具有聚合涂层的多孔膜及其制备和使用方法

具有聚合涂层的多孔膜及其制备和使用方法
【专利摘要】描述了一种包含接枝到多孔膜的聚合物涂层的改性多孔膜。接枝到所述多孔膜的聚合物涂层通常包含可变长度的电子束(电子束)反应性部分的聚合物(标记为“聚-(A)x”)，在聚-(A)x和官能团B之间形成键合的链接基团，所述官能团B可用于与在生物分子上的化学基团反应，其中在所述多孔膜上的所述聚合物涂层促进生物分子(例如DNA、RNA、蛋白质和抗体)在所述多孔膜上的固定。所述组合物适用于免疫测定、体外诊断测试、护理点测试、用于从生物学样品分离生物分子的技术、和需要在多孔膜上固定生物分子的其它方法。还公开了制备这些改性多孔膜的方法。
【专利说明】具有聚合涂层的多孔膜及其制备和使用方法
[0001]相关申请的交叉引用
本申请要求均于2011年12月29日提交的美国专利申请号13/339，960、13/339，996和13/340,052的优先权；它们的公开内容通过引用而全文结合到本文中。
发明领域
[0002]本公开总体涉及永久接枝聚合涂层的多孔膜，以促进生物分子在所述多孔膜上的固定。还描述了制备和使用具有这些聚合涂层的改性多孔膜的方法。
[0003]背景
多孔膜(例如硝化纤维素膜)常规地用于多种过程，包括需要固定一种或多种生物分子的生物学应用。这些生物分子包括但不限于蛋白质(例如，抗体)和核酸(例如，脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA))。需要膜用于固定生物分子，用于例如免疫测定、体外诊断测试(特别是护理点诊断方法)和在生物学样品(例如，血液、尿、唾液、痰、其它身体分泌物、细胞和组织样品)中分析物或生物分子分离，用于多种生物学过程和医疗技术。
[0004]硝化纤维素膜呈现硝化纤维素膜和生物分子之间基本上非特异性的相互作用，并且研究人员传统上依赖该被动关联作为在多种“捕集”型固定方法中使用硝化纤维素膜的基础。然而，对硝化纤维素膜和关注的生物分子之间的该被动相互作用的依赖可导致在许多生物学应用中成功使用硝化纤维素膜的复杂化，因为其必然限制可在硝化纤维素膜上固定的生物分子的量。取决于该被动结合过程，虽然对于其中分析物或生物分子以足够高的浓度存在于待分析的生物学样品中的某些应用可能足够，对于这些被动的物理吸收性质的该依赖限制传统的基于硝化纤维素膜的技术，例如，在其中分析物或生物分子的量低并且可能通过已知的组合物和标准方法“不可检测”的疾病状态中。
[0005]先前的研究已利用多种技术来将多孔膜(例如，硝化纤维素膜)改性，以改进在多孔膜基底上生物分子的结合或固定。促进生物分子与多孔膜结合的方法包括但不限于氨等离子体处理、氧等离子体处理、“桥接”分子的共价键合和硝化纤维素膜的羟基胺处理。这些技术和膜改性还未实现本领域技术人员期望的目标。
[0006]本领域需要将多孔膜改性(例如，化学改性)的新的方法，以改进关注的生物分子(例如，蛋白质和核酸)与多孔膜基底的固定和结合。这样的改性多孔膜(包括改性硝化纤维素膜)适用于例如免疫测定、体外诊断测试(例如，护理点诊断应用)和在生物学样品中分离关注的生物分子的技术。此外，改性多孔膜将允许提高生物分子(例如，DNA、RNA和蛋白质，特别是抗体)与多孔膜的结合，从而导致改进的免疫测定和诊断测试的特异性和灵敏度、降低数量的错误阳性和错误阴性测试结果、降低的生物学样品中分析物或生物分子的所需最小浓度、在例如免疫测定和护理点诊断(特别是检测甚至以少量存在于生物学样品中的分析物和生物分子的那些)中精确的生物分子检测。本申请的改性多孔膜将进一步缩短精确检测生物分子的存在所需的时间，从而还提供更快速的阳性或阴性测试结果。因此，有利的是提供具有聚合物涂层的多孔膜，所述涂层改进生物分子与这些多孔膜的固定和结合。通过新型生产方法，可进一步产生改性多孔膜。
[0007]概述
本文描述改性多孔膜。在一个具体的实施方案中，多孔膜包含至少一种接枝到所述多孔膜的聚合物的涂层。聚合物涂层通常与多孔膜膜永久(例如，共价)结合。在本发明的某些方面，多孔膜为硝化纤维素膜。聚合物可通过任何方法与多孔膜接枝，包括产生自由基，例如通过使电子束(电子束)反应性部分衍生化，其中当暴露于电子束辐射时，电子束反应性部分使聚合物涂层与多孔膜永久键合。对于公开的组合物和方法，或者自由基可通过以下产生:包括但不限于紫外辐射、Y辐射、电晕放电和使用化学引发剂。
[0008]在其它实施方案中，本文公开的改性多孔膜包含至少一种含环氧基团的化合物的聚合物涂层。如下使含环氧基团的化合物接枝到所述多孔膜:使用电子束辐射和含有电子束反应性部分的可变长度的聚合物(标记为“聚-(A)x聚合物”)在所述多孔膜上产生自由基，在聚-㈧x聚合物和官能团“B”之间形成键合的“链接”，所述官能团“B”能与存在于生物分子上的化学基团反应，从而导致形成聚合物涂层，例如，与多孔膜永久结合的含环氧基团的化合物，例如GMA。
[0009]本文的组合物包括改性多孔膜，其包含例如永久接枝到多孔膜的含环氧基团的化合物的聚合物。在某些实施方案中，所述改性多孔膜包含含环氧基团的分子缩水甘油基(glycidal)甲基丙烯酸酯(GMA)的聚合物。所述组合物适用于改进生物分子例如蛋白质(例如，抗体)和核酸(例如，DNA或RNA)与多孔膜(包括但不限于硝化纤维素膜)的结合的方法。在特定的方面，所述组合物用于免疫测定、体外诊断测试、从生物学样品(例如，血液、尿、唾液、痰和细胞或组织的样品)鉴定或分离关注的生物分子的技术、和需要在多孔膜基底上固定生物分子的各种其它生物学方法。
[0010]附图
当参考附图，阅读以下详细说明时，化学改性的多孔膜的这些和其它特征、方面和优点将变得更好理解，其中由始至终在附图中，相似的符号代表相似的部件，其中:
图1提供本文描述的改性多孔膜的通式(式(I))。该通式的具体组分的细节在整个说明书中提供。
[0011]图2为通过电子束辐射在硝化纤维素膜上接枝缩水甘油基甲基丙烯酸酯(GMA)的机理的示意性表示。
[0012]图3提供根据本发明方法的示例性方法，对于用于在硝化纤维素膜上接枝GMA的各种反应物得到的ATR FTIR光谱。具体地，在图2中呈现硝化纤维素、硝化纤维素+水、硝化纤维素+水+Tween-20 ? (聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月硅酸酯)、硝化纤维素+水+GMA+Tween-20 ? (聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月硅酸酯)、GMA和Tween-20? (聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月硅酸酯)的光谱。对于使用的方法的细节，参见以下实施例1。
[0013]图4提供使用10 kGy或50 kGy的电子束辐射，接枝有GMA的硝化纤维素的复制样品的ATR FTIR光谱。另外的细节在实施例1中描述。
[0014]图5提供使用10 kGy (B)或50 kGy (C)的电子束辐射，丙酮溶解的未改性的硝化纤维素膜(A)和接枝有GMA的改性硝化纤维素膜的1H DOSY NMR分析的结果。关于进一步的细节，参见实施例1。
[0015]图6描述用于评价与这些膜的BSA蛋白质的结合的测定中使用的未改性和改性硝化纤维素膜的荧光扫描和比色分析的结果。在不同的反应条件下实施测定，如以下实施例2描述的。
[0016]图7提供使用未改性的或接枝有GMA的改性硝化纤维素膜实施的模型侧流测定(例如，受孕测试)的照相结果。该实施例描述于实施例3。
