本发明属于微流控技术领域，涉及一种PDMS微流控芯片表面多聚赖氨酸修饰方法。
背景技术：
微流控是一种精确控制和操控微尺度流体，尤其特指亚微米结构的技术。微流控芯片将样品制备、反应、分离、检测等操作集成到一微米芯片上，自动完成分析，具有所需样品少、体积小便于携带、检测速度快、可高通量筛选等特点，微流控在生物、医学、化学、材料、电子等领域得到了快速发展。
制备微流控芯片最重要的程序是蛋白质在基底的固定，蛋白质能否高效牢固的固定在基底载体上，并保持较好的生物活性是决定芯片质量的关键。聚二甲基硅氧烷(PDMS)具有荧光背景低、无毒、易键合、价格低廉等特点，在微流控芯片得到了广泛的应用。但是，基片表面须经修饰才能更牢固的固定蛋白质并保持其原有的功能活性，其中较常见也较有效的修饰方法是多聚赖氨酸法。
多聚赖氨酸是多肽类分枝分子，相对分子量较大，经其修饰的基片表面较粗糙、自由度高，导致与固定的蛋白质或其他分子的结合容量高；经多聚赖氨酸修饰的芯片信噪比较高、点样均一、点间变异系数低，且操作简单方便，广泛应用于蛋白质芯片等基底的修饰。然而多聚赖氨酸修饰的芯片基底敏感度不佳，最低检测限较高，尤其是多聚赖氨酸与芯片基底物理吸附而非共价结合，导致微流控通道中与蛋白质的动态结合不牢固，信号检出值较低。
因此，在本领域中期望开发一种提供多聚赖氨酸修饰的芯片基底敏感度的方法。
技术实现要素：
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种PDMS微流控芯片表面多聚赖氨酸修饰方法。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种PDMS微流控芯片表面多聚赖氨酸修饰方法，所述方法为：对PDMS微流控芯片进行等离子体活化处理和硅烷化处理，而后在交联剂作用下与多聚赖氨酸共价结合，实现对PDMS微流控芯片表面的多聚赖氨酸修饰。
优选地，所述等离子体活化处理为：PDMS微流控芯片经初步超声清洗后用等离子体活化处理1-15min，例如2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min或14min，优选为3-10min。
优选地，所述等离子体活化处理时等离子体发生功率为10-20kw，例如11kw、12kw、13kw、14kw、15kw、16kw、17kw、18kw或19kw；等离子体空气流量200mL/min。
优选地，所述超声清洗为利用去离子水进行超声清洗。
在本发明中，所述硅烷化处理为将等离子体活化处理后的PDMS微流控芯片置于硅烷化试剂溶液中进行硅烷化处理得到硅烷化处理的PDMS微流控芯片。
优选地，所述硅烷化试剂为3-氨丙基三甲氧基硅氧烷、二氯二甲基硅烷、三甲基氯硅烷或六甲基二硅氨烷中的任意一种或至少两种的组合，优选为3-氨丙基三甲氧基硅氧烷。
优选地，所述硅烷化试剂溶液为硅烷化试剂的乙醇溶液，浓度为0.1-10％，例如0.2％、0.3％、0.5％、0.8％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％或9％，优选为1-2％。
优选地，所述硅烷化处理的温度为50-70℃，例如52℃、55℃、57℃、59℃、60℃、62℃、64℃、66℃、68℃或69℃，优选为60-65℃。
优选地，所述硅烷化处理的时间为25-90min，例如26min、28min、30min、35min、40min、45min、50min、55min、60min、65min、70min、75min、80min、85min或88min，优选为45-75min。
在本发明中硅烷化处理后得到的PDMS微流控芯片可以用氮气吹干，用水清洗，而后再用氮气吹干，备用。
优选地，所述交联剂为1-乙基-3(3-二甲氨丙基)碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺、戊二醛、4-马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯、3-马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯中的任意一种或至少两种的组合，优选为基-3(3-二甲氨丙基)碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺。
