分析方法

专利名称：分析方法
技术领域：
本发明涉及分析方法(例如分析样品中的一种或多种被分析物)。
背景技术：
可以进行分析以确定样品中一种或多种被分析物的存在。阵列可用于对样品进行多重分析(例如对于多种不同被分析物中的每种进行分析)。典型的阵列包括具有多个空间分隔开的测试区的基质，每个测试区具有不同的探针化合物，例如多核苷酸、抗体或蛋白。在使用中，将阵列与样品接触，然后样品与阵列的位点相互作用。对于每个位点来说，相互作用可以包括例如相应的被分析物与位点的探针化合物的结合，和/或相应的被分析物与探针化合物之间的化学反应。反应产生可检测的产物(例如沉淀)。相互作用的存在和程度取决于样品中是否存在相应的被分析物。典型情况下，相互作用通过光学方法检测(例如通过荧光)。例如，可以使用成像检测器(例如CCD)进行光学检测，成像检测器在至少一个(例如两个)维度上具有多个彼此分隔开的光敏元件(例如像素)。每个光敏元件被定位，以接收来自基质的不同空间位置的光。因此，由多个光敏元件同时检测到的光可以组合起来，形成基质的至少一个(例如两个)维度上的图像数据。可以对图像数据进行评估，以确定阵列的多个位点上相互作用的存在和/或程度。

发明内容
本发明涉及分析方法(例如分析样品中的多种被分析物)。在一种情况下，方法包括:
将空间分隔的测试区的阵列与液体样品相接触，测试区布置在微流体装置的第一基质的内表面与第二基质的内表面之间，至少一个基质是挠性的，每个测试区含有探针化合物，探针化合物被构造用于参与靶被分析物的分析。在对应于测试区的位置减小第一和第二基质的内表面之间的距离，以及
在相应位置处内表面之间的距离被减小的多个测试区中的每个测试区上，连续地光学测定相互作用的存在，每个测试区上的相互作用指示了样品中靶被分析物的存在。方法可以进一步包括，对于多个测试区中的每个，根据光学测定的相互作用确定相应被分析物的存在。对于至少某些测试区中的每个来说，多个测试区的每个上的相互作用，可以是被分析物与测试区的探针化合物之间的结合反应。光学测定可以包 括使用零阶检测器检测来自每个测试区的光。使用零阶检测器检测来自每个测试区的光，可以基本上由使用零阶检测器检测光构成。对于第一和第二基质的内表面之间的距离被减小的多个位置中的每个位置来说，方法可以进一步包括在测试区进行光学测定的步骤之后，随后增加内表面之间的距离。减小距离可以包括在对应于测试区的位置连续地减小第一和第二基质的内表面之间的距离。在该实施方案中，对于第一和第二基质的内表面之间的距离被减小的多个位置中的每个位置来说，方法可以进一步包括在测试区光学测定结合的步骤之后，随后增加内表面之间的距离。光学测定可以包括连续地检测在相应位置处内表面之间的距离被减小的多个测试区中的每个上的相互作用。在一个实施方案中，光学检测包括同时检测来自不超过N个测试区的光，其中N彡5，或N彡3，或N=l。或者，光学检测包括使用零阶检测器检测来自每个测试区的光。使用零阶检测器检测来自每个测试区的光，可以基本上由使用零阶检测器检测光构成。光学检测可以包括将微流体装置相对于用于进行光学测定的光学检测器的光学检测区进行平移。减小距离包括将微流体装置相对于对微流体装置施加压力的元件进行平移。将微流体装置相对于元件平移可以包括旋转元件的至少一部分。每个测试区可以是细长的，并限定了长轴。此外，微流体装置的平移可以包括沿着与多个测试区中的每个的长轴大体垂直的平移轴平移装置。例如，平移轴与多个测试区的长轴是垂直的，偏离在10°或以下，或甚至在5°或以下。此外，平移轴与大多数或甚至所有测试区的长轴可以是大体垂直的。在平移的步骤中，方法可以进一步包括读取微流体装置的参考码中包含的信息，并根据读取的信息确定多个测试区中的每个的性质。对于多个测试区中的每个来说，测定可以包括测定指示测试区何时位于用于进行光学检测的光学检测器的检测区中的值。此外，测定可以包括测定微流体装置的测试区的生理化学性质。例如，生理化学性质指示可以通过多个测试区中的每个测定的被分析物。此夕卜，测定可以包括测定在使用前储存在微流体装置中的反应物的身份。沿着测试区的长轴的长度与沿着垂直维度上的宽度的比率，可以为至少2.5或甚至至少5。在接触步骤后，不用首先将测试区与不含样品的液体相接触，就可以进行光学检测步骤。光学测定可以包括激发并检测来自检测区的荧光。在另一种情况下，方法包括:
将空间分隔的测试区的阵列与样品相接触，测试区布置在第一和第二表面之间，每个测试区含有探针化合物，探针化合物被构造用于参与相应被分析物的分析。在对应于测试区的位置减小内表面之间的距离，以及
在相应位置处内表面之间的距离被减小的多·个测试区中的每个测试区上，连续地光学测定分析的结果。对于多个测试区中的每个来说，方法可以进一步包括根据分析的结果确定相应被分析物的存在。对于至少某些测试区中的每个来说，分析的结果可以指示被分析物与测试区的探针化合物之间的结合反应。光学测定可以包括使用零阶检测器检测来自每个测试区的光。使用零阶检测器检测来自每个测试区的光，可以基本上由使用零阶检测器检测光构成。对于内表面之间的距离被减小的多个位置中的每个来说，方法可以进一步包括在测试区进行光学测定的步骤之后，随后增加内表面之间的距离。减小距离可以包括在对应于测试区的位置连续地减小内表面之间的距离。在另一种情况下，系统包含:
微流体装置读数器，被构造用于接收微流体装置，微流体装置含有空间分隔的测试区的阵列，测试区布置在微流体装置的第一基质的内表面与第二基质的内表面之间，至少一个基质是挠性的，每个测试区含有探针化合物，探针化合物被构造用于参与靶被分析物的分析，
光学检测器，被构造用于当至少一个测试区位于微流体装置的检测区内时，检测来自至少一个检测区的光，
平移器，被构造用于将微流体装置和光学检测器的检测区中的至少一个相对于彼此进行平移，
挤压器，被构造用于在对应于光学装置的检测区的位置上减小第一和第二基质的内表面之间的距离，
处理器，被构造用于接收来自光学检测器的信号，信号指示了从测试区检测到的光。系统可以被构造用于连续地光学检测来自不超过N个测试区的光，其中N < 5，或N 彡 3，或 N=I。检测器可以是荧光检测器。在另一种情况下，分析装置含有第一和第二基质，它们限定了其间的通道，至少一个基质是挠性的，通道含有空间分隔开的测试区的阵列，每个测试区含有探针化合物，探针化合物被构造用于参与靶被分析物的分析。在另一种情况下，制造的物件包括:
基质，以及
多个细长的测试区，每个测试区含有相应的探针化合物，探针化合物被构造用于参与靶被分析物的分析，每个测试区限定了长轴以及与它垂直的宽度，测试区的长轴大体上是平行的。在另一种情况下，方法包括:
将液体样品导入毛细管的孔，以及
通过降低作用在液体样品的液体样品-气体界面上的压力，将至少一部分液体样品导入微流体装置的微流体网络中。在将液体样品导入毛细管的孔的步骤之后，方法可以进一步包括将毛细管与微流体装置相连，液体样品保留在毛细管中。降低压力可以通过挤压至少一部分微流体网络以从其中排出气体，然后降低至少一部分微流体网络的压力来进行。微流体网络可以至少部分由大体上为平面的第一和第二基质所限定，并位于它们之间，至少一种基质在施加外部压力挤压至少一部分微流体网络后是可变形的，并且该至少一种基质在释放外部压力使得至少一部分微流体网络降压后，倾向于恢复至其原来的位置。此外，微流体网络可以至少一部分由微流体通道所限定，该微流体通道包括入口和与入口流体连通的检测区，以及与检测区流体连通的微流体流通路径，其中微流体流通路径具有壁，它在施加外部压力挤压至少一部分微流体流通路径后是至少可部分变形的，并且在释放外部压力使得至少一部分微流体流通路径降压后，壁倾向于恢复至其原来的位置。方法还可以包括将液体样品与一种或多种反应物在微流体网络中混合，以形成混合物。混合物可以包含至少90%被导入到微流体网络中的液体样品。一种或多种反应物包括可检测标记物，它与样品反应，形成了包含标记物和样品中存在的被分析物的复合物。方法还可以包括对指示了液体样品的一部分中存在的复合物的量的信号进行光学检测，该一部分样品存在于微流体装置的检测区中。方法还可以包括从检测区排出一部分液体样品，并将不同部分液体样品导入检测区，并对指示了该不同部分样品中存在的复合物的量的信号进行光学检测。排出一部分并导入不同部分，可以通过挤压至少一部分微流体网络来进行，被挤压的部分沿着网络至少部分偏离检测区。挤压至少一部分可以包括挤压第一部分微流体网络，不用首先完全释放这种压力，将挤压的位点沿着微流体网络移动足以进行排出和导入步骤的量。方法可以进一步包括不用首先完全释放微流体网络的压力就对信号进行光学检测，该信号指示了不同部分样品中存在的复合物的量。在将液体样品导入毛细管的孔和将至少一部分液体样品导入微流体网络的步骤之间，方法还可以包括制止液体样品流出毛细管的步骤。制止液体样品流出毛细管可以包括增加作用于液体样品-气体界面上的压力。在某些实施方案中，微流体网络不支持液体样品的毛细管流动。由第一和第二基质中的至少一个限定的微流体网络的内表面，可以是疏水的。被分析物可以是颗粒，例如细胞。方法还可以包括将微流体装置和光学检测器中的至少一个相对于彼此进行移动，然后检测指示了不同部分液体样品中存在的复合物的量的光学信号。