[0017]图8证明与未改性硝化纤维素膜条的相应实施例中得到的结果相比，在利用接枝有GMA的改性硝化纤维素膜条的侧流测定中对于抗原人绒膜促性腺激素(hCG)得到显著更低的检测限度。关于另外的细节，参见以下实施例5。
[0018]图9提供证实以下的图片:与未改性硝化纤维素膜条的相应实施例中得到的结果相比，在利用接枝有GMA的改性硝化纤维素膜条的侧流测定中，检测等量的hCG的时间显著降低。在使用接枝GMA的硝化纤维素的侧流测定中，在约2分钟时，观察到hCG存在的目视阳性结果，与之相比，在相同的侧流测定中，在使用未改性的硝化纤维素膜的侧流测定中，实现类似的结果需要约20分钟。关于另外的细节，参见实施例6。
[0019]详述
本文提供包含至少一个与多孔膜接枝的聚合物涂层的改性多孔膜，以促进生物分子在所述多孔膜上的固定。本文使用的术语“改性”，特别是提及所公开的多孔膜时，旨在包括对多孔膜的任何改变，例如，对初始的未改性的多孔膜的化学改变。本发明的“改性”多孔膜可为包含聚合涂层的化学改性多孔膜，所述聚合涂层包含例如接枝到多孔膜的含环氧基团的化合物(例如，GMA)。在本公开的一方面，多孔膜为包含在多孔膜上接枝的含环氧基团的化合物(GMA)的聚合物的硝化纤维素膜。
[0020]示例性改性多孔膜的示意图在以下提供并且在图1和图2中陈述。如图中所示，在某些方面，本公开的多孔膜具有式(I)的结构，其包括与多孔膜结合的聚合物涂层，其中所述聚合物涂层包含:1)电子(电子束)反应性部分的可变链单体长度的聚合物(标记为聚(A)x) ;2)在(聚(A)x)和3)之间形成键合的链接；和3)标记为B基团的官能团，其促进与化学基团(例如，在关注的生物分子上存在的胺基)的反应，从而促进生物分子在多孔膜上的固定。聚合物涂层(例如，在以下示意图中标记的“聚(A)x-链接-B”)包含数个组分(例如，聚(A)x聚合物、链接和官能部分B)，并且使聚合涂层接枝(例如，共价键合)到多孔膜。关于聚合物涂层的组分和功能的更详细的描述参见以下和图1和图2。
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[0021]式(I)
为了更清楚和简明地描述和指出要求保护的本发明的主题，对于用于以下说明和所附权利要求的特定术语提供以下定义。在整个说明书中，特定术语的举例应看作是非限制性实例。
[0022]本文使用的术语“改性的”，特别是提及所公开的多孔膜和固相材料时，旨在包括对膜或固相材料的任何改变，例如，对初始的未改性的多孔膜或固相膜基底的化学改变。本发明的“改性”多孔膜可为包含接枝到多孔膜的聚合物(例如含环氧基团的化合物)的改性(例如，化学改性)多孔膜。在本公开的一方面，多孔膜为硝化纤维素膜，并且含环氧基团的化合物为GMA。
[0023]还提供了用于制备具有在多孔膜上永久接枝的聚合物涂层的多孔膜的方法。在一些实施方案中，如下使改性多孔膜接枝有聚合物涂层:首先在可变长度的聚合物(例如，“聚-(A)x聚合物”)的溶液中浸没多孔膜，该聚合物包含电子束反应性部分、在聚-(A)X聚合物和官能团B之间形成键合的“链接”和可用于与在生物分子上存在的官能部分反应的官能团B(参见以下和图1)，随后经历电子束。例如，将多孔膜浸没在含环氧基团的化合物(例如，GMA)中，随后经历电子束辐射。或者，在本发明的其它方面，如下制备改性多孔膜:首先使多孔膜经历电子束辐射，接着在例如如上所述的含环氧基团的化合物(例如GMA)的溶液中浸没膜。本公开包括生产本文描述的改性多孔膜基底的方法，所述方法改变例如浸没和电子束辐射步骤的方法步骤的顺序。
[0024]如以下更详细描述的，当在用于制备改性多孔膜的方法的情境中使用时，术语将多孔膜“浸没”在例如含环氧基团的化合物(例如GMA)(如在权利要求书中叙述)的溶液中通常通过以下实现:在聚合涂层(聚(A)x-链接-B)溶液中浸溃整个多孔膜，随后除去任何过量的溶液。
[0025]本公开包括各种多孔膜。仅为了示例性目的并且无任何预期限制，未改性的多孔膜可包括硝化纤维素膜、纤维素膜、乙酸纤维素膜、再生纤维素膜、硝化纤维素混合酯膜、聚醚砜膜、尼龙膜、聚烯烃膜、聚酯膜、聚碳酸酯膜、聚丙烯膜、聚偏二氟乙烯膜、聚乙烯膜、聚苯乙烯膜、聚氨酯膜、聚苯醚膜、四氟乙烯-六氟丙烯共聚物膜或上述多孔膜中的两种或更多种的任何组合。
[0026]硝化纤维素膜目前广泛用于多种需要在固相材料上固定特定的生物分子(例如，DNA、RNA或蛋白质例如抗体)的生物学应用。“多孔膜”旨在不带限制地表示任何多孔膜，包括任何市售可得的多孔膜，特别是市售可得的硝化纤维素膜。在本公开的某些方面，如在图1中陈述的，将硝化纤维素膜化学改性，以包含聚合涂层，所述聚合涂层促进在多孔改性膜上的生物分子固定。例如，一种这样的改性多孔膜包含接枝到硝化纤维素膜的含环氧基团的化合物(例如，GMA)。由硝化纤维素聚合物制备的硝化纤维素膜对于DNA、RNA和蛋白质具有强亲和力，并且防止这些生物分子变性。
[0027]本申请使用的“硝化纤维素膜”包括含有任何氮浓度、孔尺寸多样性和可变的膜厚度的所有那些多孔膜产品。在特定的实施方案中，多孔膜的孔尺寸可在0.01-50微米范围。此外，在整个多孔膜中，孔直径可为均匀的，或者，孔直径可为不规则的。选择具有适当的氮含量、孔尺寸和膜厚度的多孔膜(例如硝化纤维素膜)以实现特定的期望结果，完全在本领域技术人员的技术和知识以内。此外，专业技术人员将立即理解和认识到短语“硝化纤维素膜”的含义，并且这样的硝化纤维素膜，例如，或市售可得的硝化纤维素膜，可为“无背衬”膜，或者含有“背衬材料”或“背衬支撑”例如聚酯(PE)。是否使用“无背衬”或者“背衬”多孔膜(例如，硝化纤维素膜)的选择取决于要实施的具体应用，并且进行这样的选择完全在本领域普通技术人员的能力以内。
[0028]具有任何氮浓度、孔尺寸或存在或不存在背衬支撑的硝化纤维素膜均包括在本文使用的术语“硝化纤维素膜”中。硝化纤维素膜具有多种化学和物理性质，并且常规地用于需要例如将关注的生物分子(例如，抗体)固定到多孔膜，或用于在这些多孔膜上收集生物分子以将它们与待分析的生物学样品中的其它蛋白质、核酸和生物分子等分离的生物学技术。任何硝化纤维素膜可用于本公开。
[0029]虽然在整个本申请中提及多孔膜，但组合物、制备方法和使用方法同样适用于可用于固定生物分子的其它固相材料，如在本文的权利要求所叙述。这样的固相材料包括但不限于玻璃珠、玻璃纤维、胶乳珠、节点、块状物、纳米颗粒、空心膜管和上述固相材料中的两种或更多种的任何组合。
[0030]不旨在局限于特定的作用机理，本公开使用的术语“电子束反应性部分”(在图1中标记为“A”)指当经历电子束辐射时认为能自聚合的任何化学官能团(例如，在图2中，聚(A)x)。示例性电子束反应性部分包括但不限于包含以下的那些化合物:甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯、丙烯酰胺、乙烯基酮、苯乙烯、乙烯基醚、含乙烯基的部分、含烯丙基的部分、基于苄基的化合物和基于叔碳(CHR3)的化合物或者上述两种或更多种电子束反应性部分。此外，基于该代表性列举，本领域技术人员可预见其它适当的电子束反应性部分用于本发明。
[0031]以下描述的在聚(A)x聚合物和官能团B之间形成键合的示于图1的“链接”包括但不限于酯、脂族、芳族、亲水性化合物、杂芳族化合物或这些示例性链接中的两种或更多种的任何组合。
