生物芯片基底和制造生物芯片基底的方法

专利名称：生物芯片基底和制造生物芯片基底的方法
技术领域：
本发明涉及生物芯片基底(substrate)，更具体地，用于制备将生物材料固定在基 底上预定位置的生物芯片以及用于获得关于待检测的各种生物样品的信息的基底。本发明 特别涉及适合于通过直接在基底上化学合成探针DNA来制备DNA芯片的生物芯片基底。
背景技术：
“生物芯片”是以下装置的通称，在所述装置中，与待检测的生物物质以特异性方 式进行化学反应的生物物质被固定在芯片表面上的预定位置。DNA芯片是生物芯片的典型例子，它用于检测包含在血液或者细胞提取物中的靶 DNA的类型和数量。DNA芯片具有例如以下结构，在所述结构中，数万种探针DNA在基底如载玻片上排 成阵列，每个探针DNA都为已知序列的单链DNA。当含有荧光标记的靶DNA的待检测液体补给到DNA芯片时，只有具有与探针DNA 序列互补的序列的靶DNA被固定，探针DNA与其形成氢键并形成双链。其结果是，靶DNA所 固定的部分是荧光显色的。通过测试在芯片上荧光显色部分的位置和颜色强度，可以检测 到靶DNA的类型和数量。为了制备以该方式使用的DNA芯片，必须将多个类型的具有预定序列的探针DNA 固定在基底表面上的预定位置。有两种主要的固定探针DNA的方法。第一种方法称为“微阵列方法”，在该方法中， 化学合成的或者由预期的活有机体中预先提取的探针DNA通过点滴或者印刷以阵列固定 在基底上。在另一种方法中，使用四个碱基胸腺嘧啶(T)、腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)和鸟嘌呤 (G)，在基底上直接化学合成多个类型的探针DNA，每个所述探针DNA都为具有根据设计的 预定序列的单链DNA。在第二种固定方法中，要求反应区和非反应区在用于化学合成的基底的表面上应 该以明确不同的方式形成，在所述反应区发生合成预期探针DNA的反应，所述非反应区不 涉及合成反应。作为由第二种方法制备的DNA芯片，例如“基因芯片(Gene Chip) ”(由Affymetrix Inc.生产的产品名字)是已知的。就该芯片来说，石英用作基底材料，应用显微光蚀刻(photolithography)以不同 的方式形成反应区和非反应区。而且，当化学合成探针DNA时，通过应用紫外线来活化在反 应区内的单链DNA，逐单元地形成单链DNA。在该芯片上，包含大约200，000个每个约20平方微米的点的反应区形成在单个基底上，约2，000, 000条的相同类型探针DNA的链都固定在一个点。在该芯片内，点以高密度形成于芯片上。因此，在一次测试中可以检测到大量类型 的靶DNA。日文公布的PCT申请No.平成9-500568的图2A所示的是如下所述的阵列平板 (array plate)0阵列平板制备如下首先，使Si基底的表面与氟代硅烷反应，在其上形成疏水的 氟代烷基硅氧烷薄层。然后，该薄层在规定的二维图案内移除，所以Si基底的表面在薄膜 被移除的点处将会暴露。最后，将暴露的表面与羟基硅烷或者烷基硅烷反应，所以暴露的表 面将含有羟基。因此，在该阵列平板上，Si基底的表面包含具有大表面张力的疏水性薄膜的位点 和具有亲水性羟基的位点。对于生物物质，前者用作非反应区，而后者用作反应区。当使用该阵列平板时，合成反应发生在亲水性位点，然后，待检测的液体补给到这 些位点。由于在亲水性位点周围的疏水薄膜的大的表面张力，待检测的液体保存在亲水性 位点。然而，在该阵列平板上，反应区和非反应区形成于Si基底的表面，相互之间几乎 齐平。所以，它在保存所补给的待检测液体方面没有足够的稳定性，因此，它不容易使用。而且，反应区的形成和非反应区的形成都依赖于Si表面和其它的化学品之间的 化学反应。反应并不总是以100%的产率发生，因此，反应区和非反应区之间的界限模糊不 是不可能。另一问题是疏水性薄膜和亲水性位点容易受外界的破坏。从保存待检测的液体方面考虑，在基底上，具有能够保存待检测液体的结构的底 孔(bottomed well)分布在基底的表面上，所述基底对于具有上述结构的阵列平板是优选。作为该类型的基底，日文公布的PCT申请No. 2002-537869公开了用于直接合成探 针DNA的基底和使用它化学合成探针DNA的方法。该基底的简图如

图1所示。基底1由Si晶片制成。在基底1的表面上，多个微管2形成在预定的阵列上。微 管2是凹陷的孔(底孔)，其直径为约1 μ m到1000 μ m,孔深为约1 μ m到500 μ m,它用作用 于探针DNA的化学合成的反应区。除了这些孔之外的表面部分是非反应区。该基底A制备如下步骤ai 通过应用显微光蚀刻和腐蚀于Si晶片1的表面Ia，形成如图2所示的中 间体A1,在该中间体上，与待形成的底孔几乎相同形状的凹陷孔2A形成在底孔即将形成的 位置上。步骤a2 通过例如在中间体A1上的Si晶片表面1和凹陷孔2A表面(它们的底部 和侧面)上进行热氧化处理，形成如图3所示的中间体A2，在该中体中，仅有这些表面的表 层部分转变成厚度约0. 5 μ m的氧化硅层3。步骤a3 在中间体^的氧化硅层3的表面上进行硅烷化处理。具体地，通过应用 使用NaOH的Brown方法，氧化硅层3的表面用碱处理，然后，用例如具有环氧硅烷类基团的 活性硅烷化剂处理。然后，硅烷化剂和环氧树脂的水解之间的联系成功地建立起来。作为 结果，得到如图4所示的中间体A3，在该中间体中，硅烷层4形成在氧化硅层3的表面上。在中间体A3中，由于硅烷的羟基存在于其整个表面，整个表面可以与DNA亚磷酰 胺反应。
步骤a4 通过应用亚磷酰胺方法于中间体A3的表面，用DNA亚磷酰胺T (胸腺嘧 啶)合成链长相应于约5个碱基的单链DNA的链。因此，形成具有如图5所示的底孔的中 间体A4，在该中间体中，寡核苷酸(5T)间隔层形成在硅烷层4上。应注意的是，合成的寡核苷酸(5T)的末端用二甲氧基三苯甲基(DMT)来阻断。中间体A4的整个表面覆盖有用DMT阻断的寡核苷酸(5T)的间隔层。然而，当通过 消除DMT阻断末端(脱除三苯甲基)来激活寡核苷酸的末端时，在那里可以合成探针DNA。因此，就中间体^来说，当制备DNA芯片时，由寡核苷酸(5T)的间隔层5所形成的整个表面用作反应区。然而，这不能满足用于合成探针DNA的基底的条件，即如下条件底孔和其它部分 应该明确分开地分别用作反应区和非反应区。因此，在中间体A4的层5上需要进行处理，使底孔成为反应区，而使其它部分变成 非反应区。该处理就是下一步骤的加帽处理。步骤a5 如图6所示，在中间体A4上，仅仅底孔充满有树脂滴(resindroplet) 6。 在这种情形下，在层5上进行加帽。具体地，通过在寡核苷酸(5T)的间隔层5上脱除三苯甲基处理，寡核苷酸(5T)的 末端被激活。然后，使用三氯乙酸、乙酸酐、二甲氨基吡啶等，被激活的寡核苷酸(5T)的末 端被阻断和失活。然后，使用有机溶剂如四氢呋喃，填满底孔的树脂滴6溶解并且去除，所以层5在 底部孔处将会暴露。在加帽过程中，由于底孔填满有树脂，在底孔内的寡核苷酸(5T)的间隔层5并没 有被加帽，而保持在能够反应的状态。同时，在除了被加帽的底孔以外的部分上，寡核苷酸 (5T)的间隔层变成不能进行合成反应的状态。这样，可以制备用于合成探针DNA的、如图7所示截面结构的基底。