毛细管可以是首尾相连的毛细管，含有第一个和第二个开口端，毛细管的孔构成了总体积V，导入至少一部分液体样品的步骤包括将至少90%的液体样品导入微流体网络。在另一种情况下，方法包括:
将液体样品导入布置在微流体装置的第一基质的内表面与第二基质的内表面之间的微流体网络，至少一个基质是挠性的，液体样品含有多种颗粒，
通过在微流体网络的多个位置连续地减少第一和第二基质的内表面之间的距离，形成了含有至少一部分液体样品和光学标记物的混合物，
形成多种复合物，每种复合物包含多种颗粒中的一种和至少一种光学标记物，以及 检测在一部分混合物中存在的复合物。方法还可以包括检测混合物的多个不同部分的每个部分中存在的复合物。多个不同部分的总体积可以为导入到微流体装置的液体样品的体积的至少90%。方法还可以包括将总体积为V的液体样品导入微流体装置，其中混合物的总体积为体积V的至少90%。方法还可以包括检测在至少90%的混合物总体积中存在的复合物。颗粒可以是细胞。光学标记物可以是荧光标记物。在另一种情况下，方法包括:
将总体积为V的液体样品导入布置在微流体装置的第一基质的内表面与第二基质的内表面之间的微流体网络，至少一个基质是挠性的，液体样品含有多种颗粒，
在微流体网络中形成混合物，混合物含有体积V的液体样品和光学标记物的至少大约
90%,
形成多种复合物，每种复合物包含多种颗粒中的一种和至少一种光学标记物，以及 检测在一部分混合物中存在的复合物。 混合物可以包含体积V的液体样品的至少大约95%。方法还可以包括检测混合物的多个不同部分的每个中存在的复合物。多个不同部分的总体积可以为导入到微流体装置的液体样品的体积的至少90%。在另一种情况下，用于检测被分析物的装置包含:具有微流体通道的盒(cartridge)，该微流体通道包括入口和与入口流体连通的检测区；具有至少部分可变形的壁并与通道的检测区流体连通的微流体流通路径；以及具有密封元件的盖子，它被构造用于密封入口，并形成包括入口、微流体通道和微流体流通路径的流体回路。装置的盖子和盒可以被构造成在形成流体回路后不可逆地关闭。可选地，盖子可以挠性连接在盒上。此外，盖子和盒可以被构造成在第一个相对位置咬合使得盖子可以除去，而在第二个相对位置咬合，使得盖子在形成流体回路后不可逆地关闭。检测区可以被盒的至少一个表面和盖子的至少一个表面分界。盖子可以包括覆盖在检测区上的透明薄膜。此外，盖子可以粘附到盒上。在另一种情况下，用于检测被分析物的装置包含具有微流体通道的盒，该微流体通道包括在内表面上具有抗凝剂的毛细管入口，包含反应物的腔室，以及与入口流体连通的检测区；具有至少部分可变形的壁并与通道的检测区流体连通的微流体流通路径；以及具有密封元件的盖子，它被构造用于密封入口，并形成包括入口、微流体通道和微流体流通路径的流体回路。在另一种情况下，荧光检测器包含光源；获得10°或以上的立体角的聚光镜；以及获得10°或以上的立体角，并被构造用于为微观物体成像的物镜。聚光镜和/或物镜可以获得10°到15°的立体角，例如12°到14°，例如13.5°。荧光检测器还可以包括孔隙。孔隙的构造使得立体角可以为10°或以上(例如10。到 15。，或 12。到 14。，或 13.5° )。
荧光检测器还可以包含至少一个滤光片。滤光片可以根据预定的发射波长设置进行选择。例如，可以根据用于标记盒中的反应物的染料的发射波长，来选择一个滤光片用于透过具有一种特定波长的光，以及选择另一个滤光片用于透过具有不同特定波长的光。在另一种情况下，用于检测被分析物的系统包含:
盒，具有:包括入口和与入口流体连通的检测区的微流体通道；具有至少部分可变形的壁并与通道的检测区流体连通的微流体流通路径；以及具有密封元件的盖子，它被构造用于密封入口，并形成包括入口、微流体通道和微流体流通路径的流体回路；以及包含光源的荧光检测器；获得10°或以上的立体角的聚光镜；以及获得10°或以上的立体角的物镜。
荧光检测器可以包括相机。此外，荧光检测器可以包括一种或多种可选择的发射滤光片。在另一种情况下，在液体样品中检测被分析物的方法包括:
将液体样品导入微流体通道，从而形成被通道封闭并被运输流体在第一个末端分界的连续液体段；
形成流体回路，使得运输流体为液体段的第一个和第二个末端之间提供流体连通；以
及
经运输流体对液体段的第一个和第二个末端施加不同的压力。在另一种情况下，在液体样品中检测被分析物的方法包括:
将液体样品导入微流体通道，从而形成被通道封闭并被运输流体在第一个末端分界的连续液体段，液体样品含有多种颗粒，
形成流体回路，使得运输流体为液体段的第一个和第二个末端之间提供流体连通，
通过经运输流体对液体段的第一个和第二个末端施加不同的压力，形成含有至少一部分液体样品和光学标记物的混合物，
形成多种复合物，每种复合物含有多种颗粒中的一种以及至少一种光学标记物，以及 检测在混合物的一部分中存在的复合物。接下来，将解释装置和方法(例如，用于检测被分析物的装置、系统和方法)的其它示例性实施方案。流体回路的一部分可以由可弹性变形的壁构成。向液体段的第一个和第二个末端施加不同的压力可以包括挤压可弹性变形的壁。液体样品可以根据待测定的被分析物按照需要进行选择。示例性的样品包括水，水溶液，有机溶液，无机溶液，人类和其它动物的体液，例如尿液、痰液、唾液、脑脊液、全血和源自血的材料例如血浆和血清。待测定的被分析物可以按照需要进行选择。例如，被分析物可以与医药(例如诊断学)、研究(例如药物发现)、工业(例如水或食品质量监测)或法医学相关。示例性的待测定被分析物包括生理学状况例如疾病的标志物(例如诊断标志物或预测标志物)。这些标志物包括心脏标志物(例如利尿钠肽和肌钙蛋白家族的成员)、癌症标志物(例如核基质蛋白)、遗传标志物(例如多核苷酸)、败血病标志物、神经学标志物，以及指示病原状况的标志物。被分析物可以指示病原体(例如细菌、病毒或真菌)的存在。在典型的实施方案中，一种或多种被分析物包括颗粒，例如病毒、细菌、细胞、真菌或孢子。例如，可以检测在国际专利申请PCT/EP2006/068153 (以其全文以为参考)中描述的任何颗粒。天然存在的颗粒的例子包括尤其是原核细胞(例如细菌细胞，例如大肠埃希氏杆菌coli )或枯草芽孢杆菌真核细胞(例如酵母细胞，例如酿酒酵母焊ces cerevisiae),昆虫细胞例如Sf9或High 5细胞,永生化的细胞株例如HeLa或Cos细胞，以及初级细胞例如哺乳动物血细胞)或病毒(例如噬菌体粒子，例如M13或T7噬菌体)。在一个实施方案中，颗粒可以是细胞。标记物或探针化合物或捕获分子可以根据待测定的被分析物按照需要进行选择。用于测定被分析物的存在的适合的标记物或探针化合物描述在2006年9月22日提交的美国临时申请60/826，678中，在此以其全文引为参考。标记物或捕获分子或探针或探针分子或分子探针，被理解为是指由于特定的特征性结合行为或特定的反应性，用于检测其它分子的分子或复合物。示例性的探针化合物包括生物聚合物，例如肽、蛋白、抗原、抗体、碳水化合物、核酸，和/或其类似物和/或上述生物聚合物的混合聚合物。可以按照本发明使用的可检测的标志物或标记物，包括在化学、物理或酶反应中直接或间接产生可检测的化合物或信号的任何化合物。优选情况下，标记物可以从尤其是酶标记物、有色标记物、荧光标记物、生色标记物、发光标记物、放射性标记物、半抗原、生物素、金属复合物、金属和胶体金中选择，其中荧光标记物是特别优选的。所有这些类型的标记物在本技术领域中都是公知的。由这样的标记物介导的物理反应的例子是荧光的发射。因此，光学标记物可以是荧光标记物。方法还可以包括用第一光学标记物和第二光学标记物抗体标记被分析物，其中第一和第二光学标记物是不同的。第一和第二光学标记物可以是具有不同的发射波长的第一和第二荧光标记物。标记物可以是抗体。例如，方法还可以包括用第一光学标记物荧光抗体和第二荧光抗体标记被分析物，其中第一和第二荧光抗体具有不同的发射波长。检测被分析物可以包括在第一荧光抗体的发射波长处记录被分析物的第一个图像；在第二荧光抗体的发射波长处记录被分析物的第二个图像；以及比较第一和第二个图像。方法还可以包括检测混合物的多个部分的每个中存在的复合物。例如，在微流体装置的每个混合物中，颗粒、如果存在的话，可以与可检测标记物结合，形成复合物。在经过适合的温育期以允许复合物形成后，检测复合物的存在。复合物检测的例子描述在国际专利申请PCT/EP2006/068153中，在此以其全文引为参考。多个不同部分的总体积可以为导入到微流体装置中的液体样品的体积的至少90%。