[0032]不旨在以任何方式限制，在图1中呈现的示意图中标记的B官能团包括含环氧基团的化合物、聚乙二醇(PEG)、炔基团、羟基、胺基团、卤素基团、甲苯磺酰基、甲磺酰基、叠氮基、异氰酸酯基团、硅烷基团、二硅氮烷、巯基、羧酸酯、异腈、亚磷酰胺、氮宾、氢化甲硅烷基、腈、烷基膦酸酯和这些官能的部分中的两种或更多种的任何组合。虽然不打算局限于特定的作用机理，通过电子束辐射，可在多孔膜上引入B官能团，导致电子束反应性部分自聚合，进而使得B官能团(例如，环氧基团)可用于与官能部分(例如，在生物分子，例如蛋白质，特别是抗体，上存在的胺基团)反应，从而促进生物分子在改性多孔膜上的固定。该改性是有益的，因为许多多孔膜(例如硝化纤维素膜)缺乏使多孔膜与具有例如氨基的关注的生物分子(例如，蛋白质，更特别是抗体)有效键合所需的有机官能团。
[0033]“含环氧基团的化合物”指包含至少一个环氧基团的任何化合物。任何含环氧基团的化合物(例如GMA)可用于本公开的组合物和方法。在一种实施方案中，改性多孔膜为接枝有GMA的聚合物的硝化纤维素膜。
[0034]在特定的实施方案中，B官能团为含环氧基团的化合物，例如环氧基团。在本公开的这些方面，多孔膜(例如，硝化纤维素膜)可包含诸如GMA的化合物的聚合物。
[0035]术语“生物学样品”包括但不限于得自人或非人生物体的血液、血清、淋巴、唾液、粘液、尿、其它身体分泌物、细胞和组织部分。生物学样品可由经历诊断测试(例如，血糖监测)的个体自身或由经过训练的医疗专业人员通过多种技术得到，所述多种技术包括例如用针吸出血液，或者刮或擦特定的区域，例如患者皮肤上的伤口。用于收集各种生物学样品的方法为本领域公知的。
[0036]本文使用的“免疫测定”在其最宽的含义内包括基于抗体及其相应的抗原之间的相互作用的任何技术。这样的测定基于抗体以高特异性与一种或非常有限组的类似分子(例如，抗原)结合的独特能力。与抗体结合的分子称为抗原。可使用抗原或抗体作为“捕获”分子来“俘获”抗体-抗原对的另一成员，进行免疫测定。
[0037]免疫测定的示例性但非穷尽的列举包括侧流测定(例如，家庭受孕测试)、放射性免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)、酶联免疫吸附剂测定(ELISA)、荧光免疫测定和化学发光免疫测定。该领域专业技术人员具有选择和实施适当的方法用于具体的情况所需的技能，以及实施这些免疫测定的技能，以及解释结果的技能。免疫测定可产生定性或定量的结果，取决于选择的具体的检测方法。
[0038]侧流测定为常见的免疫测定，主要是由于其容易使用，并且包括例如市售可得的家庭-受孕测试和常规药物测试的产品。侧流测定是特别有利的，因为装置和方法通常易于使用和解释测试结果，即使由没有接受正式医疗训练的个体进行。侧流装置和方法旨在检测在生物学样品(例如，尿)中存在或不存在目标分析物或生物分子(例如，在侧流家庭受孕测试中的人绒膜促性腺激素(hCG))。虽然在侧流装置和测定中存在变化，但这些测试常用于家庭测试、护理点测试和实验室使用。侧流测定通常以方便的“量尺”形式呈现，如在以下实施例中描述的，其中待测试的生物学样品通过毛细作用沿着固体基底(例如，多孔膜，通常为硝化纤维素膜)流动。在某些形式的侧流测定中，将量尺浸没在生物学样品中，当生物学样品在测试条纹上向上流动时，其遇到事先印在量尺上的一种或多种试剂，从而遇到已事先印有例如抗体或抗原(例如，hCG)的测试条纹上的线或区域。当生物学样品遇到该试剂时，产生信号以指示对于分析物或关注的生物分子的存在而言，该测试为阳性还是阴性(例如，通常在家庭受孕测试中，在hCG检测中，裸眼可见的线指示患者的尿中存在 hCG)。
[0039]侧流装置和方法为本领域公知的。参见，例如，美国专利号4，094，647 ;4，313，734 ;4，857，453 ;5，073，484 ;5，559，041 ;5，571，726 ;5，578，577 ;5，591，645 ；6，187，598 ;6，352，862和6，485，982 ;均通过引用而全文结合到本文中。在已知的例如侧流装置和测定中包括本公开的改性多孔膜(例如包含GMA聚合物的聚合涂层的改性硝化纤维素膜)将显著改进这样的侧流装置和免疫测定的性能、灵敏度和特异性，降低得到准确测试结果所需的分析物或生物分子的浓度，和降低检测存在或不存在分析物或生物分子的时间，从而使获得测试结果所需的时间最小化。
[0040]所有抗体为蛋白质，更具体是糖蛋白，并且对关注的抗原(例如，多肽的一部分)呈现结合特异性。术语“抗体”以最宽的含义使用，并且涵盖完全装配的抗体、可结合抗原的抗体片段(例如，Fab’、F’(ab)2、Fv、单链抗体、双抗体)和包含前述的重组体肽。“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原-结合区域或可变区域。抗体片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段、双抗体和线性抗体(Zapata等人(1995) ProteinEng.8 (10): 1057 1062)、单链抗体分子和由抗体片段形成的多-特异性抗体。任何抗体或抗体片段可用于本发明的实践。
[0041]在本发明的某些方面，需要检测在固相材料(包括但不限于硝化纤维素膜)上的抗体结合或固定。所公开的发明包括本领域已知的用于检测与硝化纤维素膜结合的抗体的任何方法。适当的抗体结合检测技术的确定和优化为标准的，并且完全在本领域技术人员的常规能力以内。在一些实施方案中，通过使抗体与可检测物质偶联，可促进抗体结合的检测。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。示例性合适的酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、半乳糖苷酶或乙酰胆碱脂酶；合适的辅基复合物的实例包括抗生物素蛋白链菌素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、荧光素异硫氰酸酯(FITC)、若丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；可与抗体偶联的可检测的发光材料包括但不限于鲁米诺；生物发光材料的实例包括萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白；以及用于检测抗体结合的合适的放射性材料的实例包括1251、1311、35S或3h。
[0042]包含例如GMA的聚合物涂层的改性多孔膜可被进一步改性，以包含在多孔膜上固定的亲水性化合物。在包含聚合涂层的改性多孔膜上引入亲水性化合物可用作阻断剂，以降低与多孔膜(例如，硝化纤维素膜)的非特异性背景结合。使与多孔膜的非特异性背景结合最小化改进例如免疫测定中的信号与噪声比，该免疫测定基于在多孔膜上固定的抗体和样品(对于该生物分子的存在或量进行分析)中的关注的特定生物分子(例如，蛋白质)的特异性相互作用。
[0043]在本发明的某些方面，如上所述，使用本文描述的聚合涂层(聚(A)x-链接-B)(例如，GMA)的含水溶液制备要求保护的改性多孔膜(特别是硝化纤维素膜)。GMA的溶液还可包含助溶剂，以改进GMA在水中的溶解度。例如，表面活性剂，更特别是非离子表面活性剂(例如，聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Tween-20?))，可用作助溶剂，以提高例如GMA在水中的溶解度。本领域技术人员将认识到必须通过实验确定和优化提高例如含环氧基团的化合物的溶解度所需的特定助溶剂(例如非离子表面活性剂如Tween-20?)的适当量。