在该基底A上，凹陷的底孔2以预定的图案形成在Si晶片1的表面上。氧化硅层 3形成在Si晶片1上以覆盖其整个表面，硅烷层4形成在氧化硅层3上以覆盖其整个表面。在每个底孔2的底部2a和侧面2b上，其末端用DMT阻断的寡核苷酸(5T)的间隔 层5暴露出来。这些点形成用于合成探针DNA的反应区。同时，除了层5的这些点之外的 部分5a已经被加帽，形成非反应区。当通过亚磷酰胺方法，使用该基底A制备DNA芯片时，探针DNA的化学合成发生在 底孔2中。然而，该基底A存在以下所提到的问题。第一个问题是，在基底A上，反应区和非反应区之间的界限取决于在步骤a5中底 孔是如何填满树脂滴。通常，用树脂滴填满底孔是用压电注射器(piezoinjector)来处理。填满一个底 孔的树脂滴的供应量是微小的，具体地说，在皮升到微升数量级。因此，在步骤a5中，有时 候，填满底孔的树脂滴的供应量太多，树脂溢出底孔；有时候，树脂滴的供应量太少，以致不 能完全填满底部孔。在前者情况中，在底孔周围部分的表面覆盖有溢出底孔的树脂。作为结果，在下一 步的加帽处理中，该周围部分的表面不能进行加帽，保持能够进行合成反应。
因此，当制备DNA芯片时，探针DNA也在底孔周围部分的表面上化学合成。作为结 果，当靶DNA使用所制备的DNA芯片来检测时，荧光显色不仅发生在底部孔，而且发生在树 脂溢出的底孔周围部分。这会阻碍准确地读取荧光标记。而且，在供应的树脂滴的量太少以致不能填满底孔的情况中，覆盖在底孔内表面 的树脂的厚度很薄，因此，树脂容易被在加帽过程中所使用的酸溶液腐蚀。其结果是，位于 底孔的部分寡核苷酸(5T)间隔层可以被加帽。因此，当制备DNA芯片时，探针DNA不能在该底孔进行满意地化学合成。其结果是， 当检测靶DNA时，荧光显色在该底孔不能产生足够的显色强度。而且，如果在步骤a5中的加帽不足，它还可以引起以下问题当制备和使用DNA芯 片时，荧光显色不仅发生在底孔，而且发生在加帽不足的部分。换句话说，容易发生背底噪
曰° 而且，当在步骤 中形成凹陷孔2A (所述凹陷孔2A将形成底孔)时，凹陷孔2A的 深度由腐蚀时间的长度来确定。因此，如果腐蚀时间控制处理不准确，不能形成根据设计标 准的准确深度的底孔。发明公开本发明目的是提供一种可以不需要加帽来制备的生物芯片基底，所述加帽是用于 制备描述为具有底孔的生物芯片基底的例子的基底A所必不可少的步骤(步骤a5)，并且在 该生物芯片基底中，反应区和非反应区之间的界限是清楚的。本发明另一目的是提供一种生物芯片基底，与在传统的基底中相比，在所述生物 芯片基底中，具有根据设计标准的准确深度的底孔能够更容易地形成。为了实现上述目的，本发明提供一种生物芯片基底，其包括含有反应区和非反应 区的基底表面，所述反应区能够与生物物质反应，所述非反应区不与生物物质反应，凹陷的 底孔形成在基底表面上；以及能够与生物物质反应的材料层，其具有仅仅在底孔的底部暴 露的表面，暴露的表面形成反应区。特别是，本发明提供以下生物芯片基底，在所述生物芯片基底上，能够与生物物质 反应的材料层是氧化硅层，并且氧化硅层的表面是硅烷化的。本发明另一方面就是根据本发明的实施方式的生物芯片基底，所述生物芯片基底 具有使表面羟基化的第一层和沉积在第一层上的第二层，第二层具有抵达第一层的许多个 孔和用相同的溶液填满孔而形成的许多个凹槽。本发明的另一方面就是用于制备根据本发明实施方式的生物芯片基底的方法，所 述方法使沉积在第一层上的第二层的部分腐蚀，以显露出第一层，将第一层浸渍在氢氧化 钠溶液中，以引入多个羟基在第一层上。图1.是用于合成探针DNA的基底的实施例的透视图；图2.是在形成用于合成探针DNA的传统基底中的中间体A1的截面图；图3.是在形成基底A中的中间体A2的截面图；图4.是在形成基底A中的中间体A3的截面图；图5.是在形成基底A中的中间体A4的截面图；图6.是在形成基底A中的中间体A5的截面图；图7.是用于合成探针DNA的传统基底的实施例A的截面图8.是根据本发明第一实施方式的基底的基底结构实施例Btl的截面图；图9.是根据本发明第一实施方式的用于合成探针DNA的基底的实施例B1的截面图；图10.是用于形成基底B1的原材料的截面图；图11.是在其表面上形成有抗蚀剂的图10所示材料的截面图；图12.是如图11所示的材料并在其中的抗蚀剂上形成开口的截面图；图13.是以下材料的截面图，在所述材料中，形成用于孔的孔洞以使氧化硅层的
表面暴露；图14.是以下材料的截面图，在所述材料中，硅烷层形成在氧化硅层表面上；图15.是根据本发明的第一实施方式的另一基底B2的截面图；图16.是根据本发明的第一实施方式的另一基底B3的截面图；图17.是根据本发明的第一实施方式的另一基底B4的截面图；图18.是基底B1的结构的示意性截面图；图19.是基底B1的示意性截面图，其中，孔填满有树脂滴以掩蔽寡核苷酸(5T)的 间隔层。图20.是基底B1的示意性截面图，其中，在开口的底孔内，DMT已经从寡核苷酸 (5T)的间隔层的末端消除。图21.是基底B1的示意性截面图，其中，填满底孔的树脂已经被溶解并且去除。图22.是基底B1的示意性截面图，其中，DNA亚磷酰胺(C)化学结合到DMT已经被 去除的寡核苷酸(5T)上；图23.是用DNA芯片检测靶DNA的结果的图片，所述DNA芯片是用本发明第一实 施方式的基底B1来制备；图24.是用DNA芯片检测靶DNA的结果的图片，所述DNA芯片是用传统的基底A 来制备；图25.是依据本发明第三实施方式的生物芯片基底的平面图；图26.是依据本发明第三实施方式的生物芯片基底的、沿图25中线XXVI-XXVI的 第一截面图；图27.是依据本发明第三实施方式的生物芯片基底的、沿图25中的线 XXVII-XXVII的截面图；图28.是依据本发明第三实施方式的生物分子层的放大截面图；图29.是依据本发明第三实施方式的生物芯片基底的、沿图25中的线XXVI-XXVI 的第二截面图；图30.是依据本发明第三实施方式的硅烷膜和生物分子层的第一放大截面图；图31.是依据本发明第三实施方式的硅烷膜和生物分子层的第二放大截面图；图32.是依据本发明第三实施方式的覆盖平板的平面图；图33.是依据本发明第三实施方式的覆盖平板、沿图32中的线XXXII-XXXII的截 面图；图34.是在依据本发明第三实施方式的生物芯片基底上沉积的覆盖平板的截面 图35.是描述依据本发明第三实施方式的制备方法的、生物芯片基底的第一截面 图；图36.是描述依据本发明第三实施方式的制备方法的、生物芯片基底的第二截面 图；图37.是描述依据本发明第三实施方式的制备方法的、生物芯片基底的第三截面 图；图38.是描述依据本发明第三实施方式的制备方法的、生物芯片基底的平面图；图39.是描述依据本发明第三实施方式的制备方法的、沿图38中的线 XXXIX-XXXIX的第四截面图；图40.是描述依据本发明第三实施方式的制备方法的、生物芯片基底的第五截面图；图41.是描述依据本发明第三实施方式的制备方法的、生物芯片基底的第六截面 图；图42.是描述依据本发明第三实施方式的制备方法的、生物芯片基底的第七截面 图；图43.是描述依据本发明第三实施方式的制备方法的、生物芯片基底的第八截面 图；图44.