方法还可以包括将总体积为V的液体样品导入微流体装置，其中混合物的总体积可以为体积V的至少大约90%或至少大约95%。方法还可以包括检测混合物总体积的至少10%中存在的复合物，例如混合物总体积的10%到90%、15%到50%或20%到30%中存在的复合物。微流体通道可以包含入口和与入口流体连通的检测区。此外，微流体通道可以是微流体装置的微流体通道。在将液体样品导入微流体通道之前，方法还可以包括将液体样品导入毛细管的孔中。毛细管典型情况下是标准毛细管(即首尾相接的毛细管，例如塑料毛细管)。首尾相接的毛细管包含内部孔和各在孔的一端的第一和第二个开口。毛细管的孔可以含有凝结抑制剂，例如肝素。例如，毛细管可以用抗凝剂例如肝素涂层。一般来说，毛细管的孔被构造成含有总体积为V的液体样品。体积V —般为大约25微升或以下(例如大约20微升或以下，大约15微升或以下，大约10微升或以下，大约5微升或以下)。一般来说，体积V是大约I微升或以上(例如大约3或5或7.5微升或以上)。在将液体样品导入毛细管的孔和将液体样品导入微流体通道的步骤之间，方法还可以包括将毛细管与微流体装置相连，液体样品保留在毛细管中。方法还可以包括对能够指示液体样品的一部分中存在的复合物的量的信号进行光学检测，该部分样品存在于检测区或微流体装置的检测区中。在某些实施方案中，毛细管的出口开向具有预定体积的反应腔室，例如大约5 μ 、 ο μ 或20 μ 。在某些实施方案中，反应腔室包含反应物颗粒。反应物颗粒可以包括标记物，例如用荧光染料标记的、并与样品中待检测的抗原具有亲和性的抗体。例如，为了检测液体样品中辅助性τ细胞的数量，反应物颗粒可以包含用第一荧光染料(例如藻红蛋白)标记的抗⑶4+抗体、用第二荧光染料(例如藻红蛋白_Cy5)标记的抗⑶3+抗体、盐和稳定化反应物等。在某些实施方案中，第一个区域的内表面覆盖有加工样品所必需的反应物。用于在液体样品中检测颗粒例如细胞的示例性分析方法，描述在例如WO 2007/051861中，在此以其全文引为参考。正如在WO 2007/051861中描述的，检测可以在微流体通道内发生。因此，微流体通道是至少部分透光的。例如，微流体通道可以由至少部分可透光的层覆盖。液体样品的导入可以通过挤压可弹性变形的壁来进行。挤压可弹性变形的壁，可以包括挤压第一部分流体回路，并且不用首先完全释放这种压力，将挤压的位点沿着流体回路移动足以进行排出和导入步骤的量。方法还可以包括首先完全释放压力，再进行指示了不同部分中存在的复合物的量的信号的光学检测的步骤。
在将液体样品导入毛细管的孔和将至少一部分液体样品导入微流体通道的步骤之间，方法还可以包括制止液体样品流出毛细管。在某些实施方案中，微流体通道的检测区不支持液体样品的毛细管流动。此外，微流体通道的内表面的至少一部分可以是疏水的。方法还可以包括将微流体装置和光学检测器中的至少一个相对于彼此进行移动，然后对指示了液体样品的不同部分中存在的复合物的量的光学信号进行检测。

附图简述

图1描述了微流体装置。图2是图1的微流体装置的侧视图。图3a显示了图1的微流体装置的两个测试区的顶视图。图3b到3g描述了用于形成图3a的测试区的方法。图4和5是被构造用于操作图1的微流体装置的系统的侧视图；图5仅仅是部分侧视图。图6显示了荧光强度数据作为沿着图1的微流体装置的通道的位置的函数。图7显示了微流体装置。图8a和8b各为图7的微流体装置的两个测试区的顶视图。图9显示了微流体装置。图1Oa是图9的微流体装置的横截面侧视图，也显示了含有液体样品材料的毛细管。图1Ob显示了图1Oa的微流体装置，其中毛细管已经与微流体装置的入口相连，液体样品还没有进入微流体装置的微流体网络。图1Oc显示了图1Oc的微流体装置，其中一部分液体样品已经从样品毛细管抽取到微流体装置的微流体网络中。图1Od显示了图1Oc的微流体装置，其中从样品毛细管抽取液体样品到微流体装置的微流体网络的步骤已经完成。图1Oe显示了图1Od的微流体装置，其中一部分液体样品沿着微流体网络的长度移动了距离Δ1。图1Of显示了图1Oe的微流体装置，以及在一部分液体样品中存在的被分析物的检测。图11显示了用于操作图1、7和9任何一个的微流体装置的操作系统。操作系统可以包含图4和5的操作系统的任何或所有特点。图12A-12D显示了流体回路的示意图。图13A-13B显示了具有流体回路的盒的内部剖视图。图14A-14B显示了荧光检测器的内部剖视图。图15显示了检测器的光径的设计图。图16A-16B显示了使用荧光检测器进行细胞计数分析的图解。图17显示了使用荧光检测器从细胞计数分析得到的两张图像的叠加。详细描沭
用于分析样品以确定多种被分析物的存在(例如定性地和/或定量地)的方法，包括了将样品导入微流体装置的通道。微流体装置可以具有单通道或多通道，这取决于分析方法的设计和复杂性。在某些实施方案中，通道可以由装置的第一和第二基质的相对内表面限定。一般来说，用于进行分析的装置，可以包括被至少一个可变形表面界定的微流体流通路径。例如，微流体流通路径被限定在装置的第一和第二基质的相对的内表面之间，第二基质与第一基质相比，可以是相对挠性的。在另一个例子中，微流体流通路径的一部分可以包含可挤压的区域。可挤压区域可以是流体回路的长度，沿着该长度，回路的至少一个壁是可挤压的或可变形的。当对可变形表面施加局部压力时，表面变形。在足够的力下，可变形的表面可以被挤压到中断微流体流通路径的程度。相对于微流体流通路径移动表面变形的位置，可以移动微流体流通路径中的液体，特别是当可变形表面被挤压到中断微流体流通路径的程度时。在某些实施方案中，第二基质与第一基质相比可以相对有伸缩性。多个测试区可以沿着通道空间分隔开。每个测试区包含固定化的探针化合物，它们被构造用于参与相应被分析物的分析。典型情况下，每个分析包括探针化合物与相应被分析物或包含被分析物和反应物(例如光学标记物)的相应复合物的相互作用。为了确定每个测试区的分析结果，可以对第二基质的外表面施加局部压力。压力引起第一和第二基质的内表面相隔的距离的局部减小。距离局部减小的位置与通道内限定的光学检测区重叠。当距离减小时，流动物质(例如样品、未结合的光学探针和/或反应物)在检测区从基质之间被排出。将微流体装置平移，使得测试区连续地通过检测区。对于每个测试区来说，当测试区经过检测区时，光学测定(例如通过荧光)分析的结果。根据分析结果，确定了每种被分析物的存在(例如定量地和/或定性地)。典型情况下，在将测试区与样品接触后，不用首先将测试区与洗涤溶液接触，就可以测定分析结果。待测定的被分析物可以根据需要进行选择。例如，被分析物可以与医药(例如诊断学)、研究(例如药物发现)、工业(例如水或食品质量监测)或法医学相关。示例性的待测定被分析物包括生理学状况例如疾病的标志物(例如诊断标志物或预测标志物)。这些标志物包括心脏标志物(例如利尿钠肽和肌钙蛋白家族的成员)、癌症标志物(例如核基质蛋白)、遗传标志物(例如多核苷酸)、败血病标志物、神经学标志物，以及指示病原状况的标志物。被分析物可以指示病原体(例 如细菌、病毒或真菌)的存在。测试区的探针化合物可以根据待测定的被分析物按照需要进行选择。示例性的探针化合物包括多核苷酸、抗体和蛋白。样品液体可以根据待测定的被分析物按照需要进行选择。示例性的样品包括水，水溶液，有机溶液，无机溶液，人类和其它动物的体液，例如尿液、痰液、唾液、脑脊液、全血和源自血的材料例如血浆和血清。参考图1、2和4,微流体装置100和操作系统500可用于对样品进行分析，以确定多种被分析物的存在(例如定性地和/或定量地)。微流体装置100包含第一和第二基质102、104，限定了微流体网络107，该网络包括入口 106，以及与其连通的通道110和储液器108。在通道110中布置有多个空间分隔开的测试区112i。每个测试区112i含有一种或多种反应物(例如探针化合物)，被构造用于参与被分析物的分析。通道110还包含参比区117。装置100还包含参比图样114，它含有多个标记116j。参比图样114提供了与测试区112 的空间性质有关的信息。操作系统500包括外壳502，检测器504，参比图样读取器506，与检测器504和图样读取器508相连的处理器。检测器504是检测样品与测试区112i之间的相互作用的光学荧光检测器。检测器504包含光源550 (例如发光二极管或激光二极管)，以及零阶光敏检测器552 (例如光电倍增管或光电二极管,例如雪崩光电二极管)。在系统500运行过程中，参比图样读取器506读取装置100的参比图样114。