[0044]不旨在局限于制备接枝有聚合涂层(例如，GMA)的改性多孔膜的特定的方法，本文提供制备改性多孔膜的示例性方法。其它方法也可用于生产改性多孔膜。在一种实施方案中，如下制备改性多孔膜:提供多孔膜；在聚(A)x-链接-B (例如，诸如GMA的化合物)的溶液中浸没多孔膜；使所得到的多孔膜经历电子束辐射；干燥多孔膜，从而制备改性多孔膜。或者，可如下制备改性多孔膜:首先使多孔膜经历电子束辐射，随后在聚(A^-链接-B(例如GMA)的溶液中浸没多孔膜。也就是，本发明的改性多孔膜可如下制备:首先提供多孔膜；使多孔膜经历电子束辐射；在聚(A)x-链接-B (例如，GMA)的溶液中浸没硝化纤维素膜；干燥多孔膜，从而制备改性多孔膜。
[0045]不旨在局限于特定的机理，在用于生产改性多孔膜(特别是硝化纤维素膜)的上述方法中，认为电子束辐射在多孔膜上产生自由基，其随后可用于攻击在例如含环氧基团的化合物(例如，GMA)上的双键，从而引发含环氧基团的化合物的自聚合，并且导致聚合物涂层在多孔膜(特别是硝化纤维素膜)上的接枝。参见图1和图2。接枝到多孔膜的官能团B(例如，环氧基团)随后可用于与在关注的生物分子上存在的胺和其它化学基团反应，导致生物分子与改性多孔膜的结合提高。生物分子(例如抗体)的提高的特异性结合可改进例如免疫测定的灵敏度和特异性。
[0046]选择在多孔膜上接枝聚合物涂层的方法中使用的电子束辐射的剂量，使得与多孔膜接枝的聚合物涂层的量最大化，同时还限制已知由电子束辐射引起的多孔膜(例如，硝化纤维素膜)的降解。本领域技术人员将认识到，用于制备本发明的改性多孔膜的电子束辐射的适当剂量需要通过实验优化。在具体的实施方案中，在制备改性多孔膜的方法中使用的电子束辐射的剂量可在小于I kGy-约50 kGy范围。优化参数(例如聚合物涂层的量、助溶剂和适用于本发明方法的电子束辐射的剂量)的测定的设计为标准的，并且完全在本领域技术人员常规能力以内。
[0047]本发明的改性多孔膜适用于各种生物学应用，其取决于生物分子在多孔膜(例如，硝化纤维素膜)上的固定，包括但不限于免疫测定、体外诊断测试和用于分离关注的生物分子的技术。硝化纤维素膜由于它们固定核酸(例如，DNA和RNA)用于DNA印迹和RNA印迹的独特能力以及它们对氨基酸(例如，蛋白质)的结合亲和力而在生物学技术中具有特别的用途。作为这些性质的结果，硝化纤维素膜在其中抗原-抗体结合提供测试结果(例如，家庭受孕测试)的诊断测试中广泛用作基底。
[0048]虽然未改性的硝化纤维素膜结合生物分子(例如核酸和蛋白质)的能力是有益的，但多孔膜(特别是硝化纤维素膜)改性以促进生物分子(例如，DNA、RNA和蛋白质，更特别是抗体)的固定比起这些生物分子与未改性的多孔膜(例如，硝化纤维素膜)的结合提供显著的优点。
[0049]因此，在本发明的某些方面，本文描述用于改进生物分子在多孔膜上的固定的方法。具体地，在某些实施方案中，用于改进生物分子在多孔膜上的固定的方法包括提供本文公开的包含聚合物涂层的改性多孔膜，在生物分子的溶液中培育改性多孔膜，洗涤多孔膜以除去未结合的材料，从而改进生物分子与多孔膜的固定。多孔膜可在包含表面活性剂(特别是非离子表面活性剂，更特别是Tween-20? (聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月硅酸酯))的含水溶液中洗涤，以进一步使与改性多孔膜的非特异性结合最小化。在一些实施方案中，在改性多孔膜(特别是硝化纤维素膜)上固定的生物分子为DNA、RNA或蛋白质，例如抗体。
[0050]本文还描述了用于改进免疫测定的灵敏度的方法，所述方法包括提供包含本文详细描述的聚合物涂层(例如，GMA的聚合物涂层)的改性多孔膜，在与抗原特异性结合的第一抗体的溶液中培育改性多孔膜，从而导致抗体在改性多孔膜上的固定，洗涤改性多孔膜以除去过量的非固定的抗体，在生物学样品中培育包含固定的抗体的改性多孔膜，所述生物学样品可含有与在改性硝化纤维素膜上固定的抗体特异性结合的分析物(例如，抗原)，和检测在生物学样品中的抗原与在改性多孔膜上固定的抗体的结合。
[0051]或者，生物学样品可首先用也与关注的抗原特异性结合的第二抗体培育，其中第二抗体与可检测物质缀合。这样的可检测物质包括但不限于酶、辅基、荧光染料、发光材料、生物发光材料、放射性材料或金颗粒。用与可检测物质缀合的抗体事先培育的生物学样品随后用包含例如GMA的聚合物涂层的改性多孔膜培育。在用生物学样品事先培育的抗体上存在可检测物质允许在被分析的生物学样品中检测抗原。
[0052]上述方法(其中化学改性的多孔膜(例如，硝化纤维素膜)具有改进的与生物分子(例如DNA、RNA或蛋白质)结合的能力)赋予利用这些改性多孔膜的免疫测定多种优点。例如，在改性多孔膜上提高的抗体固定，降低检测关注的抗原的存在所需的抗体量，改进从生物学样品“捕获”抗原，因为在改性多孔膜(例如，硝化纤维素膜)上固定的抗体量提高，导致与固定的抗体结合的抗原提高，并且在生物学样品中用于检测在生物学样品中的生物分子的存在的抗体量降低。
[0053]本领域存在多种免疫测定，包括用于药物测试、激素、与很多疾病相关的蛋白质、肿瘤蛋白质标记物和心脏损伤所用蛋白质标记物的那些免疫测定。免疫测定还用于对感染剂(例如嗜血杆菌(Hemophilus)、隐球菌(Cryptococcus)、链球菌(Streptococcus)、乙型肝炎病毒、HIV、莱姆病和砂眼衣原体(Chlamydia trichomatis))检测抗原。这些免疫测定测试常用于鉴定患有这些和其它疾病的患者。因此，用于在免疫测定中改进灵敏度、特异性和检测限度的组合物和方法在诊断医学领域非常重要。
[0054]术语“分析物”指通过免疫测定或其它诊断测试测定其在例如生物学样品中存在或不存在的物质或化学成分。
[0055]本文使用的“生物分子”不带限制地表示核酸(例如，DNA或RNA)或蛋白质(例如，抗体)，但是还包括从生物体(例如，人患者)中除去的任何有机分子。
[0056]提供以下实施例作为说明而不是作为限制。
实施例
[0057]实施例1:将GMA接枝到硝化纤维素膜
使用包含8% GMA(v/v)溶液在Tween-20? (聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月硅酸酯)中的含水溶液，在硝化纤维素骨架上的3或6的碳位置处将GMA接枝到硝化纤维素膜(例如，无背衬的硝化纤维素膜(“NC”)或聚酯(PE)-背衬的硝化纤维素膜(“PE-背衬的NC”)。在GMA溶液中缓慢浸溃膜，以使膜饱和，并除去过量的溶液。随后在125 kV下，在10 kGy或 50 kGy 的剂量下，使用 EBLAB-150 (Advance Electron Beams, Wilmington, MA),将硝化纤维素膜暴露于电子束辐射，以50英尺/分钟使硝化纤维素膜在电子束下通过。将膜在去离子水中洗涤3次，随后在数次更换去离子水中搅动1-2小时。在50°C和25 mm Hg下将硝化纤维素膜干燥过夜，测定在GMA接枝后的重量增加。在某些实验中，首先将硝化纤维素膜暴露于电子束辐射，随后在含水GMA溶液中浸溃，但是如上所述进行使用该接枝过程实施剩余的实验。其中首先将硝化纤维素膜辐射的那些实验在以下本文提供的表中指示。
[0058]在各种电子束辐射剂量下，在GMA接枝后，未背衬的(“NC”)和PE-背衬的(“PE-背衬的NC”)硝化纤维素膜的重量增加百分数(例如，相对于未改性的膜)在表I中提供。适当地，重量增加表述为相对于未改性的未背衬的或PE-背衬的硝化纤维素膜的重量增加百分数。
[0059]表1:在接枝GMA后，硝化纤维素膜的重暈增加