是描述依据本发明第三实施方式的制备方法的、生物芯片基底的第九截面 图；图45.是描述依据本发明第三实施方式的制备方法的、生物芯片基底的第十截面 图；图46.是描述依据本发明第三实施方式的制备方法的、生物芯片基底的第十一截 面图；图47.图示依据本发明第三实施方式的被保护的碱基；图48.是描述依据本发明第三实施方式的制备方法的、生物芯片基底的第十二截 面图；图49.是描述依据本发明第三实施方式的制备方法的、生物芯片基底的第十三截 面图；图50.图示依据本发明第三实施方式的亚磷酰胺；图51.是描述依据本发明第三实施方式的制备方法的、生物芯片基底的第十四截 面图；图52.是描述依据本发明第三实施方式的制备方法的、生物芯片基底的第十五截 面图；图53.是描述依据本发明第三实施方式的制备方法的、生物芯片基底的第十六截 面图；图54.是描述依据本发明第三实施方式的制备方法的、生物芯片基底的第十七截 面图；图55.图示依据本发明第三实施方式的去保护的碱基；图56.是描述依据本发明第三实施方式的制备方法的、生物芯片基底的第十八截面图；图57(a)所示的是在依据本发明第三实施方式的生物芯片基底上的荧光图像；图 57(b)所示的是在早期的生物芯片基底上的荧光图像；图58.是描述依据本发明第三实施方式的第一次改进的制备方法的、生物芯片基 底的第一截面图；图59.是描述依据本发明第三实施方式的第一次改进的制备方法的、生物芯片基 底的第二截面图；图60.是描述依据本发明第三实施方式的第一次改进的制备方法的、生物芯片基 底的第三截面图；图61.是描述依据本发明第三实施方式的第一次改进的制备方法的、生物芯片基 底的第四截面图；图62.是描述依据本发明第三实施方式的第一次改进的制备方法的、生物芯片基 底的第五截面图；图63.是依据本发明第三实施方式的第二次改进的生物芯片基底的平面图；图64.是依据本发明第三实施方式的第二次改进的生物芯片基底的、沿图63中的 线LXIV-LXIV的第一截面图；图65.是依据本发明第三实施方式的第二次改进的覆盖平板的平面图；图66.是依据本发明第三实施方式的第二次改进的覆盖平板的、沿图65中的线 LXVI-LXVI的第二截面图；图67.是在依据本发明第三实施方式的第二次改进的生物芯片基底上的覆盖平 板的截面图。发明最佳实施方式在本发明的生物基底上，能够与生物物质反应的反应区和不与生物物质反应的非 反应区以明确地不同的方式形成在基底表面上。此处，术语“生物物质”用来表示具有与待检测物质反应或者结合的位点的生物分 子或者生理上活性的物质。而且，术语“生物物质”用于此处包括与以上意义上的生物物质 有亲合力的物质。生物物质并不限制于特定的物质。例如，可以提及地物质有具有与核酸 如寡核苷酸、多核苷酸、脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)结合的位点的物质；具有生 理学上或者药理学上活性位点的物质如酶、维生素、肽、蛋白质、荷尔蒙、内分泌干扰化学试 剂(endocrine disturbing chemicals)、糖和脂质；RNA和蛋白质的复合物以及蛋白质如凝 集素和糖的复合物。通过将与待检测的生物物质以特定方式反应的生物物质固定在本发明的生物芯 片基底的反应区上，可以制成不同类型的芯片。使用用于合成探针DNA的基底作为例子，本发明的生物芯片基底将描述如下。根据本发明第一实施方式的基底类似于上述的图7的基底A，其中，基底的表面包 含有反应区和非反应区，在所述反应区，使用DNA亚磷酰胺能够发生形成探针DNA的反应， 在所述非反应区，并不发生该反应。然而，在基底A上，非反应区通过加帽形成。同时，在本发明第一实施方式的基底 上，反应区由反应活性材料组成，而其它的区域由在反应中非活性的材料组成。因此，根据
9本发明第一实施方式的基底的最重要特征是，反应区和非反应区以明确地不同的方式形成，而没有进行表面失活处理如加帽。首先，根据本发明第一实施方式，基底的基本结构的实施例Btl如图8所示。基底Btl是平板状的片，它具有包括两个Si层131、131和在它们之间的氧化硅层 132的夹层结构，其中，抵达氧化硅层132的表面132a的孔13A以预定的阵列图案形成在其 中的一硅层131上，所述孔13A用作底孔。因此，在基底B。上，仅仅在孔13A的底部暴露氧化硅层132的表面132a，而基底B。 的其它表面是在Si中。仅仅氧化硅层132的表面用作用于合成例如单链DNA的反应区，而 基底Btl的所有其它表面用作非反应区。图9所示的是使用上述基底Btl制备的另一基底的实施例Bp在该基底B1中，硅烷层14仅仅形成在基底Btl中的孔13A的底部。在硅烷层14上， 形成寡核苷酸(5T)的间隔层135，每个通过成功地合成5个单元的DNA亚磷酰胺T来形成。 其结果是，孔13A用作底孔13。在基底B1中，仅仅在底孔13的底部135a暴露能够合成探针DNA的寡核苷酸(5T) 间隔层135，而底孔13的侧面135b和硅层131的表面131a则保持在硅中。因此，在基底B1中，仅仅底孔13的底部用作用于合成探针DNA的反应区，而其它 部分包括底孔13的侧面和基底表面则在化学合成探针DNA中为非反应区，实际上，即没有 进行表面失活处理如加帽。应该注意的是，在基底&上提供硅烷层14，所以寡核苷酸(5T)间隔层135能够有 效地合成，然而在基底B1上提供硅烷层14并不是必不可少的，因为寡核苷酸(5T)间隔层 135可以直接合成在氧化硅层132的表面132a上。基底B1制备如下首先，如图10所示，制备以下结构的平板状片，在所述结构中，氧化硅层132夹入 在两硅层131、131之间。应该注意的是，其中一硅层131应该具有几乎等于待形成的底孔 的深度的厚度。作为该类型的平板状片，SOI (硅层在绝缘体上)晶片可以由Shin-EtsuChemical Co. Ltd 购买。接着，如图11所示，其中一硅层的整个表面131a覆盖有抗蚀剂16。具有与待形成 的底孔有相同直径的开口的遮光板(mask)放置在抗蚀剂上，并应用紫外射线。然后，去除 遮光板，整个基底逐渐形成。其结果如图12所示，与待形成的底孔有相同直径的开口形成在抗蚀剂16上，在这 些开口处，暴露硅层131的表面131a。然后，使用抗蚀剂16作为掩蔽，在硅层131上用硅腐蚀剂进行腐蚀，形成抵达氧化 硅层132的表面132a的孔13A。当去除硅层到达氧化硅层132的表面132a时，腐蚀自动停止。其结果如图13所示，获得以下的片，在所述片中，仅仅在孔13A的底部暴露氧化硅 层132的表面132a，其它表面部分由硅组成。应该注意的是，在该片上的孔13A具有与待形 成的底孔相同的直径和深度。然后，进行硅烷化处理。在氧化硅层表面上发生硅烷化反应，所以硅烷层14仅仅形成在孔3A的底部132a上(图14)。 最后，通过应用亚磷酰胺方法，使硅烷层14与DNA亚磷酰胺T反应，形成寡核苷酸 (5T)的间隔层135，每个都为5个T的单链DNA的链。因此，获得如图所示的基底&。