现在，我们更详细地讨论微流体装置100和系统500。典型情况下，第一基质102,相对于用于激发和检测来自突光标记物的突光的光的波长来说，是透光的(例如透明的)。例如，第一基质102可以透过至少大约75% (例如至少大约85%,至少大约90%)的、大约350 nm到大约800 nm之间的至少一种波长的入射光。第一基质102可以由例如聚合物、玻璃或二氧化硅形成。第二基质104典型地由可弯曲的或挠性的材料(例如弹性聚合物)形成。第一基质102可以比第二基质104具有更低的挠性。例如，第一基质102可以是基本上刚性的(例如足够刚性以便于装置100的操作)。通道110是毛细管通道。施加到入口 106的样品113通过毛细作用力沿着通道110迁移。通道110沿着长轴al定向。储液器108包含排气口 111以阻止气体在样品顶上累积。典型情况下，每个测试区112i包含反应物(例如探针化合物)，被构造用于在存在被分析物的情况下提供可检测的相互作用。相互作用可以包括例如相应被分析物与测试位点的探针化合物的结合，和/或相应被分析物与探针化合物之间的化学反应。反应产生可检测的产物(例如沉淀)。示例性的探针化合物包括蛋白、抗体和多核苷酸。用于测定被分析物的存在的适合的探针化合物，描述在2006年9月22日提交的美国临时专利申请60/826，678中，以其全文引为参考。还参考图3a，每个测试区112i是细长的，具有长轴a2，其方向一般垂直于通道110的长轴al。典型情况下，沿着长轴a2的长度与沿着测试区112的垂直方向的宽度w的比率为至少2.5 (例如至少5)。沿着a2的长度典型为至少大约200 μ m (例如至少大约350微米)，典型为大约2000 μ m或以下(例如大约1000 μπι或以下，大约750 μπι或以下)。宽度w典型为至少大约25 μ m (例如至少大约50微米),典型为大约500 μ m或以下(例如大约250 μπι或以下，大约150 μπι或以下)。在示例性实施方案中，测试区112为大约500 μπι长和大约100 μπι宽。在图2中可以看到，沿着通道110，测试区112i与邻近的测试区被相隔距离d7。测试区112i之间的距离d7，将在下面与检测器504的检测区相关联进一步讨论。可以根据需要形成测试区112i。一般来说，反应物可以与第一基质接触。然后，将反应物和基质相对侧移，以形成细长的测试区。参考图3b_3g，用于形成测试区112i的方法包括将反应物从毛细管点样器400分发到第一基质102上。在图3b中，将一定量(例如大约2到8 nl之间，大约3到5 nl之间)含有一种或多种探针化合物的反应物溶液402导入毛细管点样器的毛细管的远端404。远端404典型情况下具有大约80到120 μ m之间的直径(例如大约100 μ m)。反应物溶液402和基质102最初相隔(例如不接触)距离dl。典型情况下，dl为至少大约250 μ m (例如大约500 μπι)。在图3c中，将顶端404和基质102带到较小的分隔距离d2，使得反应物溶液402与基质102的位置接触。在较小的分隔距离d2处，远端404靠近基质102的位置(例如接触上，使得d2为零)。将远端404和基质102在邻近的(例如接触的)位置以分隔距离d2维持一段时间(例如大约I秒或以下，大约0.5秒或以下，大约0.25秒或以下)。在某些实施方案中，远端402在邻近(例如接触的)位置维持的时间与零无法区分。在图3d中，将远端404和基质102移动到中间分隔距离d3，其中远端404和基质通过远端404的反应物溶液402保持连通。典型情况下，中间分隔距离d3为至少大约5 μπι(例如至少大约10 μπι，大约30 μπι或以下，大约25 μπι或以下)。在示例性实施方案中，中间分隔距离d3是大约20 μ m。在图3e中，将远端404和基质102在中间分隔距离d3维持一段温育时间，使得至少某些(例如至少大约10%，至少大约25%，至少大约40%)远端的反应物溶液402蒸发，使得反应物溶液402的仅仅剩余部分402’保留下来。通常，仅仅大约75%或者更少的(例如，大约50%或者更少)的反应溶液402蒸发，使得溶液402’保留下来。温育时间取决于溶液402的本质(例如探针化合物浓度和溶剂蒸汽压)和远端404的环境(例如相对湿度和温度)。典型的温育时间比远端和基质在邻近位置d2处保持的时间长(例如至少5倍长、至少10倍长、至少20倍长、至少35倍长)。示例性的温育时间是至少大约5秒(例如至少大约10秒，至少大约20秒，至少大约25秒)。在图3f中，在中间分隔距离d3的温育时间后，远端404和基质102中的至少一个相对于另一个侧向移动，用于将反应物溶液402’沿着长轴a2分配。在图3g中，在侧向移动完成时，远端402和基质102分开，使得它们不再通过反应物溶液相连。例如，可以将远端404和基质102返回到初始的分隔距离dl。可以重复方法(例如使用不同的反应物溶液)，以便分配到基质的多个位置中的每个处的细长测试区上。一般来说，远端和基质的垂直分隔距离可以通过相对于基质移动远端来改变。一般来说，远端和基质的侧向平移通过相对于远端平移基质来进行。示例性的反应物溶液、探针化合物和分配装置，描述在2006年9月22日提交的美国临时专利申请60/826，678中，在此以其全文引为参考。在图3a中可以看出，也可以参考图8a和8b，用于生产细长测试区112i的方法，与省略了远端和基质的侧向移动步骤的分配方法相比，提供了探针化合物的更均匀的分布。测试区112i包括第一部分119和第二部分121。第一部分119与第二部分121或不使用侧向移动步骤制备的测试区312i中相比，探针化合物的分布更加均匀。回到图1，参比区117不依赖于样品中任何被分析物的存在而产生了可以被检测器504检测的响应。参比区117典型情况下包含荧光介质(例如聚合物或固定化的荧光分子)。参比区117将在下面涉及系统500的操作时进一步讨论。参比图样114的标记116j被构造成可以被系统500的参比图样读取器506读取。标记116j由磁性材料(例如磁性墨水)构成。图样读取器506可以检测标记116j的存在。参比图样114将在下面涉及系统500的操作时进一步讨论。回到图4，操作系统500的外壳502包括用于接收装置100的开口 510，含有压辊516和支撑辊518、520的挤压系统，以及含有阻尼弹簧514的平移传动器512。当装置100被接收到外壳500中时，检测器504在通道110中限定了光学检测区524。在使用中，装置100相对于检测区524平移。测试区112i连续地进出检测区。检测器504连续地检测样品和连续的测试区112i之间的相互作用。检测器504也感应参比区117。参考图6，检测器504输出信号600，作为装置100所平移的距离(相对或绝对)的函数。信号600包括指示了参比区117的峰617和指示了在每个区112i的相互作用的峰612i。同时，图样读取器506输出了指示标记116i的信号602，作为装置100所平移的距离的函数。因为标记116i与测试区112i在空间上相关，处理器508可以确定检测区524何时与特定的检测区重合，即使测试区不显示信号(例如对于测试区112a来说，表现出的信号612a不能与零分辨开)。参比区117和相应的信号617可以交替使用，或与信号602组合使用，用于确定信号600的哪个区域对应于特定的测试区。接下来，我们讨论挤压系统。在使用中，挤压系统挤压装置100，以减小通道110中基质102、104之间的距离。当装置100被接收到外壳502中时，第一基质102的外表面132朝向支撑辊518、520，第二基质104的外表面134朝向挤压辊516。支撑辊518、520与挤压辊516之间的距离d4，小于装置100的厚度tl (图5)。因为第二基质104与第一基质102相比相对挠性，挤压辊516挤压第二基质104，引起第二基质104的内表面103与第一基质102的内表面105之间的距离d6的局部减小。在松弛状态下(例如未挤压状态)(图2)，距离d6典型为至少大约25 μ m (例如至少大约50 μπι,至少大约75 μπι)。在未挤压状态下,距离d6典型为大约500 μπι或以下(例如大约250 μ m或以下)。在距离局部减小的状态下(例如局部挤压状态)(图4中的测试区112e)，距离d6典型为大约15 μπι或以下(例如大约10 μπι或以下，大约5 μπι或以下，例如大约2.5 μ m或以下)。在被距离减小状态分开的表面之间进行的荧光检测的例子，描述在国际专利申请PCT/EP2005/004923的美国连续案中，在此以其全文弓I为参考。正如在图4和5中所见，挤压系统在通道110的仅仅一部分长度上减小通道110中的距离d8。典型情况下，距离d8比测试区112i相隔的距离d7长大约5倍或以下(例如长大约3倍或以下，大约长2倍或以下，大约同样长)。典型情况下，距离d7足够大，使得由检测器504限定的光学检测区524不能覆盖通道110中所有的测试区112i (例如5个或以下，3个或以下，2个或以下)。在示例性实施方案中，d7足够大，使得检测区524沿着通道110的长轴al的宽度不能同时接触超过3个(例如不超过2个，不超过I个)测试区112i。检测区524垂直于通道110的长轴al的宽度典型与测试区112i沿着其轴a2的长度大约相同或更小(例如不超过其75%，不超过其50%，不超过其30%)。在使用中，样品液体被施加到入口 106。毛细作用力将样品沿着通道110拉向储液器108。样品液体沿着通道110与测试区112i接触。样品中的被分析物与测试区中的探针化合物相互作用。在适当的温育时间后，将装置100插入外壳500，以压紧平移传动器512的弹簧514。在插入装置100的过程中，挤压辊516和支撑辊520是空间分隔的，使得装置100没有被挤压。一旦装置100完全插入后，检测区524的位置与参比区117大体重叠。挤压辊516局部挤压通道110 (图5)。当样品的被分析物与测试区112i之间的相互作用准备好用于测定时(例如在温育期后)，平移传动器512相对于检测器504的检测区524平移装置100 (图4)。测试区112 连续地通过检测区524，并被来自光源的光照射。挤压辊516的安置使得距离d6的局部减小在空间上对应于检测区524。因此，光检测器连续地检测来自测试区112i的光，其中每个测试区都在距离局部减小的状态(例如局部挤压的状态)(图4中的测试区112e)。从每个测试区产生的荧光被透镜收集，并被光检测器检测。持续进行距离d6的连续局部减小和光学测定，直到每个测试区都已经平移通过检测区524。