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如上所述在GMA接枝过程之后的重量提高支持在硝化纤维素膜上成功引入GMA。当在电子束辐射之前将膜首先用含水GMA溶液饱和时，未背衬的和PE-背衬的硝化纤维素膜二者的GMA接枝后的重量增加更大，因此，用于在硝化纤维素膜上接枝GMA的该步骤顺序用于所有后来的实验。相对于10 kGy，在50 kGy的电子束剂量下，当硝化纤维素膜用GMA接枝时，观察到重量增加稍微提高，如表I所示。
[0060]为了进一步证实在多孔膜上成功接枝GMA,使用PerkinElmer Spectrum 100 FTIR光谱仪(PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Sheraton, CT),通过 ATR FT-1R 分析硝化纤维素膜。在1H-NMR中，在GMA中和在Tween-20 ? (聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月硅酸酯)中的羧基峰作为单个组分分别出现在1717和1737 ηπΓ1。在硝化纤维素-GMA样品的光谱中，作为GMA引入的结果，羧基的产生得到约1730 CnT1的峰。通过ATR FT-1R，在硝化纤维素-GMA样品中，未检测到Tween-20? (聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月硅酸酯)。参见图3。
[0061]在10 kGy或50 kGy的电子束剂量下，在接枝GMA后，通过测量多个未背衬的和PE-背衬的硝化纤维素膜样品的重量增加百分数，证实如上所述的GMA接枝过程的再现性。结果呈现于表2，并且证明接枝到未背衬的或PE-背衬的硝化纤维素膜的GMA的量在10 kGy和50 kGy的电子束辐射二者下一致且可再现。如上所述，通过ATR-FTIR进一步证实硝化纤维素膜的GMA接枝观察到的一致的结果。在相同的实验条件下，接枝有GMA的不同样品的羧基峰值高度相同。参见图4。
[0062]表2:在GMA接枝后，硝化纤维素样品的可再现的重暈增加
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初始NMR分析指示GMA在硝化纤维素膜上的自聚合。通过DOSY NMR进一步证实在GMA和硝化纤维素骨架之间的共价链接。使用5 mm间接检测三轴梯度探针，在Varian NMRS 600光谱仪上运行丙酮溶解的硝化纤维素样品的1H DOSY NMR分析，在10 kGy或50 kGy的电子束辐射下，具有或不具有GMA接枝。如图5A所示，未经处理的硝化纤维素的水力半径为108±13 A0对于在50 kGy电子束福射的电子束剂量下接枝有GMA的硝化纤维素样品,硝化纤维素部分的水力半径为约22±2 A，其与GMA部分(23±3 A)相同。参见图5B。对于在kGy的电子束剂量下接枝有GMA的硝化纤维素样品，硝化纤维素部分的水力半径为80±10A，其与GMA部分(80±11 A)相同。参见图5C。在10 kGy和50 Kgy的电子束剂量二者下，在接枝有GMA的硝化纤维素样品中，通过DOSY NMR检测到痕量的Tween-20 ? (聚氧乙烯
(20)脱水山梨糖醇单月硅酸酯)。
[0063]硝化纤维素和GMA聚合物部分具有相同的水力半径，而与在硝化纤维素上接枝GMA的过程中使用的电子束剂量无关，这一观察结论指示GMA与硝化纤维素共价连接。
[0064]实施例2:接枝有GMA的改性硝化纤维素膜的性质
进一步表征如上所述的接枝有GMA的改性硝化纤维素膜，以评价膜厚度、毛细管上升和机械强度(例如，应力和应变)。如实施例1所述，使用10 kGy或50 kGy电子束剂量，用GMA接枝改性硝化纤维素膜。
[0065]使用Ontar1 Die 10 mmX 50 mm凹口冲床以从未改性的和改性的接枝GMA的硝化纤维素膜切割测试条，测试毛细管上升。将测试条放置在装置中，以保持测试膜条垂直。该装置还具有浅槽，以容纳测试流体(例如，蒸馏水)。记录40 μ?蒸馏水到40 mm高度的凹口的上升时间。测量未改性和改性硝化纤维素膜的复制样品的毛细管上升。结果在下面汇总于表3。
[0066]如表3中陈述的，相对于未改性的硝化纤维素膜，接枝有GMA的改性硝化纤维素膜呈现膜厚度提高15-20%和毛细管流速减慢约10%。此外，虽然电子束处理导致改性硝化纤维素膜的膜降解，接枝到这些硝化纤维素膜的GMA的聚合物改进它们的机械强度(例如，应力和应变)。
[0067]表3:接枝有GMA的改性硝化纤维素膜的表征
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使用 Instron Universal Testing Instrument 型号 4202 (Norwood, MA),实施机械强度测试。具体地，对具有6.5 mm宽度和51 mm标距的未改性和改性硝化纤维素膜样品测量应力和应变。测试速率为25 mm/分钟。测量未改性和改性硝化纤维素膜的复制样品的机械强度。结果汇总于表3。
[0068]实施例3:蛋白质与接枝有GMA的硝化纤维素膜的结合
测定在不同的反应条件下，未改性的和接枝有GMA的改性硝化纤维素膜二者结合蛋白质的能力。具体地，制备三种BSA的溶液:1) 5 mg/ml BSA(未标记的)和I mg/mlBSA-FITC，在 PBS 中，pH 7.4 ；2) 5 mg/ml BSA(未标记的)和 I mg/ml BSA-FITC，在磷酸钠中，pH 8.0;和3) I mg/ml BSA-FITC，在磷酸钠中，pH 8.00在30°C下，将未改性的或改性的接枝GMA的硝化纤维素膜在以上BSA溶液中培育2小时或15小时。膜随后用0.5%Tween-20? (例如，聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月硅酸酯)溶液洗涤，以除去BSA与硝化纤维素膜的非特异性结合，随后用去离子水简短漂洗。
[0069]通过荧光扫描和比色分析二者分析硝化纤维素膜，以评定蛋白质结合。使用GETyphoon 9400荧光扫描仪实施荧光扫描分析，其中激发/发射波长分别为485 nm和520nm。使用公开可得的ImageJ处理程序，实施硝化纤维素膜的比色分析，使用未改性的硝化纤维素膜作为基线。这些分析的结果示于图6。
[0070]总之，相对于能与未改性的硝化纤维素膜结合的蛋白质的量，接枝有GMA的改性硝化纤维素膜保持2-3倍多的蛋白质。测试的所有不同反应条件观察到该结果。此外，提高反应缓冲液的离子强度和PH改进蛋白质结合效率，使得结合的蛋白质的检测时间显著降低(例如，15小时降低至2小时)。
[0071]实施例4:在侧流测定中使用改性硝化纤维素膜
需要在固相材料上固定蛋白质(更特别是抗体)的侧流测定形成多种体外诊断测试的基础。该技术的一个常见的实例为市售可得的家庭受孕测试，其依赖于识别人绒膜促性腺激素(hCG)的抗体的固定，人绒膜促性腺激素为在受孕期间以高水平产生的激素。基于该受孕测试模式，设计评定接枝有GMA的改性硝化纤维素膜在侧流测定中的用途的技术。