在该方法中，DNA亚磷酰胺在硅烷层上仅与羟基形成共价键连。因此，合成反应仅 发生在底孔的底部132a上。同时，由于DNA亚磷酰胺T不与Si暴露的部分反应，尽管没有 进行加帽处理，该部分保持为非反应区，它不像使用基底A的情形。制备基底B1 (B0)的方法和制备传统基底A的方法之间的比较揭示如下首先，就基底A来说，在步骤a2中，必须在Si晶片的表面上进行热氧化处理，以形 成氧化硅层。同时，根据本发明第一实施方式的基底B1(Btl)则不要求步骤a2。而且，就基底A来说，在步骤a5中，一系列处理即用树脂滴填满底孔、加帽、分解和 去除树脂是不可缺少的。同时，根据本发明第一实施例的基底B1根本不要求这些处理。因此，就基底B1(Btl)来说，由供应给底孔太多或者太少量的树脂滴所产生的问题 可以消除，反应区和非反应区之间的界限清楚。而且，反应区仅仅包含由应用显微光蚀刻和 腐蚀所形成的孔13A的底部，其它表面部分形成在非反应区。因此，当使用由该基底制成的 DNA芯片时，它允许高准确率地读取荧光标记，并可防止背底噪音。进一步地，就基底A来说，为了形成具有根据设计标准深度的底孔，必须准确地控 制在步骤 中的用于腐蚀的腐蚀时间。同时，就基底B1 (Btl)来说，去除部分Si层131的腐 蚀自动地停止在去除抵达氧化硅层的表面的时刻。所形成的孔的深度唯一地由所使用的Si 层厚度来决定。因此，所形成的底孔具有非常准确的深度。基底的另一实施例B2如图15所示。在基底B2中，例如通过热氧化，在Si平板141的一侧仅表层部分变成氧化硅层 141a。在该氧化硅层141a上，形成预定厚度的材料层142，所述材料不与生物物质如DNA亚 磷酰胺T反应，并且不被在合成DNA中所使用的有机溶剂、酸溶液、碱溶液等腐蚀。通过整个 层142的厚度，预定直径的孔23以预定阵列图案的方式形成在氧化硅层141a的表面141b 上。在氧化硅层141a的表面141b上，以该顺序形成硅烷层14和寡核苷酸(5T)的间 隔层135，所述寡核苷酸每个都为由硅烷层14和DNA亚磷酰胺T反应所形成的5个核苷酸 的单链DNA的链。就基底B2来说，能够与DNA亚磷酰胺T反应的寡核苷酸(5T)间隔层135的表面 仅仅在孔23的底部暴露出来，以形成反应区。所有的其它部分为由不与DNA亚磷酰胺T反 应的材料组成的非反应区，尽管它没有进行失活处理。此处，用于层142 (形成非反应区)的材料例如单晶硅、不容易形成氧化物的金属 如钼、氮化物如氮化硅、没有反应活性的官能团的塑料如聚乙烯和聚苯乙烯可以提及到。层 142可以通过以下膜形成方法来形成，如将如上述的材料连接到氧化硅层上、将如上述材料 真空沉积或者化学气相沉积(CVD)在氧化硅层的表面上、气相聚合单体。孔23可以例如通 过应用显微光蚀刻和腐蚀来形成。基底的另一实施例B3如图16所示。在基底B3中，与基底B2的层相同的层142形成在玻璃平板151的表面上。通过层 142的整个厚度，抵达玻璃平板151的表面151a的孔152形成为底孔，仅仅在孔152的底部暴露的玻璃平板表面1513上，形成硅烷层14和寡核苷酸(5T)的间隔层135。就基底B3来说，寡核苷酸(5T)间隔层135的表面仅仅在孔152的底部151a处暴 露以形成反应区。底孔的侧面和层142的表面形成非反应区，尽管它们没有进行失活处理。基底的另一实施例B4如图17所示。在基底B4中，预定直径和深度的孔形成在由相同类型的材料组成的平板状片161 的表面161a上，所述材料不与DNA亚磷酰胺T反应，并且不被在合成DNA中所使用的有机 溶剂、酸溶液、碱溶液等腐蚀。通过在孔的底部1623上形成氧化硅层163，然后在氧化硅层 163上以该次序形成硅烷层14和寡核苷酸(5T)间隔层，将这些孔制成底孔。还就基底B4来说，位于底孔的底部的寡核苷酸(5T)间隔层135仅仅是能与DNA亚 磷酰胺T反应的部分，而其它部分为非反应区。作为形成非反应区的材料，例如Si和碳化物如氮化硅可以提及。当使用平板状的Si片时，通过应用干燥腐蚀如反应性的离子腐蚀或者离子研磨 (ion milling)、或者例如湿腐蚀，可以形成上述底孔。底孔可以形成如下通过应用SIMOX (通过注入氧来分隔)的方法使氧离子进入至Si平板表面以下的 位置，在从Si平板表面的一定深度处形成氧化硅层。然后，通过从Si平板表面到氧化硅层 形成孔，可以获得底孔。可选择地，底孔可以形成如下Si平板的表面被一次氧化。然后，通过应用显微 光蚀刻和腐蚀于所得到的氧化硅表面层，以预定的阵列图案形成开口。然后，通过上述的 SIMOX方法，使氧离子进入至在开口处暴露的Si表面以下的位置，然后，氧化硅表面层通过 腐蚀来去除。作为结果，获得如下结构，在所述结构中，恰好在开口的位置掺杂的氧化硅层 形成在从Si平板表面的一定深度处。然后，通过在开口的位置形成从Si平板表面到氧化 硅层的孔，可以获得底孔。接着，使用本发明第一实施方式的生物芯片基底来制备生物芯片的方法将使用以 下实施例来描述，在所述实施例中，通过亚磷酰胺方法使探针DNA固定的DNA芯片是用如图 9所示的基底B1来制备。首先，制备基底Bp如图18中以简化方式所示的，在以阵列排列在基底&上的每 个底孔13中，用DMT阻断其末端的寡核苷酸(T5)间隔层135仅仅固定在底孔的底部。步骤Id1 对底孔进行树脂掩蔽处理。具体地，在所排列的底孔中，除了那些应该与 DNA亚磷酰胺C (胞核嘧啶)进行化学反应的所有底孔例如填满树脂滴6。正如图19所示，在填满树脂滴6的底孔中的寡核苷酸(5T)间隔层通过树脂来阻 断，而在未填满树脂滴6的底孔中的寡核苷酸(5T)间隔层处于其末端的DMT可以被消除的 状态。步骤b2 通过将酸溶液如三氯乙酸均勻地供给在基底的整个上表面上进行脱除三 苯甲基(detritilation)处理。其结果如图20中所示，在未填满树脂滴6的底孔中，从寡核苷酸(5T)间隔层上消 除DMT，所以那些寡核苷酸(5T)间隔层被激活。因此，在基底B1的表面上所排列的底孔中，仅有特定的孔(未填满树脂滴的孔)处 于能够与DNA亚磷酰胺反应的状态。
步骤b3 通过给基底表面供应有机溶剂，填满底孔的树脂滴被溶解和去除。其结果是如图21中所示，在基底上所排列底孔的底部中，激活的寡核苷酸(5T)间 隔层和用DMT阻断其末端的寡核苷酸(5T)间隔层暴露出来。步骤b4 通过将包含用DMT阻断其末端的DNA亚磷酰胺C的试剂均勻地供给在基 底的整个表面上进行DNA耦合处理。其结果是如图22中所示，在特定的底孔中，发生激活的寡核苷酸(5T)间隔层与所 供给的DNA亚磷酰胺C之间的合成反应，所以，寡核苷酸增长一个核苷酸，增长的寡核苷酸 的末端用DMT阻断。同时，在其它的底孔中，暴露的寡核苷酸(5T)间隔层使其末端用DMT阻断，所以， 它们是非活性的。因此，它们不与供给的DNA亚磷酰胺C反应。通过进行该DNA合成反应，在所述反应中，步骤Id1到b4形成一个循环，仅仅在未填满树脂滴的底孔中，寡核苷酸在一个循环中增长一个核苷酸。同时，填满树脂珠的底孔保持 如同它们在开始该合成反应之前的状况。有四种DNA亚磷酰胺T、A、C和G与寡核苷酸反应。因此，通过进行上述循环处理 四次，固定在底孔上的寡核苷酸可以增长一个核苷酸。这样，具有设计序列的探针DNA可以仅固定在基底B1上的底孔的底部中。当使用基底B1来制备DNA芯片时，DNA合成反应仅仅发生在底孔的底部中，其它部 分根本不涉及合成反应。因此，例如即使在步骤1^中，填充底孔的树脂滴溢出底孔，这根本 不影响DNA合成反应，除非树脂流入邻近的底孔中，所以对荧光标记物的读取根本没有反 作用。