除了每个测试区的探针化合物和被分析物之外，在通道110中，在第二基质104的内表面103与第一基质102的内表面105之间还存在其它的物质。这样的物质的例子包括样品附随物和反应物(例如未结合的或未反应的光学探针)。这些物质典型地产生背景发射(例如荧光或散射光)，它们与样品和测试区112i的相互作用无关。背景发射的强度一般与对应于检测区524的位置处内表面之间剩余的这些物质的量成正比。但是，指示了每个测试区中的相互作用的光学信号的强度，在空间上位于该测试区附近。光检测器接收并检测了指示相互作用和背景发射的荧光。参考图9、IOa和11,微流体装置700和操作系统500’可用于分析样品，以确定一种或多种被分析物的存在(例如定性地和/或定量地)。在典型的实施方案中，一种或多种被分析物含有颗粒，例如病毒、细菌、细胞、真菌或孢子。例如，可以检测在国际专利申请PCT/EP2006/068153 (以其全文引为参考)中描述的任何颗粒。微流体装置700包括第一和第二基质702、704，它们限定了微流体网络707，该微流体网络包含入口 706和与其连通的多个通道710a、710b、710c，各具有相应的储液器708a、708b、708c。每个储液器包含反应物物质709a、709b、709c (例如探针化合物)，它们被构造用于参与被分析物的分析。装置700可以包含参比图样114，包含了多个标记116j(没有在图9、10a、11中显示)，它们可以与上面讨论的相同。操作系统500’包括外壳502’、检测器504’、参比图样读取器(未显示)，以及与检测器504’和图样读取器504相连的处理器。检测器504是检测含有被分析物(例如颗粒)与可检测标记物(例如光学标记物)的复合物的光学突光检测器。适合的标记物的例子描述在国际专利申请PCT/EP2006/068153中，在此以其全文引为参考。检测器504’包含光源550’(例如发光二极管或激光二极管)，以及光学检测器552’(例如一阶检测器，例如二极管阵列或多维检测器(例如成像检测器，例如电荷耦合检测器))。光学检测器典型地并空间选择性地检测来自微流体装置的每个通道中限定的相应检测区的光。现在，我们更详细地讨论微流体装置700和系统500’。典型情况下，第一基质702，对于用于激发和检测来自荧光标记物的荧光的光的波长来说，是透光的(例如透明的)。例如，第一基质702可以透过至少大约75% (例如至少大约85%,至少大约90%)的、大约350 nm到大约800 nm之间的至少一种波长的入射光。第一基质702可以由例如聚合物、玻璃或二氧化硅形成。第二基质704典型地由可弯曲的或挠性的材料(例如弹性聚合物)形成。第一基质702可以比第二基质704具有更低的挠性。例如，第一基质702可以是基本上刚性的(例如足够刚性以便于装置700的操作)。通道710a_710c典型情况下支持其中液体样品的移动，但典型情况下不是毛细管通道(即典型情况下液体不通过毛细管用力在装置700的通道中移动)。例如，通道的一个或多个内表面可以是疏水的，以抑制液体样品的毛细管移动。任选地或此外，通道的内部尺寸可能太大而不允许毛细作用力驱动其中样品的实质性移动。当然，在某些实施方案中，通道可以是毛细管通道。显示的装置700具有3个通道和相应的储液器，但是一般来说具有N个通道和相应的储液器，其中N至少为1，典型情况下小于20。典型情况下，每个储液器708i含有反应物735i (例如可检测标记物，例如光学标记物)，它们被构造用于在存在被分析物的情况下提供可检测的相互作用。相互作用可以包括例如相应被分析物与标记物的结合，从而形成含有被分析物和一种或多种标记物的复合物。这样的复合物的例子描述在国际专利申请PCT/EP2006/068153中(以其全文引为参考)。典型情况下，每种反应物被构造成允许检测不同的被分析物。参考图1Ob-1Of，装置700可以操作如下。将一定量液体样品738(例如生物学液体例如血液、唾液或尿液)导入毛细管736。毛细管736典型情况下是标准毛细管(例如首尾相接的毛细管，例如塑料毛细管)。首尾相接的毛细管包含内部孔和各在孔的一端的第一和第二个开口。毛细管可以用抗凝剂例如肝素涂层。适合的毛细管的例子包括20μ1肝素涂层的毛细管，可以从Kabe Labortechnik获得(Niirnbrecht-Elsenroth, Deutschland; http://www.kabe-labortechnik.de/index.php sprache=de&akt_seite=startseite_produkte.php)。一般来说,毛细管的孔被构造成含有总体积为V的液体样品。体积V —般为大约25微升或以下(例如大约20微升或以下，大约15微升或以下，大约10微升或以下)。一般来说，体积V是大约5微升或以上(例如大约7.5微升或以上)。正如在图1Ob中看到的，装置700的入口 706被构造成容纳毛细管736。典型情况下，在施加导入力之前，样品737保留在毛细管736中，不进入微流体装置 。正如在图1Oc中看到的，可以通过减小基质702、704的内表面之间的距离以减小微流体网络中的体积，来对样品737施加导入力。例如，图1Oc显示了沿着微流体网络的一部分移动的辊子。典型情况下，挤压导致相对的内表面互相接触。当通道的给定区域降压后，通道内的体积增加时，作用于液体样品737的内表面739上的气体压力的降低，迫使样品进入微流体网路。挤压和减压可以在辊子716沿着微流体网络的单一连续运动中进行，或者可以多个步骤连续进行，如同在蠕动形式中那样。正如在图1Od中看到的，基本上所有(例如至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、基本上所有)体积V的液体样品737被抽取到微流体网络中。在示例性实施方案中，体积V的至少90%被抽取到网络中。

微流体网络中的液体样品进入每个通道710i和储液器708i，并将反应物在每个储液器中移动，形成了混合物。典型情况下，混合物的形成帮助引起了液体样品在微流体网络中的牵连移动(bulk motion)。这种牵连移动典型情况下通过挤压和减压微流体装置以减小基质702、704之间的内部距离所引起。挤压和降压可以蠕动的方式，通过将辊子716和微流体装置700中的至少一个相对于彼此进行重复移动来进行。一般来说，在装置700的N个通道中通过混合反应物735i形成的混合物的总体积，包括了导入装置700的液体样品量的至少大约70% (例如至少大约80%，至少大约90%，至少大约95%，基本上所有)。在示例性的实施方案中，在装置700的N个通道中通过混合反应物735i形成的混合物的总体积，包括了导入装置700的液体样品量的至少大约90%。在微流体装置的每个混合物中，颗粒，如果存在的话，与可检测标记物混合，形成了复合物。在允许复合物形成的适当的温育期后，检测复合物的存在。每种反应物735i典型地被构造成允许检测不同的被分析物。复合物检测的例子描述在国际专利申请PCT/EP2006/068153中，以其全文引为参考。参考图1Of，检测典型地发生在装置中每种混合物的一部分中。一般来说，检测可以在每种混合物的多个不同部分中进行。例如，每种混合物的不同部分，可以通过在挤压状态下移动辊子716以便将一部分新鲜的混合物移动到每个检测区中，来移动通过检测区。这可以进行多次，以便可以对基本上所有(例如至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，基本上所有)的每种混合物进行检测。在该实施方案中，检测使用辊子716在挤压状态下进行。已经进行过检测的混合物进入毛细管736，它用作废液容器。在某些实施方案中，检测通过相对于光学检测器扫描装置700来进行，以便每次检测连续地包含不同部分的溶液。这可以进行多次，以便可以对基本上所有(例如至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，基本上所有)的每种混合物进行检测。在该实施方案中，检测使用辊子716在降压状态下进行。已经描述了用于进行分析的方法和装置。接下来将讨论其它实施方案的例子。尽管入口 106被描述为无障碍的开口，但其它构型也是可能的。例如，入口可以被构造成带有注射器接头(例如气密性接头)，用于连接注射器。可选地，入口可以构造成密封垫，样品可以通过它用针头导入。另一种选择，入口可以装有单向阀，允许样品导入但不能流出。另一种选择，入口可以构造成接收标准毛细管(例如首尾相接的毛细管，例如塑料毛细管)。毛细管可以用抗凝剂例如肝素涂层。