[0072]根据本领域的标准技术，使用喷墨印刷，在未改性的或接枝有GMA的改性硝化纤维素膜上布置对照和测试线。含有甘油、Triton X-100和CMC的基础喷墨制剂用于制备对照线，该对照线还含有0.5 mg/ml山羊抗小鼠IgG。用于测试线的油墨另外含有I mg/ml的抗-HCG-α抗体。在改性硝化纤维素膜上印刷对照和测试线后24小时，将膜层叠在用GL187胶预处理的G&L聚酯背衬上。随后在硝化纤维素膜的顶部层叠27 mm Whatman CF7吸收垫。使用5 mmX1 mm冲床将膜切割成为5 mm长度的条。随后将条浸溃在10 μ?流动缓冲液中，该缓冲液含有多种浓度的hCG(0、40-80或400-800 mIU/ml)、0.5% Tween-20 ? (聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月硅酸酯)作为阻断剂和金纳米颗粒(AuNP)-抗-HCG-β抗体缀合物作为报道剂。20-30分钟后，完成测定。通过目视检查和通过ImageJ分析二者，评价比色报道信号强度，以得到定量比较。使用未改性的(NC)或接枝有GMA的改性硝化纤维素膜(NC-GMA)，使用侧流测定得到结果呈现于图7。
[0073]在使用未改性的硝化纤维素膜实施的测定中，在约3-5分钟内可见比色报道信号，而在使用接枝GMA的改性硝化纤维素膜的那些测定中，在仅约I分钟内可见比色报道信号。相对于未改性的硝化纤维素膜，对于接枝有GMA的改性硝化纤维素膜，观察到测试线的信号强度提高至250%。在测定的时间框期间，在未改性和改性硝化纤维素膜之间，没有观察到背景信号的差异。
[0074]实施例5:在侧流测定中，使用改性硝化纤维素膜，hCG的检测限度要求降低
使用喷墨印刷机，未改性的或改性硝化纤维素膜条印刷与hCG-α特异性结合的第一抗体。将未改性的或改性硝化纤维素膜条装配在5 _半杆侧流装置中。通过将不同浓度的hCG样品和与抗-hCG- β特异性结合的第二抗体混合，制备流动缓冲液。抗-hCG- β抗体与可检测物质金纳米颗粒缀合。流动缓冲液含有约0.1-500 mIU/ml的一系列hCG浓度。流动缓冲液还包含0.5% Tween-20? (例如，聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月硅酸酯)。
[0075]将5 mm半杆侧流装置浸溃在100 μ?流动缓冲液中，在三十(30)分钟内完成测定。使用LRE比色反射率读数器对使用未改性的硝化纤维素膜和接枝有GMA的聚合物的改性硝化纤维素膜得到的结果进行定量，以评定抗原-抗体结合。结果证明横跨整个hCG浓度范围的信号强度改进。此外，在比使用未改性的硝化纤维素膜条的相应的实施例中得到的那些显著更低的hCG水平下，检测到提高的信号强度。具体地，对于由接枝有GMA的改性硝化纤维素制成的半杆，检测限度为0.5 mIU/ml，它比改为使用未改性的硝化纤维素膜条在相同的方法中观察到的检测限度的1/5还低。这些结果提供以下的有力证据:使用包含例如GMA的聚合物涂层的改性硝化纤维素膜实施的免疫测定显著降低在样品中用于检测关注的抗原所需的分析物或生物分子的量。参见图8。
[0076]实施例6:在侧流测定中，使用改性硝化纤维素膜，hCG的检测时间降低
使用包含未改性的硝化纤维素膜和接枝有GMA聚合物涂层的改性的硝化纤维素膜的测试装置，实施基本如上所述的受孕侧流测定中信号产生的动力学。通过在含有150 mIU/ml hCG、金纳米颗粒标记的抗-hCG- β IgG和0.5%吐温20的流动缓冲液中浸溃侧流装置，实施这些分析。经30分钟在不同的时间点获取图像，通过Image J软件测量在侧流装置上的信号线强度。
[0077]结果呈现于图9，证明当使用接枝有GMA聚合物涂层的改性硝化纤维素膜实施测定时，耗时20秒钟目测到阳性信号(例如，存在hCG的信号)。与之相反，当使用未改性的硝化纤维素膜实施侧流测定时，在2分钟时得到可检测结果，为当侧流装置包含具有GMA的聚合物涂层的硝化纤维素膜时目测到测试结果所需时间的6倍长。在其中诊断时间可能对于患者结果至关重要的体外诊断中，以及在其中还期望显著较快的检测时间的那些情况(例如，家庭受孕测试)中，降低的检测时间代表明显的优点。
[0078]虽然本文已说明和描述了本发明的仅某些特征，但本领域技术人员可以想到许多修改和变化。因此，应理解的是，所附权利要求旨在涵盖落入本发明的真实精神内的所有这些修改和变化。
[0079]本文通过引用结合所有出版物、专利公开和专利，如同明确并且分别地指示通过弓I用结合每一个单独出版物或专利的相同程度。
【权利要求】
1.一种具有式(I)的结构的多孔膜，其中式(I)为:M...........1i(A)s

链接


B 式⑴ 其中A为电子束(电子束)反应性部分，其中聚(A)x为所述电子束反应性部分的聚合物，X为存在于所述聚(A)x聚合物中的A单体的数量；其中链接在所述聚(A)x聚合物和B基团之间形成键合，并且其中聚(A)x-链接-B为共价接枝到所述多孔膜的聚合物涂层。
2.权利要求1的多孔膜，其中所述膜选自硝化纤维素膜、纤维素膜、乙酸纤维素膜、再生纤维素膜、硝化纤维素混合酯膜、聚醚砜膜、尼龙膜、聚烯烃膜、聚酯膜、聚碳酸酯膜、聚丙烯膜、聚偏二氟乙烯膜、聚乙烯膜、聚苯乙烯膜、聚氨酯膜、聚苯醚膜、四氟乙烯-六氟丙烯共聚物膜和上述膜中的两种或更多种的任何组合。
3.权利要求1的多孔膜，其中所述电子束反应性部分A选自甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯、丙烯酰胺、乙烯基酮、苯乙烯、乙烯基醚、含乙烯基的部分、含烯丙基的部分、基于苄基的化合物、基于叔碳(CHR3)的化合物和上述官能部分中的两种或更多种的任何组合。
4.权利要求1的多孔膜，其中所述链接为酯、脂族、芳族、亲水性化合物、杂芳族化合物或上述链接中的两种或更多种的任何组合。
5.权利要求1的多孔膜，其中所述B基团选自含环氧基团的化合物、亲水性部分、炔基团、羟基、胺基团、卤素基团、甲苯磺酰基、甲磺酰基、叠氮基、异氰酸酯基团、硅烷基团、二硅氮烷、巯基、羧酸酯、异腈、亚磷酰胺、氮宾、氢化甲硅烷基、腈、烷基膦酸酯和上述官能部分中的两种或更多种的任何组合。
6.权利要求5的多孔膜，其中B基团为含环氧基团的化合物。
7.权利要求6的多孔膜，其中所述含环氧基团的化合物为缩水甘油基甲基丙烯酸酯(GMA)、缩水甘油基丙烯酸酯、乙烯基缩水甘油基醚、烯丙基缩水甘油基醚、甲代烯丙基缩水甘油基醚或它们的任何组合。
8.权利要求7的多孔膜，其中所述含环氧基团的化合物为GMA。
9.权利要求1的多孔膜，其中所述多孔膜为硝化纤维素膜。
10.权利要求9的硝化纤维素膜，其中关注的生物分子固定在所述硝化纤维素膜上。
11.权利要求10的多孔膜，其中所述关注的生物分子为蛋白质或核酸。
12.权利要求11的多孔膜，其中所述关注的生物分子为蛋白质。
13.权利要求12的多孔膜，其中所述蛋白质为抗体。
14.一种多孔膜，所述多孔膜包含至少一种接枝到所述多孔膜的聚合物的涂层，其中在所述多孔膜上的所述聚合物涂层通过任何方法通过产生自由基而产生，所述方法包括电子束辐射、紫外辐射、Y辐射、电晕放电或化学引发剂，并且其中所述聚合物涂层与所述多孔膜永久结合。
15.权利要求14的多孔膜，其中所述多孔膜选自硝化纤维素膜、纤维素膜、乙酸纤维素膜、再生纤维素膜、硝化纤维素混合酯膜、聚醚砜膜、尼龙膜、聚烯烃膜、聚酯膜、聚碳酸酯膜、聚丙烯膜、聚偏二氟乙烯膜、聚乙烯膜、聚苯乙烯膜、聚氨酯膜、聚苯醚膜、四氟乙烯-六氟丙烯共聚物膜和上述膜中的两种或更多种的任何组合。
16.权利要求14的多孔膜，其中所述产生自由基通过电子束辐射实施。
17.权利要求14的多孔膜，其中与所述多孔膜结合的所述聚合物涂层为聚合涂层，所述聚合涂层包含连接到电子束反应性部分的聚合物的多孔膜和在进一步连接到官能团的电子束反应性部分的聚合物之间的链接。
18.权利要求17的多孔膜，其中所述电子束反应性部分选自甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯、丙烯酰胺、乙烯基酮、苯乙烯、乙烯基醚、含乙烯基的部分、含烯丙基的部分、基于苄基的化合物、基于叔碳(CHR3)的化合物和上述部分中的两种或更多种的任何组合。