而且，在基底A的情况中所进行的失活处理(加帽)不再需要处理。在以上描述中，所有的基底Bi、B2、B3和B4都是用于DNA芯片的基底，在该基底上， 在基底Btl的氧化硅层表面上硅烷层的形成使探针DNA的合成反应能够进行。然而，根据本发明第一实施方式的生物芯片基底并不限制于该类型。通过用于形 成底孔的底部(反应区)的材料选择为能够将与待检测的生物物质以特定方式结合的生物 物质固定的材料，可以制备不同种类的芯片。例如，如果以特定方式结合到待检测生物物质的连接物质被固定在如图8所示的 基本结构的基底Btl的氧化硅层表面上，连接物质所固定的部分能够用作反应区，所述反应 区专用于与生物物质的反应。该情况中，基底的其它部分形成生物物质的非反应区，两个区 域由明确的边界分开。例如，当硅烷偶联剂如氨丙基甲氧基硅烷或者具有官能团如环氧基、甲苯磺酰基、 激活的羰基、氨基、硫醇基或者溴氨基(bromoatoamido)的物质用作连接物质时，在其末端 有氨基、硫醇基、羟基、羰基、溴氨基(bromoatomamido)等的生物物质通过使用连接物质可 以固定在基底Btl的氧化硅层表面上。而且，通过将双链DNA、蛋白质、肽、糖、RNA-蛋白质复合物或者糖-蛋白质复合物 用作生物物质，可以制备用于检测转录因子(确定双链DNA的特定碱基序列并且结合到生 物物质上)的芯片、用于检测肽的芯片、用于检测蛋白质的芯片、用于检测糖的芯片、用于 消化蛋白质的芯片等。使用SOI晶片(由Shin-Etsu Chemical Co. Ltd.生产)作为原材料，具有如图9 所示最终结构的基底B1通过在图10-14中所示的方法来制备。
基底B1的说明如下尺寸=IcmXlcm;底孔的形状直径为300 μ m，深为20 μ m ；底孔在基底上以栅格图案方式排列，其中，9孔为一列，14孔为一排。硅烷层用5，6-环氧三乙氧基硅烷(5，6ipoxytriethoxysilane)来形成，寡核苷 酸间隔层通过使用DNA合成试剂(由Proligo Japan K. K.生产)的亚磷酰胺方法来形成。使用基底B1和应用亚磷酰胺方法，制备DNA芯片，其中，具有以下序列的探针DNA 在孔中合成。1.3' -ATCTCACACGTCAAATAG-5 ‘2. 3 ‘ -ATCTCACTCAAATAG-5‘3.3' -ATCTCACGCAAATAG-5 ‘4. 3 ‘ -ATCTCACCCAAATAG-5‘5. 3 ‘ -ATCTCACACAAATAG-5‘6. 3 ‘ -ATCTCACCAAATAG-5‘使用该DNA芯片，进行荧光标记的靶DNA检测测试。图23是显示其结果的图片。正如图23中所看到的，相应于探针4的点的荧光强度最高。由此，证明靶DNA的 序列为 5' -TAGAGTGGGTTTATC-5‘。在2、3和4的每个探针中，位于序列中间的碱基产生错配。在探针1中，碱基序列 太长，并产生错配；而在探针6中，碱基序列太短，并产生错配。为了比较，根据在日文公布的PCT申请No. 2002-537869中所公开的方法，具有如 图7所示结构的基底A通过加帽处理来制备。使用基底A，DNA芯片以与在实施例中相同的方式来制备，在所述DNA芯片中，具有 上述6序列的探针DNA被固定。靶DNA检测测试以与在实施例中相同的方式来进行，图24所示的是其结果。 还有在DNA芯片中，相应于探针4的点的荧光强度最高。因此，也可从该DNA芯片， 证明靶 DNA 的序列为 5 ‘ -TAGAGTGGGTTTATC-5 ‘。应该注意的是，如图24中所到的，在由基底A制备的DNA芯片上，围绕在每个点的 部分是荧光显色的，就是说，产生背底噪音，这使在荧光显色的点和基底表面之间的界限不清楚。这由以下事实所引起，即当在制备基底的方法中孔填满树脂滴时，树脂从孔溢出 至它们周围部分，所以这些周围部分没有进行加帽。在相应于探针4的点中，每个点的中部的荧光颜色很弱。这由以下事实所引起，即 供给太少量的树脂滴来填充孔。同时，作为整体每个点的荧光强度高，这是因为固定这些点 的探针DNA与靶DNA互相补充。与基底A相比，就基底B来说，所述基底B是本发明的第二实施方式的实施例，荧 光显色点与基底表面之间的界限很清楚，几乎不产生背底噪音。而且，每个荧光显色的点显示出均勻的荧光强度，测试的数据稳定。(第三实施方 式)参阅图25和26，根据本发明第三实施方式的生物芯片基底有半导体基底15，第 一层13具有待羟基化的表面，它沉积在半导体基底15上，第二层11沉积在第一层13上。第二层 11 有许多孔 41a、41b、41c、41d、41e、41f、41g、41h、41i、42a、42b、42c、42d、42e、42f、 42g、42h、42i、43a、43b、43c、43d、43e、43f、43g、43h、43i、44a、44b、44c、44d、44e、44f、44g、 44h、44i、45a、45b、45c、45d、45e、45f、45g、45h、45i、46a、46b、46c、46d、46e、46f、46g、46h、 46i、47a、47b、47c、47d、47e、47f、47g、47h、47i、48a、48b、48c、48d、48e、48f、48g、48h、48i、 49a、49b、49c、49d、49e、49f、49g、49h、49i。41a_49i 的每个孔抵达第一层 13。而且，如图25所示的第二层11有多个凹槽31a、31b、31c、31d、31e、31f、31g、 31h、31i、32a、32b、32c、32d、32e、32f、32g、32h、32i、33a、33b、33c、33d、33e、33f、33g、33h、 33i、34a、34b、34c、34d、34e、34f、34g、34h、34i、35a、35b、35c、35d、35e、35f、35g、35h、35i、 36a、36b、36c、36d、36e、36f、36g、36h、36i、37a、37b、37c、37d、37e、37f、37g、37h、37i、38a、 38b、38c、38d、38e、38f、38g、38h、38i、39a、39b、39c、39d、39e、39f、39g、39h 勾画在第二层 11 上。每个凹槽 31a-39h 连接到 41a-41i、42a-42i、43a-43i、44a-44i、45a-45i、46a_46i、 47a-47 i、48a-48 i、49a_49 i，用相同的溶液填满孔 41 a_49 i。第一层13由二氧化硅(SiO2)组成，第二层11由不同于第一层13的材料组成。例 如，第二层11由结晶硅组成。第一层13比第二层11具有更高的亲水性，因此，第一层13 与第二层11相比容易羟基化。参阅图26和27，凹槽31a连接孔41a和孔41b。类似地，每个其它凹槽31b_31i、 32a-32i、33a-33i、34a-34i、35a-35i、36a-36i、37a-37i、38a-38i、39a-39h 连接孔 4lb-41i、42a-42i、43a-43i、44a_44i、45a-45i、46a_46 i、47a-47i、48a_48 i、49a_49 i。在图26中，每个生物分子层91a、91b、91c、91d、91e、91f、91g、91h、91i都沉积在由 41a-41i每个孔所显露的第一层13的表面上。