适合的毛细管的例子包括20μ1肝素涂层的毛细管，可以从 Kabe Labortechnik 获得(Niirnbrecht-Elsenroth, Deutschland; http://www.kabe-labortechnik.de/index.php sprache=de&akt_seite=startseite_produkte.php) o尽管微流体装置被描述成通过毛细作用填充，但其它实施方案也可以使用。例如，可以对系统500进行设计，以便在将样品施加到入口之前减小微流体网络的体积。当样品加入时，内部体积增加，从而将样品抽入。这样的体积减小可以使用例如挤压辊516来实现。例如，微流体装置可以接收在外壳502中，使得平移传动器512的阻尼弹簧514处于挤压状态。挤压辊516的位置使得在对应于储液器108的位置挤压装置100。这种挤压减小了储液器108的内部体积。体积的减小与装置100中将接收的样品的体积大约同样大(例如大至少大约25%，大至少50%)。当储液器108在挤压状态下时，一定体积的样品被施加到装置100的入口 106。将挤压辊516从入口 106朝向装置100的相反末端137撤回。当辊子516从储液器108移开时，储液器压力降低，从而增加了微流体网络的内部体积。体积的增加产生了真空，将样品吸入到装置中。尽管描述了具有 开口毛细管通道的微流体装置，但其它实施方案也可以使用。例如，通道可以包含介质，介质沿着通道的至少一部分长度占据了通道的至少某些(例如大部分或所有)横截面。典型情况下，介质是其上可以固定化多种探针化合物的介质，以便限定相应的空间分隔的测试区(例如捕获体积)，每个测试区具有三维上布置的捕获位点。介质上的孔或洞使液体沿着通道渗透(例如通过毛细作用)。液体沿着通道的运动，可以由例如上面描述的在通道内产生真空来辅助或诱导。典型情况下，探针化合物固定在多孔介质上，沿着通道限定空间分隔的测试区。被分析物与测试区的探针化合物的相互作用，可以如对于装置100的测试区112i所述进行连续测定。因为每个测试区三维布置，因此减小通道的相对内表面之间的距离，就减小了测试区的固定探针化合物所占据的捕获体积。光学检测使用测试区在减小体积(即减小距离)的状态下进行。尽管测试区112i已经被显示为细长的，但是其它构造也可以使用。例如，参考图7，微流体装置300包含了多个测试区312i，每个具有通常为圆形的构型。除了形状的差异之外，测试区312i可以与装置100的测试区112i相同。除了测试区中的差异之外，装置100和300是相同的。尽管用于形成测试区112i的方法已经被描述为将远端404和基质102从初始的分隔距离dl (图3b)移动到邻近的分隔距离d2 (图3c)，并移动到中间的分隔距离d3 (图3d)，然后开始远端404和基质102的侧向移动(图3f)，但是也可以进行其它实施方案。例如，可以当远端404和基质102处于邻近分隔d2时，将远端404和基质102侧向移动。在该实施方案中，分隔d2典型地大于零。尽管形成测试区112i的方法已经被描述为包含了将远端404和基质102在中间分隔距离d3处维持一段温育时间，直到只有反应物溶液402的剩余部分402’保留的步骤，但也可以进行其它的实施方案。例如，远端404和基质102的侧向移动，可以在远端404和基质102从邻近分隔距离d2 (图3c)移动到分隔距离d3 (图3d)时立即开始。换句话说，温育时间可能与零不能分辨。作为另一个例子，在温育过程中，蒸发反应物溶液可以用将附加的反应物溶液导入毛细管末端来代替。因此，在温育过程中，在毛细管末端处反应物的总量增加。尽管用于形成测试区112i的方法已经被描述为包括在将远端404和基质102在分隔距离d3维持一段温育时间，但是也可以进行其它的实施方案。例如，在温育期间，分隔距离d3可以改变。例如，在温育期间，末端404可以相对于基质102侧向或垂直振动。任选地或另外，在侧向移动过程中，末端404可以相对于基质102侧向或垂直振动。这样的振动在温育或侧向移动过程中，可以增强探针分子向第一基质的运输。尽管用于形成测试区112i的方法已经被描述为使用了毛细管点样器，但是其它的点样器也可以使用。例如,材料可以从实心点样器(例如实心杆)点样。尽管用于形成测试区112i的方法已经被描述为将一定量的反应物溶液导入到毛细管上样器(图3b)的毛细管远端，并将末端和基质带到较小的分隔距离d2，以便反应物溶液402与基质102的位置相接触，但是也可以进行其它的实施方案。例如，可以仅仅在远端和基质被带到较小的分隔距离后(例如在远端与基质接触后)才将反应物溶液导入远端。
尽管已经描述了用于连续减小通道的内表面之间的距离的方法和微流体装置读取器，但是其它构造也是可能的。例如，微流体装置读取器可以被构造成同时沿着大多数(例如基本上所有或所有)通道减小内表面之间的距离。然后，读取器沿着通道平移检测器的检测区，使得不同的测试区被连续读取。尽管已经描述了具有第一种相对刚性的基质 和第二种相对挠性的基质的微流体装置，但其它的实施方案也可以使用。例如，限定通道的两个相对内表面的基质可以都是挠性的。在这样的实施方案中，光学检测器的一部分可以构成挤压系统的一部分。例如，微流体装置可以在挤压辊和检测器的光学元件之间平移。尽管参比图样已经被描述为提供了与微流体装置的测试区的空间性质有关的信息，但参比图样也可以提供附加的或可替换的信息。例如，参与图样可以提供与微流体装置的测试区的生理化学性质有关的信息。这样的性质包括了测试区被构造用于分析的被分析物。其它性质包括储存在装置上的反应物的身份和性质，以及装置的数据信息(例如产品有效期)。尽管已经描述了含有磁性标记的参比图样，但是其它标记也可以使用。例如，标记可以形成与周围的物质相比具有不同光学密度或反射率的区域。参比图样读取器是光学读取器，典型情况下被构造用于通过透射或反射读取标记。在其它实施方案中，第一基质可以包含例如通过注模形成的通道。通道具有显著大于其第二和第三维(即宽度和深度)的第一个维度(长度)。通道可以具有长方形、V形(三角形)、u形或其它形状的横截面。在某些实施方案中，沿着通道的长度，通道的横截面的形状和/或维度可以变化。第二基质可以通过粘合剂附着在第一基质上。第二基质可以由例如透明带形成。第二基质(例如带)可以具有机械刚性，使得与第二基质(例如带)的外表面的机械接触，基本上不使第二基质的内表面变形。在某些实施方案中，通道可以由管、导管、毛细管等的内表面限定。通道可以具有长方形、V形(三角形)或其它形状的横截面。在某些实施方案中，沿着通道的长度，通道的横截面的形状和/或维度可以变化。通道的一部分可以是透光的。在某些实施方案中，通道包含一种或多种参比和/或比对标记，例如被构造可以用分析所使用的检测系统检测的确定的结构或固定的分子。比对标记包括例如固定化的荧光珠、固定化的荧光聚合物、蛋白、核酸等。比对标记还可以包括物理结构例如微观结构等。装置可以被构造成在将样品导入通道后，形成流体回路。流体回路将液体样品封闭在无限循环中。当液体样品封闭在流体回路中时，液体样品的体积小于流体回路的总体积，流体回路中剩余的体积可以被运输流体占据。运输流体可以是与样品液体基本上不混溶的液体(例如借助亲水性/疏水性，或密度的差异)。运输流体可以是气体，例如空气。典型情况下，液体样品将在流体回路中作为连续的液段存在。流体回路的一部分包括可挤压的区域。可挤压的区域可以是一段流体回路，沿着它回路的至少一个壁是可挤压的或可变形的。当向可挤压区域施加局部压力时，壁变形。在足够的力下，壁可以被挤压到中断流体回路的程度。最通常情况下，流体回路将在预定的位置中断，在那里通道被填满运输流体。一旦流体回路被中断，流体回路中流体样品的位置,可以通过相对于流体回路的剩余部分移动中断点的位置来操纵。移动中断点，减少了中断点一侧的运输流体的体积，相应地增加了中断点另一侧的运输流体的体积。体积的变化导致液体样品两端(即液体样品和运输流体相会的地点)的压力差。液体样品作出响应，通过在流体回路中移动来使压力平衡。一个或多个测试区可以沿着通道空间分隔开。典型情况下，每个分析包括探针化合物与相应的被分析物、或与包含被分析物和反应物(例如光学标记物)的相应复合物的相