19.权利要求17的多孔膜，其中所述官能部分选自含环氧基团的化合物、聚乙二醇(PEG)、炔基团、羟基、胺基团、卤素基团、甲苯磺酰基、甲磺酰基、叠氮基、异氰酸酯基团、硅烷基团、二硅氮烷、巯基、羧酸酯、异腈、亚磷酰胺、氮宾、氢化甲硅烷基、腈、烷基膦酸酯和上述官能部分中的两种或更多种的任何组合。
20.权利要求14的多孔膜，其中所述链接选自脂族化合物、芳族化合物、杂芳族化合物和上述链接中的两种或更多种的任何组合。
21.权利要求14的多孔膜，其中所述聚合物涂层与所述多孔膜共价连接。
22.权利要求19的多孔膜，其中所述聚合物涂层包含含环氧基团的化合物。
23.权利要求22的多孔膜，其中所述含环氧基团的化合物为GMA、缩水甘油基丙烯酸酯、乙烯基缩水甘油基醚、烯丙基缩水甘油基醚或甲代烯丙基缩水甘油基醚或它们的任何组合。
24.权利要求23的多孔膜，其中所述含环氧基团的化合物为GMA。
25.权利要求14的多孔膜，其中所述多孔膜为硝化纤维素膜。
26.权利要求14的多孔膜，其中所述多孔膜的孔尺寸为0.01-50微米。
27.权利要求14的多孔膜，其中相对于未改性的硝化纤维素膜，所述多孔膜显示膜厚度、机械强度或重量的提高。
28.权利要求14的多孔膜，其中关注的生物分子固定在所述多孔膜上。
29.权利要求28的多孔膜，其中所述关注的生物分子为蛋白质或核酸。
30.权利要求29的多孔膜，其中所述关注的生物分子为蛋白质。
31.权利要求30的多孔膜，其中所述蛋白质为抗体。
32.权利要求28的多孔膜，其中相对于生物分子于未改性的多孔膜的固定，所述关注的生物分子显示改进的于多孔膜固定。
33.权利要求14的多孔膜，其中所述多孔膜包含至少一种背衬载体。
34.权利要求33的多孔膜，其中所述背衬载体为聚酯。
35.权利要求14的多孔膜，其中所述多孔膜无背衬。
36.权利要求14的多孔膜，其中所述多孔膜包含接枝到所述多孔膜的至少一种聚合物涂层的第一涂层并且进一步包含在所述多孔膜上固定的亲水性化合物。
37.权利要求36的多孔膜，其中所述亲水性化合物为聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇、羟基、带负电荷的离子基团、带正电荷的离子基团、两性离子基团或它们的任何组合。
38.一种具有式(II)的结构的固相材料，其中式(II)为:因相讨料.一It(A)x





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e 式(II) 其中A为电子束反应性部分，其中聚(A)xS所述电子束反应性部分的聚合物，X为存在于所述聚(A)x聚合物中的A单体的数量；其中所述链接在所述聚(八^聚合物和B基团之间形成键合，并且其中所述聚(A)x-链接-B为共价接枝到所述固相材料的聚合物涂层。
39.权利要求38的固相材料，其中所述固相材料选自玻璃珠、玻璃纤维、胶乳珠、节点、块状物、纳米颗粒、空心膜管和上述固相材料中的两种或更多种的任何组合。
40.权利要求38的固相材料，其中所述聚合物涂层与所述固相材料共价连接。
41.权利要求38的固相材料，其中所述聚合物涂层为含环氧基团的化合物。
42.权利要求42的固相材料，其中所述含环氧基团的化合物为GMA、缩水甘油基丙烯酸酯、乙烯基缩水甘油基醚、烯丙基缩水甘油基醚、甲代烯丙基缩水甘油基醚。
43.权利要求43的固相材料，其中所述含环氧基团的化合物为GMA。
44.一种多孔膜或固相材料，其包含在所述多孔膜或所述固相材料上接枝的含环氧基团的化合物的聚合物。
45.权利要求44的多孔膜或固相材料，其中所述含环氧基团的化合物为GMA。
46.一种用于实施免疫测定的装置，所述装置包含改性多孔膜或固相材料，所述改性多孔膜或固相材料包含在所述多孔膜或所述固相材料上接枝的含环氧基团的化合物的聚合物。
47.权利要求47的装置，其中所述含环氧基团的化合物为GMA并且所述多孔膜为硝化纤维素膜。
48.权利要求47的装置，其中所述免疫测定为侧流免疫测定。
49.一种用于制备改性多孔膜的方法，所述方法包括: a)提供未改性的多孔膜； b)在聚(A)x-链接-B的溶液中浸没所述多孔膜； c)其中A为电子束(电子束)反应性部分，其中聚(A)x为所述电子束反应性部分的聚合物，X为存在于所述聚(A)x聚合物中的A单体的数量；并且其中所述链接在所述聚(A)x聚合物和B基团之间形成键合； d)使所述多孔膜暴露于电子束辐射；和 e)干燥所述多孔膜，从而制备改性多孔膜。
50.权利要求49的方法，其中所述膜选自硝化纤维素膜、纤维素膜、乙酸纤维素膜、再生纤维素膜、硝化纤维素混合酯膜、聚醚砜膜、尼龙膜、聚烯烃膜、聚酯膜、聚碳酸酯膜、聚丙烯膜、聚偏二氟乙烯膜、聚乙烯膜、聚苯乙烯膜、聚氨酯膜、聚苯醚膜、四氟乙烯-六氟丙烯共聚物膜和上述膜中的两种或更多种的任何组合。
51.权利要求50的方法，其中所述多孔膜为硝化纤维素膜。
52.权利要求49的方法，其中所述电子束反应性部分A选自甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯、丙烯酰胺、乙烯基酮、苯乙烯、乙烯基醚、含乙烯基的部分、含烯丙基的部分、基于苄基的化合物、基于叔碳(CHR3)的化合物和上述官能部分中的两种或更多种的任何组合。
53.权利要求49的方法，其中所述链接为酯、脂族、芳族、亲水性化合物、杂芳族化合物或上述链接中的两种或更多种的任何组合。
54.权利要求49的方法，其中B选自含环氧基团的化合物、聚乙二醇(PEG)、炔基团、羟基、胺基团、卤素基团、甲苯磺酰基、甲磺酰基、叠氮基、异氰酸酯基团、硅烷基团、二硅氮烷、巯基、羧酸酯、异腈、亚磷酰胺、氮宾、氢化甲硅烷基、腈、烷基膦酸酯和上述官能部分中的两种或更多种的任何组合。
55.权利要求49的方法，其中所述聚(A)x-链接-B的溶液为包含含环氧基团的化合物的含水溶液。
56.权利要求55的方法，其中所述含环氧基团的化合物为缩水甘油基甲基丙烯酸酯(GMA)、缩水甘油基丙烯酸酯、乙烯基缩水甘油基醚、烯丙基缩水甘油基醚、甲代烯丙基缩水甘油基醚或它们的任何组合。
57.权利要求56的方法，其中所述GMA的含水溶液还包含表面活性剂以提高GMA在水中的溶解度。
58.权利要求57的方法，其中所述表面活性剂为非离子表面活性剂。
59.权利要求58的方法，其中所述非离子表面活性剂为聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月硅酸酯。
60.权利要求55的方法其中所述GMA的含水溶液包含约2%GMA(v/v)_约10% GMA。
61.权利要求49的方法，其中所述电子束辐射剂量为IkGy-50 kGy。
62.权利要求55的方法，其中所述含环氧基团的化合物为GMA。
63.一种改进使用免疫测定在生物学样品中检测生物分子的方法，所述方法包括: a)提供具有式(I)的结构的改性多孔膜，其中式(I)为:M........- ?κ(Α),链接B 式⑴ 其中A为电子束(电子束)反应性部分，其中聚(A)x为所述电子束反应性部分的聚合物，X为存在于所述聚(A)x聚合物中的A单体的数量；其中所述链接在所述聚(A)x聚合物和B基团之间形成键合，并且其中所述聚(A)x-链接-B为共价接枝到所述多孔膜的聚合物涂层； b)在可含有所述生物分子的所述生物学样品中培育所述改性多孔膜； c)洗涤所述改性多孔膜，以除去未结合的材料； d)测量与所述改性多孔膜结合的生物分子和与未改性的多孔膜结合的生物分子；和 e)比较与所述改性多孔膜结合的生物分子和与所述未改性的多孔膜结合的生物分子，从而改进在所述生物学样品中所述生物分子的检测。