在91a_91i每个生物分子层，通过在第一层 13上探针生物分子中的官能团与羟基(-0H)之间形成共价键，许多探针生物分子共价键连 到第一层13。每个“探针生物分子”可以涉及脱氧核糖核酸(DNA)链、核糖核酸(RNA)链、 肽核酸核糖核酸(PNA)链或者蛋白质。在探针生物分子是DNA链、RNA链或者PNA链的情 况中，每个探针生物分子序列设计成与靶生物分子互补。图28描述了在生物分子层91a的 DNA链共价键连到第一层13。应该注意的是，第三实施方式不限于每个生物分子层91a_91i直接沉积在第一层 13上的情况。参考图29，许多硅烷膜81a、81b、81c、81d、81e、81f、81g、81h、81i沉积在由 41a-41i每个孔所显露的第一层13上。在81a_81i每个硅烷膜中，多个硅烷偶联剂在第一 层13上形成基质(matrix)。参看图30，共价键由在每个硅烷偶联剂中的甲氧基(-OCH3)与 羟基的酸_碱反应形成在第一层13上。例如，3-缩水甘油醚丙基三甲氧基硅烷、3-缩水甘油醚氧基丙基甲基二乙氧基 硅烷、3-缩水甘油醚氧基丙基三乙氧基硅烷、N-2 (氨乙基)3-氨丙基甲基二甲氧基硅烷、 N-2 (氨乙基)3-氨丙基三乙氧基硅烷、3-氨丙基三甲氧基硅烷可以用于每个硅烷偶联剂。再参看图29，每个生物分子层91a、91b、91c、91d、91e、91f、91g、91h、91i沉积在每 个硅烷膜81a-81i上。在每个生物分子层91a-91i与每个硅烷膜81a_81i之间的界限中， 氨键(-NH-C0-)由引入到每个探针生物分子的活性酯与例如图30中所示的硅烷偶联剂的 每个氨基(-NH2)之间的反应来形成。而且，每个硅烷 偶联剂与每个探针生物分子之间通过使用交联剂的连接是可 选择的。蛋白质如受体、配体、拮抗物、抗体和抗原包含官能团如在赖氨酸(Lys)中的氨基(-NH2)、在天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(GIu)中的羰基、在酪氨酸(Tyr)中的酚基 (-C6H4 (OH))、在组氨酸(His)中的咪唑基(-C3H3N2)和在半胱氨酸中的硫醇基(-SH)。因此， 对两端的氨基为反应活性的交联剂如辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)、辛二酸二磺基琥珀酰 亚胺酯(BS3)、二甲基辛二酸亚安酯·盐酸(DMS)、戊二酸二琥珀酰亚胺酯(DSG)、Loman试 剂、3，3' -二硫代[丙酸磺基琥珀酰亚胺酯](DTSSP)、乙二醇二 [琥珀酸琥珀酰亚胺酯]可 以用于连接探针生物分子和硅烷偶联剂。还有，对氨基和羰基为反应活性的交联剂如ι-乙 基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)可以使用。进一步地，对氨基和硫醇基为反应活性的交联剂如间-马来酰亚胺基苯甲 基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、琥珀酰亚胺4-[N-马来酰亚胺基甲基]-环己胺-1-羧酸酯 (SMCC)、4_对-马来酰亚胺基苯基-丁酸琥珀酰亚胺酯(SMPB)、N-琥珀酰亚胺3-[2_吡啶基 二硫]丙酸酯(SPDP)、Ν-[ γ -马来酰亚胺基氧化丁酰]琥珀酰亚胺磺酸酯(Sulfo-GMBS)、 磺基琥珀酸亚胺6-[3' -(2-吡啶基二硫)_丙酰胺]己酸酯(Sulfo-LC-SPDP)、间-马来 酰亚胺基苯甲基-N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯(Sulfo-MBS)、磺基琥珀酰亚胺4-[N-马来酰亚 胺基甲基]-环己胺-1-羧酸酯(Sulf0-SMCC)、4_对-马来酰亚胺基苯基-丁酸磺基琥珀 酰亚胺酯(Sulfo-SMPB)、可以用于连接探针生物分子和硅烷交联剂。在图31中，硅烷交联剂的每个氨基和抗体95a，95b，95c的每个氨基与DSS偶联。在图25 中所示的每个其它孔 42a-42i、43a-43i、44a-44i、45a-45i、46a-46i、 47a-47i、48a-48i、49a-49i的截面图与图26或者图28相类似。应该注意的是，二氧化硅玻璃也可以用作图26和图29中的第一层13。在这种情 况中，半导体基底15可以被排除。还有，树脂如聚四氟乙烯和不溶解的环氧抗蚀剂可以用 于第二层11。图25-31中所示的生物芯片基底的表面覆盖有如图32和33中所示的盖板25。盖 板25有开口 27、28、盖板由例如熔合的二氧化硅、丙烯酸树脂和聚碳酸酯组成。图34所图 示的是在盖板25沉积在如图25所示的生物芯片基底上的情况中的截面图。当通过生物芯片基底进行杂交测试时，制备含有用荧光染料如Cy3或者Cy5标记 的许多样品生物分子的样品溶液。该样品溶液可以分配到开口 27中。通过抽吸开口 28的 空气，如图34所示的每个孔41a-41i和每个31a_31i依次填满样品溶液。而且，如图25所 示的每个其它孔 42a-42 i、43a-43 i、44a_44i、45a_45 i、46a_46 i、47a_47 i、48a_48 i、49a_49 i 和每个其它凹槽 32a-32i、33a-33i、34a-34i、35a-35i、36a-36i、37a-37i、38a-38i、39a-39h 也依次填满样品溶液。在样品生物分子含有许多靶生物分子的情况中，所述靶生物分子与在生物分子 层91a-91i中的探针生物分子补充结合，靶生物分子可以诱捕在生物分子层91a-91i上。 抽吸样品溶液以后，孔 41 a-41 i、42a-42 i、43a-43 i、44a_44i、45a_45 i、46a_46 i、47a_47 i、 48a-48i、49a-49i 和凹槽 31a-31i、32a-32i、33a-33i、34a-34i、35a-35i、36a_36i、 37a-37i、38a-38i、39a-39h用缓冲溶液洗净。此后，通过观察荧光反应，可能能检测样品 生物分子是否包含靶生物分子。在每个孔41a-41 i、42a-42i、43a-43i、44a-44i、45a-45i、 46a-46i、47a-47i、48a_48i、49a_49i的直径大于600 μ m的情况下，荧光反应肉眼可见。如以上所述，由于如图25-34所示的生物芯片基底具有勾画在第二层11上的孔 41a-41i、42a-42i、43a-43i、44a-44i、45a-45i、46a-46i、47a-47i、48a-48i、49a-49i and