互作用。通道中样品的位置可以通过传动器或辊子来控制，它们可以被构造成对可挤压区域的一部分施加局部压力。将微流体装置相对于传动器或辊子平移，使得样品移动到通道中的目标位置。可选地，辊子可以移动，而装置保持静止。图12A显示了封闭状态下的流体回路10。流体回路10包括第一个区1、微流体通道2、第二个区3和入口 4。在封闭状态下，第二个区3与入口 4紧密相连。图12B显示了开放状态下并准备在入口 4接收液体样品5的流体回路10。液体样品5与入口 4接触后，毛细管作用将液体样品5吸入第一个区I。图12C-12D显示了已施加样品后封闭状态下的流体回路。辊子6位于第二个区3，使得第二个区或者处于未挤压状态(如图12C中)，或者处于挤压状态(如图12D中)。可以通过定位辊子6，使得第二个区3处于挤压状态，并且在维持挤压状态的同时，相对于第二个区3移动辊子6 (如图12D中的箭头所示)，来调整流体回路10中液体样品5的位置。因为流体回路是封闭的，棍子6的移动在棍子的两侧产生了压力差；压力差诱导了液体样品的移动，从而恢复相等的压力。流体回路可以被构造成在盒中工作。在某些实施例中，流体回路可以具有能够通过变形进行挤压的微流体流通路径、包含检测区的微流体通道、以及可以可逆地或不可逆地形成封闭流体回路的密封元件。图13A-13B显示了示例性的盒100的内部剖视图。盒100包含基质101，盖子102，以及包含第一个区103、导管108、通道105、第二个区104和入口 /密封连接件109的流体回路。通道105可以由至少部分可透光的层覆盖。第一个区103可以是例如毛细管，被选择用于容纳所需的样品体积(例如I μ 到20 μ ，2到10 μ ，或大约5 μι)。毛细管在其内表面上可以用抗凝剂涂层。毛细管的入口 109被构造用于接收样品106。在某些实施方案中，毛细管的出口开向反应腔室110，腔室具有预定的体积，例如大约5 μ 、10 PL或20 μ 。在某些实施方案中，反应腔室110包含反应物颗粒107。反应物颗粒可以包括用荧光染料标记的、并与样品中待检测的抗原具有亲和性的抗体。例如，为了检测液体样品中辅助T细胞的数量，反应物颗粒可以包含用第一荧光染料(例如藻红蛋白)标记的抗CD4+抗体、用第二荧光染料(例如藻红蛋白_Cy5)标记的抗⑶3+抗体、盐和稳定化反应物等。在某些实施方案中，第一个区域的内表面覆盖有加工样品所必需的反应物。用于在液体样品中检测颗粒例如细胞的示例性分析方法，描述在例如WO 2007/051861中，在此以其全文引为参考。与反应腔室110流体连通的导管108，将反应腔室与通道105的第一个末端相连。正如在WO2007/051861中描述的，检测可以在通道内发生。因此，通道是至少部分透光的。例如，通道105可以由至少部分可透光的层覆盖。通道105的第二个末端通过导管108与第二个区104的第一个末端相连。第二个区是至少部分挠性的，使得第二个区的内径可以减小到零。例如，第二个区可以是弹性硅酮管等。第二个区的第二个末端固定在盖子102中，盖子适合于施加到基质上并支撑第二个区。通过打开盖子，第一和第二个区之间的密封连接件109被打开，通过关闭盖子，第一和第二个区之间的密封连接件109被关闭。在运输条件下，装置可以被关闭，即第二个区在连接件109处与第一个区形成密封连接。可选地，装置可以在打开状态下运输。在某些实施方案中，装置包含(例如为了安全的目的)机械装置，它被构造用于阻止盒在首先关闭后打开。当盖子102中的密封元件与毛细管103的末端形成不透流体的连接时，连接件109是关闭的。在操作中，用户打开盖子，从而打开了第一个区的第一个末端`。用户将打开的第一个区的末端与样品液体、例如通过手指针刺产生的血滴相接触。因此，毛细管103充满样品。用户关闭盖子，从而关闭了第一和第二个区之间的连接件109。这时，流体回路在反应腔室、导管、通道和第二个区中包含连续的、预定体积的样品液体、反应物颗粒、以及连续体积的运输流体(例如空气)。用户将装置放置在被设计用于操作装置的机器中。机器包括被构造用于挤压第二个区的传动器、检测器和控制器。传动器挤压第二个区，在挤压点将其直径减小到零。当装置和传动器在处于挤压状态的同时相对彼此移动时，在样品体积的一端，运输流体中的压力将增加，同时在样品体积的另一端，压力将降低。样品体积将在流体回路中移动，直到样品体积每一端上的压力相等。通道105可以是疏水的，使得当不施加外力时样品将不移动到通道105中。在某些实施方案中，反应物颗粒107附近的壁也可以是疏水的。当使用亲水材料时，与疏水材料相比，反应物颗粒的长期稳定性将变坏。在一个实施方案中，传动器被固定在机器中，装置相对于工具移动，以进行挤压。正如在WO 2007/051861中描述的，传动器是例如辊子。装置可以在机器中移动，使得样品移动至反应腔室中，从而将反应物颗粒溶解在该腔室中。抗体将与样品中相应的抗原结合。根据样品的类型，抗原可以位于悬浮在样品液体中的颗粒上(例如在血液样品中细胞的表面上)。因为抗体是标记的(例如用荧光染料)，一旦与它们相应的抗原结合后，抗原也被标记。参见例如WO 2007/051861。通过相对机器在同样的方向上进一步移动装置，样品被移动到通道中。一旦通道被填满，检测就发生了。理想情况下，检测器是小的、廉价的、通用的；即除了本文描述的单一应用之外，它还适合于其它应用。检测器可以是荧光显微镜，优选为相对于盒来说具有非常小的外部尺寸和低的高度的荧光显微镜。检测器可以能够对尺寸彡5 Mffl的物体进行成像，并被构造用于检测由分析中使用的荧光染料所发射的波长的信号。光源可以是高功率LED，它发射的光在适合于激发分析中使用的荧光染料的光谱范围内。如果使用不同的染料，例如至少两种发射两种不同波长的光的染料，在至少两种不同波长的每种处，都可能进行检测。检测器可以包含聚焦机械装置和照相机。通常情况下，荧光显微术使用非常强的光源，因为具有几乎平行的光束，只有一小部分发射光被使用上(空间角 2° )。通过使用聚光镜和检测器透镜收集从光源发射的较大部分的光，可以使用功率较小的光源(例如LED)。荧光显微术传统上在光学保真性方面具有非常高的价值；就此而言，本领域教导了与使用聚光镜的高的空间角相背离。事实上，本领域倾向于教导使用相对重的、体积大的、复杂的光学系统来获得高的光学保真性。参考图14，示例性的检测器500包括主体501，它包括第一个光径502和第二个光径503。在某些例子中，每个光径可以独立地具有一般为圆柱的形状或其它适合的构型。第一个光径502代表激发光径；第二个光径503代表检测光径。第一个光径502将光源505和盒516连接。光源505可以是高功率LED (例如Platinum Dragon LED (Osram)),具有455 nm、470 nm和 528 nm 的发射波长,视角为 120。
(朗伯发射器)。当使用荧光染料时，光源按照在分析中使用的荧光染料的激发波长进行选择。例如，当使用藻红蛋白 和藻红蛋白_Cy5时,选择发射具有大约520 nm波长的光的光源，当使用藻红蛋白和PerCP时，选择发射大约480 nm的光的光源。聚光镜506(例如由topaz制造，折射率为1.533)将LED发射的光聚集到第一个光径502中。孔隙502a被构造成允许最大空间角为13.5°或以下，用于照射分色镜504。光径502还包含带通滤光片507(激发滤光片)，允许波长在505 nm到530 nm之间的光通过。因此，剩余的激发波长为大约528nm。光径503经分色镜504将CMOS照相机与物体516相连，并被构造成相对光径502成一定角度(在图14中显示为90° )。光径503还包括第一个发射滤光片510。在某些实施方案中，滤光片510被固定在滤光片转换器512上。滤光片转化器512可以含有附加的发射滤光片，例如滤光片513。发射滤光片510和513可以根据预定的发射波长设置进行选择，例如盒中用于标记反应物的荧光染料的发射波长。例如，滤光片510和513可以被选择为分别透过具有590 nm和685 nm波长的光，这些波长对应于藻红蛋白和藻红蛋白_Cy5的发射波长。光径503包含孔隙503a，被构造以允许分色镜504上的最大空间角为13.5°。分色镜504被构造用于将检测光径503与激发光径502分开。在某些实施方案中，它是短程分色镜，允许波长小于等于568 nm的光通过，而波长大于568 nm的光被反射。因此，分色镜504允许来自激发光径的光通过，而将来自物体516的光反射到检测光径中。同样，分色镜504的物理性质，根据在分析中使用的标记物(例如荧光标记物)进行选择。在某些实施方案中，检测器还包含聚焦机械装置514，它允许以5mm或以下，例如I或2 mm连续地改变检测透镜508与物体的距离。在某些实施方案中，检测透镜508被构造成具有0.4或以下、例如0.2的检测光孔隙，以及0.5或以下、例如0.4的激发光孔隙。检测器也可以包含数字成像装置，例如8比特灰度值的CMOS照相机，分辨率为例如640x480像素。在其它实施方案中，数字成像装置可以具有更高的分辨率，和/或可以是彩色CMOS照相机。在某些实施方案中，检测系统的复制比例在1:1到1: 10之间，例如1:3、1:4或1:5。在某些实施方案中，物体516与检测透镜508之间的距离在2 mm到20 mm之间，例如 8 mm、9 mm 或 10 mm。参考图15，在操作中，从光源505发射的光通过透镜506聚集，并通过激发滤光片507过滤。它通过孔隙502a、分色镜504、检测透镜508、孔隙509，并激发物体601。在某些实施方案中，物体516是填充有样品液体、例如血液的通道，液体含有大量颗粒，例如待检测的辅助性T细胞。可以用一种或多种荧光染料结合的抗体标记。在其它实施方案中，物体是通道，它包含用一种或多种荧光染料标记，并结合到固定化在通道的一个表面上的探针分子或探针分子阵列上的靶分子。染料在来自LED的激发光的影响下发射荧光。从荧光染料发射的光通过孔隙509、检测透镜508，经过分色镜504被反射到检测光径503中。在那里，它通过检测滤光片510 (或513，取决于滤光片转换器512的位置)，滤光片适用于允许具有从荧光染料发射的光的波长的光通过。