64.权利要求63的方法,其中相对于生物分子在未改性的多孔膜上的固定,所述生物分子在改性多孔膜上显示改进的固定。
65.权利要求63的方法，其中所述膜选自硝化纤维素膜、纤维素膜、乙酸纤维素膜、再生纤维素膜、硝化纤维素混合酯膜、聚醚砜膜、尼龙膜、聚烯烃膜、聚酯膜、聚碳酸酯膜、聚丙烯膜、聚偏二氟乙烯膜、聚乙烯膜、聚苯乙烯膜、聚氨酯膜、聚苯醚膜、四氟乙烯-六氟丙烯共聚物膜和上述膜中的两种或更多种的任何组合。
66.权利要求63的方法，其中所述电子束反应性部分A选自甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯、丙烯酰胺、乙烯基酮、苯乙烯、乙烯基醚、含乙烯基的部分、含烯丙基的部分、基于苄基的化合物、基于叔碳(CHR3)的化合物和上述官能部分中的两种或更多种的任何组合。
67.权利要求63的方法，其中所述链接为酯、脂族、芳族、亲水性化合物、杂芳族化合物或上述链接中的两种或更多种的任何组合。
68.权利要求63的方法，其中所述B基团选自含环氧基团的化合物、聚乙二醇(PEG)、炔基团、羟基、胺基团、卤素基团、甲苯磺酰基、甲磺酰基、叠氮基、异氰酸酯基团、硅烷基团、二硅氮烷、巯基、羧酸酯、异腈、亚磷酰胺、氮宾、氢化甲硅烷基、腈、烷基膦酸酯和上述官能部分中的两种或更多种的任何组合。
69.权利要求68的方法，其中所述B基团为含环氧基团的化合物。
70.权利要求69的方法，其中所述含环氧基团的化合物为缩水甘油基甲基丙烯酸酯(GMA)、缩水甘油基丙烯酸酯、乙烯基缩水甘油基醚、烯丙基缩水甘油基醚、甲代烯丙基缩水甘油基醚或它们的任何组合。
71.权利要求70的方法，其中所述含环氧基团的化合物为GMA。
72.权利要求63的方法，其中所述生物分子为DNA、RNA或蛋白质。
73.权利要求72的方法，其中所述生物分子为蛋白质。
74.权利要求73的方法，其中所述蛋白质为抗体。
75.权利要求63的方法，其中测量生物分子结合包括用可检测物质标记生物分子或与所述生物分子特异性结合的分子。
76.权利要求75的方法，其中所述可检测物质为酶、辅基、荧光染料、发光材料、生物发光材料、放射性材料或金颗粒。
77.权利要求76的方法，其中所述可检测物质提供关于生物分子水平的定量结果。
78.权利要求76的方法，其中所述可检测物质提供关于生物分子水平的定性结果。
79.权利要求63的方法，其中所述洗涤所述改性多孔膜在还包含非离子表面活性剂的溶液中实施，并且其中所述非离子表面活性剂为聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月硅酸酯。
80.权利要求63的方法，其中所述免疫测定选自侧流免疫测定、放射性免疫测定、酶免疫测定(EIA)、酶联免疫吸附剂测定(ELISA)、荧光免疫测定和化学发光免疫测定。
81.权利要求63的方法，其中所述生物学样品为血液、血清、淋巴、尿、唾液、粘液、身体分泌物、细胞或组织。
82.权利要求63的方法，其中所述方法使用所述多孔膜在固体载体上实施，并且其中所述固体载体为微量滴定板或载玻片。
83.权利要求63的方法，其中所述方法允许检测所述生物学样品中的多于一种生物分子。
84.权利要求63的方法，其中所述生物分子为与疾病关联的抗原。
85.权利要求84的方法，其中所述疾病为细菌性疾病、病毒性疾病或真菌性疾病。
86.一种用于降低检测在生物学样品中生物分子的存在所需的生物分子水平的方法，所述方法包括: a)提供具有式(I)的结构的改性多孔膜，其中式(I)为:




M...........链接


B 式⑴ 其中A为电子束反应性部分，其中聚(A)xS所述电子束反应性部分的聚合物，X为存在于所述聚(A)x聚合物中的A单体的数量；其中所述链接在所述聚(八^聚合物和B基团之间形成键合，并且其中所述聚(A)x-链接-B为共价接枝到所述多孔膜的聚合物涂层； b)在所述生物学样品中培育所述改性多孔膜，以确定是否所述生物学样品包含所述生物分子； c)洗涤所述改性多孔膜，以除去未结合的材料；和 d)测量与所述改性多孔膜结合的生物分子和与未改性的多孔膜结合的生物分子，其中所述生物分子呈现与所述改性多孔膜改进的固定，从而降低检测生物学样品中的生物分子所需的生物分子的量。
87.权利要求86的方法，其中所述生物分子为DNA、RNA或蛋白质。
88.权利要求87的方法，其中所述生物分子为蛋白质。
89.权利要求88的方法，其中所述蛋白质为抗体。
90.一种改进生物分子在多孔膜上的固定的方法，所述方法包括: a)提供具有式(I)的结构的改性多孔膜，其中式(I)为:



M...........聚(.从




I

链接


B 式⑴ 其中A为电子束反应性部分，其中聚(A)xS所述电子束反应性部分的聚合物，X为存在于所述聚(A)x聚合物中的A单体的数量；其中所述链接在所述聚(八^聚合物和B基团之间形成键合，并且其中所述聚(A)x-链接-B为共价接枝到所述多孔膜的聚合物涂层； b)在包含所述生物分子的样品中培育所述改性多孔膜； c)洗涤所述改性多孔膜，以除去未结合的材料； d)测量与所述改性多孔膜结合的生物分子和与未改性的多孔膜结合的生物分子；和 e)比较与所述改性多孔膜结合的生物分子和与所述未改性的多孔膜结合的生物分子，其中相对于所述生物分子在所述未改性的多孔膜上的固定，所述生物分子在所述改性多孔膜上的固定得以改进。
91.权利要求90的方法，其中所述生物分子为蛋白质。
92.一种降低使用免疫测定检测生物学样品中生物分子存在的检测时间的方法，所述方法包括: a)提供具有式(I)的结构的改性多孔膜，其中式(I)为:5.?— ?fl{ A)^碰B 式⑴ 其中A为电子束反应性部分，其中聚(A)xS所述电子束反应性部分的聚合物，X为存在于所述聚(A)x聚合物中的A单体的数量；其中所述链接在所述聚(八^聚合物和B基团之间形成键合，并且其中所述聚(A)x-链接-B为共价接枝到所述多孔膜的聚合物涂层； b)在可含有所述生物分子的所述生物学样品中培育所述改性多孔膜； c)洗涤所述改性多孔膜，以除去未结合的材料； d)测量与所述改性多孔膜结合的生物分子和与未改性的多孔膜结合的生物分子；和 e)比较在多个时间点与所述改性多孔膜结合的生物分子和与未改性的多孔膜结合的生物分子，其中所述生物分子与所述改性多孔膜更快速结合，从而降低检测在所述生物学样品中的所述生物分子的存在所需的时间。
93.一种用于降低实施免疫测定所需的抗体量的方法，所述免疫测定使用多孔膜用于固定所述抗体，其中用于所述免疫测定的所述多孔膜具有式(I)的结构，其中式(I)为:■..........lt{AK5链接B 式⑴ 其中所述抗体呈现与式(I)的多孔膜改进的固定。
94.权利要求93的方法，其中降低实施所述免疫测定所需的抗体的量降低实施所述免疫测定的成本。
95.一种用于改进免疫测定的灵敏度的方法，所述免疫测定使用多孔膜用于固定生物分子，其中用于所述免疫测定的所述多孔膜具有式(I)的结构，其中式(I)为:,1?...........?|<.| A )、I链接B 式⑴。
96.权利要求95的方法，其中所述生物分子为蛋白质。
97.权利要求96的方法，其中所述蛋白质为抗体。
【文档编号】B01D71/06GK104136106SQ201280070836
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2012年12月27日 优先权日:2011年12月29日
【发明者】B.李, C.E.奥尔森, D.R.摩尔 申请人:通用电气公司