16the grooves 31a-31i、32a-32i、33a-33i、34a-34i、35a-35i、36a-36i、37a-37i、38a_38i、 39a-39h，可能能消除在生物芯片基底上的盖板25的精确队列。而且，所需要样品溶液的 体积等于孔 41a-41i、42a-42i、43a-43i、44a-44i、45a-45i、46a-46i、47a-47i、48a-48i、 49a-49i 和凹槽 31a-31i、32a-32i、33a-33i、34a-34i、35a-35i、36a-36i、37a_37i、 38a-38i、39a-39h的总体积。因此，减少样品体积是可能的。还有，凹槽31a-31i、32a-32i、 33a-33i、34a-34i、35a-35i、36a-36i、37a-37i、38a-38i、39a-39h 可以排除以下需求，即 用样品溶液通过点样仪器来填满每个孔41 a-41 i、42a-42 i、43a-43 i、44a_44i、45a_45 i、 46a-46 i、47a-47 i、48a_48 i、49a_49 i。因此，缩短杂交测试的时间是可能的。接着参看图35-56，描述用于制备第三实施方式的生物芯片基底的方法。在图35中，制备SOI (硅在绝缘体上)基底，所述基底具有半导体基底15，第一层13由SiO2组成，并沉积在半导体基底15上，第二层11有结晶硅组成，并沉积在第一层13 上，自然形成的氧化物膜12沉积在第二层11上。然后，抗蚀剂21通过旋涂机涂覆在自然 形成的氧化物膜12上，如图36所示。部分抗蚀剂21通过使用显微光蚀刻方法来选择性地腐蚀。从而，多个开口 51a、 51b、51c、51d、51e、51f、51g、51h、51i形成在抗蚀剂21上，如图37所示。此后，被开口 51a-51i所显露的自然形成的氧化物膜12和部分第二层11被选择性地腐蚀。因此，凹槽 31a-31i、32a-32i、33a-33i、34a-34i、35a-35i、36a-36i、37a-37i、38a-38i、39a-39h 勾画在 第二层11上，如图38和39所示。在图40中，抗蚀剂22通过旋涂机涂覆在自然形成的氧化物膜12上。此后，部分抗 蚀剂22通过使用显微光蚀刻方法被选择性地腐蚀。因此，许多开口 61a、61b、61C、61d、61e、 61f、61g、61h、61i形成在抗蚀剂22上，如图41所示。此后，被开口 61a-61i所显露的自然 形成的氧化物膜12和部分第二层11被选择性地腐蚀，直到第一层13显露出来。因此，孔 41a-41i勾画在第二层11上，如图42所示。SOI基底在室温条件下浸入搅拌的氢氧化钠溶液两小时。氢氧化钠溶液通过混和 98g的氢氧化钠、294ml的蒸馏水和392ml的乙醇来制备。通过将SOI基底浸入到氢氧化钠 溶液中，在第二层11上的自然形成的氧化物膜12被去除，如图43所示。而且，被孔41a-41i 所显露的第一层13的部分表面被羟基化。因此，许多个羟基(-0H)引入到第一层13的部 分表面上，如图44所示。具有环氧基的硅烷偶联剂如3-缩水甘油醚氧基丙基甲基二乙氧基硅烷、3-缩水 甘油醚氧基丙基三乙氧基硅烷或者具有氨基的硅烷偶联剂如N-2 (氨乙基)3-氨丙基三乙 氧基硅烷和3-氨丙基三甲氧基硅烷分配在被孔41a-41i所显露的第一层13部分表面上， 如图43所示。因此，硅烷膜81a、81b、81c、81d、81e、81f、81g、81h、81i形成在第一层13上， 如图45所示。当3-氨丙基三甲氧基硅烷滴在第一层13上时，许多氨基(-NH2)引入在第 一层13的表面上，如图46所示。此后，在第一层13上的剩下的自由羟基(-0H)被加帽，防 止参加其余的合成反应。例如，剩下的自由羟基(-0H)通过乙酸酐和1-甲基咪唑(四氢呋 喃溶液)来乙酰化。制备包含具有活性酯的第一核苷的溶液。每个第一核苷在5'-羟基端用二甲氧 基三苯甲基(DMTr)来阻断。在第一核苷的每个碱基中，腺嘌呤或者胞核嘧啶的氨基使用苯 甲酰基来保护，鸟嘌呤的氨基用异丁基来保护，如图47所示。含有第一核苷的溶液分配在硅烷膜81a上，如图46所示。因此，第一核苷的每个活性酯与硅烷偶合剂的每个氨基反应， 形成氨键(-NH-C0-)，如图48所示。此后，第一核苷的每个DMTr被3%的在二氯甲烷(DCM) 中的三氯乙酸来去除。在图49中，5'羟基(-0H)是在每个第一核苷上唯一的反应性基团。 包含四唑和许多亚磷酰胺的溶液分配在硅烷膜81a-81i上，所述亚磷酰胺是如图50所示的 另一核苷的的衍生物。在图51中，第一核苷的每个活性5'羟基(-0H)和第二核苷的每个 N,N- 二异丙基胺通过缩合反应来形成不稳定的亚磷酸盐的连接。此后，第一核苷的非结合 的活性5'-羟基(-0H)通过加入乙酸酐和1-甲基咪唑到第一层13上来乙酰化。为了使不稳定的亚磷酸盐连接变得稳定，稀释的碘在水、嘧啶和四氢呋喃中的溶 液加入到第一层13。在图52中，不稳定的亚磷酸盐连接被氧化，形成更多稳定的磷酸盐连 接。此后，第二核苷的每个DMTr被去除，重复该浓缩反应，直到链延长完成，如图53所示。在图54中，保护磷酸盐连接的每个氰乙基被浓缩氨劈开。还有，每个杂环保护基 团如图47所示的苯甲酰基和异丁基被浓缩氨劈开，每个杂环伯胺被去保护，如图55所示。 而且，在很末尾的碱基上的每个DMT被劈开，如图56所示。用图48-56所解释的方法也可 以在如图45所示的硅烷膜81b-81i上处理，形成生物分子层91a-91i，如图29所示。如上所述，用于制备根据第三实施方式的生物芯片基底的方法涉及用氢氧化钠溶 液处理SOI基底。因此，羟基(-0H)仅仅引入到第一层的表面上。还有，在第二层11由Si 组成的情况中，自然形成的氧化物膜12的厚度通常为2nm或者更低。氢氧化钠溶液在室温 条件下经过两个小时有效地去除这种自然形成的氧化物膜12。因此，后来加入的硅烷偶联 剂仅仅与第一层13上的羟基(-0H)反应，并不结合到第二层11的表面上。在早期的方法 中，硅烷偶联剂可以与剩余的自然形成的氧化物膜12反应。因此，用荧光染料标记的靶生 物分子也可以固定在自然形成的氧化物膜上。在自然形成的氧化物膜上的这种固定的靶生 物分子产生背底噪音。特别是在微观分析中，渴望开发出以下方法，所述方法仅仅将靶生物 分子固定在孔 41 a-41 i、4lb-41 i、42a-42i、43a-43i、44a_44i、45a_45i、46a_46i、47a_47 i、 48a-48i、49a-49i的底部，并防止靶生物分子结合到第二层11的表面，这是因为该方法改 进了在荧光分析中的对比度。用于制备生物芯片基底的方法满足该要求，因为羟基(-0H) 仅仅引入在第一层13的表面上，自然形成的氧化物膜12被去除掉第二层11的表面。因此， 制备可以排除背底噪音的生物芯片基底是可能的。图57(a)所示的是实施例的显微照片，当如图25所示的孔41a_42i、42a_42i暴露 在包含样品DNA的样品溶液中，所述样品DNA用荧光染料标记，并具有与固定在如图28所 示的生物分子层91a上的DNA序列互补的序列。图57 (b)所示的是实施例的显微照片，当 如图27所示的早期的生物芯片基底暴露在样品DNA中，所述样品用荧光染料来标记，并具 有与在基底上的序列互补的序列。在早期的基底中，样品DNA不仅与孔的底部结合，而且在 其它区域结合。还有，在孔的底部探测到污染物。然后，根据第三实施方式的生物芯片基底 使靶DNA仅仅在如图57(a)所示的孔的底部上杂交称为可能。还有，实现了在孔上荧光的 均勻性。在图37-42 中，凹槽 31a-31i、32a-32i、33a-33i、34a-34i、35a-35i、36a_36i、 37a-37i、38a-38i、39a-39h 提前勾画在第二层 11 上，然后，孔 41a-41i、41b_41i、42a_42i、 43a-43i、44a-44i、45a-45i、46a-46i、47a-47i、48a-4gi、49a-49i 勾画在第二层 11 上。