光通过滤光片后，被连接的CMOS照相机511的CMOS芯片收集。图16A-16B图示了可以如何使用检测器来检测例如血液样品中存在的辅助性T细胞的数量。关于装置和反应的详细情况可以在上面以及WO 2007/051861中发现，该专利申请以其全文引为参考。在讨论的例子中，制备了具有两种标记抗体的盒:藻红蛋白标记的抗⑶4抗体，和藻红蛋白_Cy5标记的抗⑶3抗体。因为辅助性T细胞在其表面上显示两种抗原，因此将用两种荧光染料标记辅助性T细胞。在其表面上只显示两种抗原中的一种的其它细胞，也可以存在于样品中。这些细胞将只用相应的荧光染料标记。在与相应的荧光染料标记的抗体反应后，将含有荧光细胞712的液体样品移动到检测通道711中。在第一个位置(图16A)，检测器710检测了第一个图像714，代表了在通道711的部分713上的视图。部分713代表预定体积的样品，例如100 nL。图像714使用第一个滤光片获取，该滤光片被构造成允许样品中存在的藻红蛋白标记的抗CD4+抗体发射的光通过，并阻断由藻红蛋白_Cy5标记的抗⑶3+抗体发射的光。同样位置的第二个图像715使用第二个滤光片获取，该滤光片被构造成允许由藻红蛋白_Cy5标记的抗⑶3+抗体发射的光通过，并阻断由藻红蛋白标记的抗⑶4+抗体发射的光。图像714和715可以显示部分713中不同数量的信号。此外，由于光学系统的像差，图像714和715可能相对于彼此不能重合。可以使用软件(例如Clondiag的Iconoclust)来校准图像714和715,例如使用通道中的比对标记(未显示)，或通过对在两张图片中都存在的信号之间的关系进行分析。此夕卜，软件识别并标记在两张图片中都检测到的信号(716)。在图16A中，三个信号被鉴定为在两张图中都存在。这意味着在部分713中发现了 3个具有两种抗原的细胞。结果可以被显示，用于进一步计算或统计，或可以储存用于进一步处理。检测器710和通道711相对于彼此移动，以观察通道711的另一个部分717 (图16B)，并重复检测步骤。使用第一和第二个滤光片，分别记录了图像718和719。软件识别并标记在两张图片中都检测到的信号(720 )。检测可以在检测通道的其它部分中重复，产生了一组值，它们代表了每个部分中细胞的数量。从该组值，可以计算出样品中存在的细胞的数量，以及相应的统计参数。例如，每100 nL平均3个细胞，对应于在5μ 的样品体积中150个细胞的总量。图17显示了在使用血液作为液体样品的T细胞计数实验过程中检测到的两张图像的叠加。使用了两个不同的检测滤光片两张图像都在通道的相同位置检测(例如图5中的714和715)。801和802代表使用两种不同的检测滤光片成像的一个比对标记。两张图像之间的错位可以清楚地检测到，并使用所述标记进行校正。803和804代表了与例如比对标记801和802错位了同样距离的单个细胞。因为该细胞在两张图像中都出现，因此可以确定，该细胞被两种抗体标记，因此是辅助性T细胞。805代表了只可以在叠加的两张图像的一张中检测到的细胞。因此可以推导，该细胞在其表面上不显示两种抗原，因此不是辅助性T细胞。在图像中也可以看见其它血液细胞。因为它们没有被任何荧光抗体标记，它们只能作为阴影(806)被看见。其它的实施方 案在权利要求书的范围内。
权利要求
1.一种用于检测被分析物的装置，包括:流体回路，其中该流体回路包括:具有入口的第一区；具有检测区的微流体通道，该检测区域与第一区流体连通；和，至少部分可被挤压的第二区，该第二区与检测区域流体连通；其中入口与第二区能相连接形成封闭的流体回路。
2.根据权利要求1所述的装置，该装置还包括一密封元件，该元件可以可逆地或不可逆地把入口连接到第二区形成封闭的流体回路。
3.根据权利要求1或2所述的装置，该装置被构造成在流体样本与入口接触后，毛细作用将液体样品吸入第一区。
4.一种用于检测被分析物的方法，包括: 提供一种用于检测被分析物的装置，该检测装置包括:流体回路，其中该流体回路包括:具有入口的第一区；具有检测区的微流体通道，该检测区域与第一区流体连通；和，至少部分可被挤压的第二区，该第二区与检测区域流体连通；其中入口与第二区相连形成流体回路； 在流体回路处于开发状态下，让液体样本与流体回路的入口接触； 连接入口与第二区域形成封闭的流体回路； 布置一辊子在第二区上，让第二区处于被挤压的状态； 在维持挤压状态的同时，相对于第二个区移动辊子，从而把液体样本移动到检测区； 测试检测区上的被分析物。
5.根据权利要求4所述的方法 ，辊子的移动在辊子的两侧产生压力差，压力差诱导液体的移动，从而恢复相同的压力差。
6.根据权利要求4或5所述的方法，该方法还包括:相对彼此移动检测区域和检测器来查看检测区的另外部分，和重复检测步骤。
7.根据权利要求4-6之一的方法，其中，当检测区被充满的时候进行检测。
8.根据权利要求4-7之一的方法，其中，被分析物为辅助性T细胞。
9.根据权利要求8的方法，其中，在回路中，辅助性T细胞与标记有第一荧光染料的抗⑶4+的抗体和标记有第二荧光染料的抗⑶3+的抗体反应。
10.根据权利要求9的方法，其中，辅助性T细胞与标记有荧光染料的抗体反应后，包括有荧光辅助性T细胞被移动到检测区。
11.根据权利要求1的方法，其中，与检测区对应的部分微流体通道是透明的。
12.一种用于操作检测装置的机器，其中，检测装置包括:流体回路，其中流体回路包括:第一区；至少部分透明的通道；至少部分可被挤压的第二区；在第一区和第二区之间的紧密连接件；该机器还包括一辊子，该辊子被构造成让部分第二区上的区域处于挤压的状态，其中， 在挤压的状态下，辊子与第二区彼此相对移动；和被构造检测通道中微粒的检测器。
13.根据权利要求12的机器，其中，辊子被安装在机器中；该机器被构造成，在挤压状态下，检测装置与辊子相对移动；或者，在挤压状态下，辊子在机器中移动，检测装置被构件成固定不动的。
14.根据权利要求12或13的机器，其中检测器为荧光显微镜。
15.根据权利要求12-14之一的机器,其中检测器包括一主体,该主体包括第一光径和第二光径。
16.根据权利要求15的机器，其中，第一光径将光源和检测装置连接；第二光径通过分色镜将照相机与检测装置连接，并被构造成相对第一光径成一定角度。
17.根据权利要求16的机器，其中，第二光径包含孔隙，被构造以允许分色镜上的最大空间角为13.5°。
18.根据权利要求11-17之一的机器，其中，检测器还包括聚焦机械装置，其中聚焦机械装置允许以5_或以下连续地改变检测镜与检测装置的距离。
19.根据权利要求11-17之一的机器，其中，检测镜与检测装置的距离在2毫米和20毫米之间。
20.—种用于操作检测装置的方法，包括:插入检测装置到机器中，该检测装置包括:流体回路，其中该流体回路包括:第一区；至少部分透明的通道；至少部分可被挤压的第二区；在第一区和第二区之间的紧密连接件；该机器还包括辊子，该辊子被构造成让第二区上的部分区域处于挤压的状态，其中，在挤压的状态下，辊子与第二区彼此相对移动；和，被构造为检测通道中微粒的检测器；在挤压状态下，相互相对移动辊子与第二区，从而让液体移动到通道中；和检测部分通道中的微粒。
21.根据权利要求20所述的方法，该方法还包括:相对彼此移动通道和检测器来查看通道的另外部分，和重复检测步骤。
22.根据权利要求20或21的方法，其中，当通道被充满的时候进行检测。
23.根据权利要求20或21的方法，其中，检测装置包括反应腔，其中反应腔包括反应物颗粒，其中，反应物颗粒包括荧光标记物，并与样品中待检测的微粒上的抗原具有亲和性的抗体。
24.根据权利 要求23的方法，其中，微粒为辅助T细胞反应物颗粒包含用第一荧光染料标记的抗⑶4+抗体、用第二荧光染料标记的抗⑶3+抗体、盐和稳定化反应物。
25.根据权利要求24的方法,其中,这些细胞与标记有荧光的抗体反应后,包括有荧光的细胞被移动到通道中。
26.根据权利要求25的方法，其中，第一图象使用第一个滤光片获取，该滤光片被构造成允许样品中存在的第一荧光染料标记的抗CD4+抗体发射的光通过，并阻断第二荧光染料标记的抗CD3+抗体发射的光；同样位置，第二个图像使用第二个滤光片获取，该滤光片被构造成允许由第二荧光标记的抗⑶3+抗体发射的光通过，并阻断由第一荧光标记的抗⑶4+抗体发射的光。
全文摘要
本发明提供一种用于检测被分析物的装置、检测被分析物的方法、一种用于操作检测装置的机器以及一种用于操作检测装置的方法。一种用于检测被分析物的装置，包括流体回路，其中该流体回路包括具有入口的第一区；具有检测区的微流体通道，该检测区域与第一区流体连通；和，至少部分可被挤压的第二区，该第二区与检测区域流体连通；其中入口与第二区能相连接形成封闭的流体回路。
文档编号B01L3/00GK103143404SQ20121039090
公开日2013年6月12日 申请日期2008年5月5日 优先权日2007年5月3日
发明者托马斯·凯泽, 克劳斯-彼得·默比乌斯, 托尔斯滕·舒尔茨, 托马斯·乌利希, 亚历山大·范申克楚施魏因斯贝格, 尤金·埃曼特劳特, 延斯·图赫舍雷尔 申请人:科隆迪亚戈有限公司