2ml时，继续用蒸馏水脱盐浓缩2 次。蛋白浓缩液经紫外分光光度计的测定计算分离提取得到的 HSPPC-70蛋白含量，然后可按照需要进行分装。
保存
分离出来的HSPPC-70蛋白经冷冻干燥后可放置在-20。C冰箱内保存 l年不影响其生物学活性。
分离物的鉴定
利用HSP-70分离提取柱纯化出的HSPPC-70蛋白可用高效液相色谱 (HPLC )或聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE )分析洗脱产物的纯度。 可用紫外分光光度法做蛋白含量的测定。采用SDS-PAGE电泳和免疫 印迹试验达到蛋白定性的目的。
实施例2
从肺瘤细胞抹中提取HSPPC gp96蛋白 细胞的预处理
将人宫颈癌细胞株Hella细胞从培养皿上刮离连同培养液收集到离 心管中，1000rpm/min离心10分钟。弃去上清液，将沉淀的细胞用 平tf液温和地沖散并轻轻地沖洗然后再次离心耳又沉淀。收集大约湿 重1克左右的细胞沉淀物。
沉淀下的细胞移至塑料试管再加入5ml预冷的平衡液冲散并悬浮细 胞，然后做细胞超声破碎。
亲和提取
细胞裂解液经8000rpm/min离心15分钟取上清液过柱床Mi各为10ml 的HSP gp96分离提取柱。使细胞裂解上清液流经柱的流速在大约 lml/10分钟。然后用100ml平衡液充分沖洗分离提取柱以清除柱中 未被结合的杂蛋白。
洗脱
再用25ml (5倍柱床体积)0. 1M甘氨酸-盐酸pH2. 7洗脱与树脂结合 的HSP gp96蛋白，收集的洗脱液迅速用1/10体积的1M Tris-HC1 pH8. 0中和。
蛋白的浓缩和分装
收集的洗脱液中含有大量的肿瘤细胞HSPPC gP96蛋白，可用 Millipore公司出品的Amicon Ultra-15 50Kd离心超滤管在4°C， 6000rpm，离心10分钟/次。待溶液体积浓缩至1-2ml时，继续用蒸馏 水脱盐浓缩2次。蛋白浓缩液经紫外分光光度计的测定计算分离纯化 得到的HSPPC gp96蛋白含量，然后可按照需要进行分装。
保存
分离出来的HSPPC gp96蛋白经冷冻干燥后可放置在-2(TC水箱内保 存1年不影响其生物学活性。
分离物的鉴定
分离纯化出的HSPPC gp96蛋白可采用SDS-PAGE凝胶电泳、高效液 相色谱(HPLC)和紫外分光等方法做蛋白纯度和定量的检测。采用 免疫印迹法(Western Blot)做蛋白定性试验。
权利要求1、一种热休克蛋白提取柱，其特征在于它是由层析柱和柱内填充的固相树脂两部分组合而成。
2、 根据权利要求1所述的热休克蛋白提取柱，其特征在于，所 述层析柱是一种中空型管状物，其下端有溶液流出口，流出口的上部 放置有允许溶液流过但阻止树脂流失的滤过装置。。
3、 根据权利要求1所述的热休克蛋白提取柱，其特征在于，所 述的固相树脂是一种与热休克蛋白家族中的任何一种蛋白具有特异 性亲和或结合能力的物质相偶联的固相树脂。
4、 根据权利要求2所述的热休克蛋白提取柱，其特征在于，所 述的与热休克蛋白家族中的任何一种蛋白具有特异性亲和或结合能 力的物质是与热休克蛋白家族成员中任意种蛋白相结合的抗体。
5、 根据权利要求2所述的热休克蛋白提取柱，其特征在于，所 述的与热休克蛋白家族中的任何一种蛋白具有特异性亲和或结合能 力的物质是与热休克蛋白家族成员中任意种蛋白相结合的受体。
6、 根据权利要求2所述的热休克蛋白提取柱，其特征在于，所 述的与热休克蛋白家族中的任何一种蛋白具有特异性亲和或结合能 力的物质是与人或动物的热休克蛋白家族成员中任意种蛋白具有相 互特异性亲和或结合的化合物。
专利摘要一种热休克蛋白提取柱，它是由层析柱和在柱内填充的偶联了可特异性亲和或结合热休克蛋白物质的固相树脂两部分组合而成。该提取柱可从杂蛋白溶液中快速、简便、高纯度地分离出热休克蛋白或热休克蛋白复合物。
文档编号B01D15/22GK201176420SQ20072018728
公开日2009年1月7日 申请日期2007年12月20日 优先权日2007年12月20日
发明者苏 韩 申请人:北京中天康泰生物科技有限公司