相 反地，应该注意的是，提前形成孔 41a-41i、41b-41i、42a-42i、43a-43i、44a-44i、45a-45i、46a-46i、47a_47i、48a_48i、49a_49i，然后形成凹槽 3la_31 i、32a_32i、33a_33i、34a_34i、 35a-35i、36a-36i、37a-37i、38a-38i、39a-39h也是可以选择的。然而，由于每个凹槽 31a-31i、32a-32i、33a-33i、34a-34i、35a-35i、36a-36i、37a-37i、38a-38i、39a-39h 的深 度比每个孔 41a-41i、41b-41i、42a-42i、43a-43i、44a-44ix、45a-45i、46a-46i、47a-47i、 48a-48i、49a-49i 的深度更浅，提前形成凹槽 31a_31i、32a-32i、33a-33i、34a_34i、 35a-35i、36a-36i、37a-37i、38a-38i、39a-39h使在第二层11上均勻地涂覆抗蚀剂更容易。还有，在图45-56中，生物分子层91a_91i在硅烷膜81a_81i形成在第一层13上 之后形成。然而，在没有硅烷膜81a-81的情况下，在第一层13上将生物分子与羟基连接， 并且形成共价键连也是可以选择的。进一步地，尽管制备如图35所示的SOI基底，通过使用包含玻璃基底和聚四氟乙 烯基底的层压板制备生物芯片基底，也是可行的。在该情况中，玻璃基底用作第一层13，聚 四氟乙烯基底用作第二层11。(第三实施方式的第一次修改)用于制备生物芯片基底的方法并不限制于上述的第三实施方式。参看图58-62，描 述了用于通过使用环氧负性抗蚀剂来制备生物芯片基底的方法。在图58中，由环氧负性光抗蚀剂组成的第一抗蚀剂111通过例如旋涂机涂覆在由 玻璃组成的第一层上。此后，制备如图59所示的第一光掩模40。第一光掩模40有许多光 屏蔽图案140a、140b、140c。光屏蔽图案140a-140c符合在第一抗蚀剂111上待制备孔的形 状。然后，光照射在第一光掩模40上，部分第一抗蚀剂111暴露在光中。在图60中，由环 氧负性光抗蚀剂组成的第二抗蚀剂211通过旋涂机涂覆在第一抗蚀剂111上。因此，第一 抗蚀剂111和第二抗蚀剂211形成第二层11。在图61中，制备第二光掩模50。第二光掩 模50有光屏蔽图案150。光屏蔽图案150符合在第二层11上所形成的孔和凹槽的形状。 然后，光照射在第二光掩模50上，部分第二抗蚀剂211暴露在光中。烘烤暴露的第一抗蚀剂111和暴露的第二抗蚀剂211。应该注意的是，无掩蔽的烘 烤使第一抗蚀剂111和第二抗蚀剂211不溶解于缓冲溶液中。此后，第一抗蚀剂111和第二 抗蚀剂211用碱性显影剂来显影。因此，孔41a-41i和凹槽31a-31i形成在第二层11上， 如图62所示。随后，实施由图44-56所解释的方法，用于制备生物芯片基底的方法完成。(第三实施方式的第二次修改)参看图63和图64，根据本发明第三实施方式的第二次修改的生物芯片基底与在 图25和图26中所示的基底不同，在图25和图26中所示的基底没有勾画在第二层11上的 凹槽 31a-31i、32a-32i、33a-33i、34a-34i、35a-35i、36a-36i、37a-37i、38a-38i、39a-39h。 接着参看图65和图66，根据第三实施方式的第二次修改的盖板125不同于在图32和图 33中所示的盖板25，在图32和图33中所示的盖板25存在有如图65和图66所示的凹槽 300。在盖板125放置在图63和图64所示的基底上的情况中，凹槽300连接到孔41a_41i、 4lb-41i、42a-42i、43a-43i、44a_44i、45a_45i、46a_46i、47a_47i、48a_48i、49a_49i。图 67 描述了以下情况中的截面图，在所述情况中，在图65中所示的盖板25沉积在如图63所示 的生物芯片基底上。分配到开口 27中的样品溶液可以填满孔41a。此后，样品溶液流过凹 槽300，依次填满孔41b-41i。因此，类似于第三实施方式，如图63所示的生物芯片基底和 如图所示的盖板25使减少样品溶液的体积称为可能。
该申请基于并要求2004年7月8号提出的欧洲专利申请04291742. 7的优先权， 该专利申请的整个内容此处引入作为参考。工业适用性 正如由用于合成探针DNA的基底的描述所清楚的，在本发明的生物芯片基底中， 用于合成生物物质的反应区和非反应区之间的界限是相当地清楚。因此，用该基底制备的 生物芯片使稳定地和以高准确性检测待检测的生物物质成为可能。而且，在本发明基底的情况中，形成反应区的位点在制备基底的过程中通过显微 光蚀刻和腐蚀来形成。这增加了形成过程的自由度，并能够形成精细图案，因此，能够高密 度地形成反应区。而且，由于制备方法不需要包括用树脂滴填满底孔，然后进行失活处理的 的步骤，降低了整个生产成本。作为用于制备DNA芯片、RNA芯片、蛋白质芯片、抗体芯片、糖链固定芯片、生物反 应器等的基底，该生物芯片基底具有大的工业价值。
权利要求
一种生物芯片基底，其包括具有羟基化表面的第一层；以及布置在第一层上的第二层，其中在所述第二层中勾画许多抵达所述第一层的孔，其中在所述第二层中勾画所配置的连接孔的许多凹槽，所述凹槽的每个深度浅于所述多个孔的每个孔深度，并且所述生物芯片基底还包括布置在所述第二层上的盖板。
2.根据权利要求1所述的基底，其中，所述第一层比所述第二层具有更高的亲水性。
3.根据权利要求1所述的基底，其中，所述第一层含有二氧化硅。
4.根据权利要求1所述的基底，其中，所述第二层含有结晶硅。
5.根据权利要求所述的基底，其中，所述第二层含有树脂。
6.根据权利要求1所述的基底，其中，该基底进一步地包括具有许多探针生物分子的 生物分子层，所述探针生物分子与引入在第一层上的许多羟基连接。
7.根据权利要求1所述的基底，其中，每个探针生物分子和每个羟基基团通过硅烷偶 联剂连接。
8.根据权利要求1所述的基底，其中，每个探针生物分子含有脱氧核糖核酸。
9.根据权利要求1所述的基底，其中，每个探针生物分子含有核糖核酸。
10.根据权利要求1所述的基底，其中，每个探针生物分子含有肽。
11.根据权利要求1所述的基底，其中，每个探针生物分子含有蛋白质。
全文摘要
本发明涉及一种生物芯片基底以及制造生物芯片基底的方法，该生物芯片基底包括具有羟基化表面的第一层以及布置在第一层上的第二层，其中在所述第二层中勾画许多抵达所述第一层的孔，在所述第二层中勾画所配置的连接孔的许多凹槽，所述凹槽的每个深度浅于所述多个孔的每个孔深度，并且所述生物芯片基底还包括布置在所述第二层上的盖板。
文档编号B01L3/00GK101884899SQ201010220809
公开日2010年11月17日 申请日期2004年12月16日 优先权日2004年7月8日
发明者五所尾康博, 小原大辅, 山崎信介, 弗朗索瓦斯·维内, 石川尚弘, 黑岩孝朗 申请人:株式会社山武