优选地，所述交联剂的用量使得其在反应体系中的浓度为0.05-10mg/mL，例如0.06mg/mL、0.08mg/mL、0.1mg/mL、0.3mg/mL、0.5mg/mL、0.8mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL或9mg/mL，优选为0.1-1mg/mL。
优选地，所述多聚赖氨酸溶液为多聚赖氨酸硼酸溶液或多聚赖氨酸水溶液。
优选地，所述多聚赖氨酸的重均分子量为10万-100万，例如12万、15万、20万、25万、30万、35万、40万、45万、50万、55万、60万、65万、70万、75万、80万、85万、90万、95万或98万，优选为15万-30万。
优选地，所述多聚赖氨酸溶液的浓度为0.1-10mg/mL，例如0.2mg/mL、0.5mg/mL、0.8mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL或9mg/mL，优选为1-10mg/mL。
优选地，多聚赖氨酸溶液为0.2M、pH8.4的多聚赖氨酸硼酸溶液。
本发明所述任一组成成分的浓度不是指所使用的原料的自身浓度，而是将其加入至反应体系后得到的该组分的终浓度。
本发明所述芯片修饰方法同样适用于蛋白芯片、DNA芯片等的表面修饰。
作为本发明的优选技术方案，所述PDMS微流控芯片表面多聚赖氨酸修饰方法具体包括以下步骤：
(1)将PDMS微流控芯片经初步超声清洗，而后用等离子体活化处理1-15min，得到等离子体活化处理后的PDMS微流控芯片；
(2)将等离子体活化处理后的PDMS微流控芯片置于硅烷化溶液中，50-70℃下处理25-90min，得到硅烷化处理的PDMS微流控芯片；
(3)将硅烷化处理的PDMS微流控芯片置于多聚赖氨酸溶液中，在交联剂作用下进行共价结合，实现对PDMS微流控芯片表面的多聚赖氨酸修饰。
另一方面，本发明提供了由本发明所述的修饰方法得到的多聚赖氨酸表面修饰的PDMS微流控芯片。
本发明的修饰方法克服了多聚赖氨酸修饰的芯片基底敏感度不佳，最低检测限较高，尤其是多聚赖氨酸与芯片基底的物理吸附导致微流控通道中与蛋白质的动态结合不牢固，信号检出值较低等问题。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明通过对PDMS微流控芯片进行等离子体处理以及硅烷化处理，再与多聚赖氨酸偶联，多聚赖氨酸以共价结合的方式牢固结合在芯片表面，形成了能高效固定蛋白质的微流控芯片。这样修饰得到的芯片不但保留有信噪比高、结合容量高、点间变异系数低等多聚赖氨酸修饰法的一般优点，更重要的是解决了多聚赖氨酸以物理吸附的方式与芯片结合不牢固，尤其是在微流控的应用中易脱落的问题。
附图说明
图1为测试本发明的多聚赖氨酸表面修饰的PDMS微流控芯片的性能时使用的微流控试剂卡示意图；
图2为利用荧光定量分析仪检测实施例1和对比例1-4制备的微流控芯片在不同抗体包被浓度下的荧光强度信号值的结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
在本实施例中，通过以下方法进行PDMS微流控芯片表面多聚赖氨酸修饰，具体包括以下步骤：
(1)将PDMS微流控芯片用去离子水进行超声清洗，而后用等离子体活化处理10min，等离子体发生功率为10kw，等离子体空气流量200mL/min，得到等离子体活化处理后的PDMS微流控芯片；
(2)将等离子体活化处理后的PDMS微流控芯片置于浓度为1％的APTMS溶液中，65℃下处理60min，得到硅烷化处理的PDMS微流控芯片，氮气吹干，用水清洗，而后再用氮气吹干，备用。
(3)将硅烷化处理的PDMS微流控芯片置于多聚赖氨酸溶液中，在交联剂作用下进行共价结合，交联剂的用量使得其在反应体系中的浓度为1mg/mL，多聚赖氨酸溶液为多聚赖氨酸硼酸溶液，多聚赖氨酸的分子量为15万，多聚赖氨酸溶液的浓度为1mg/mL，得到多聚赖氨酸表面修饰的PDMS微流控芯片。
实施例2
在本实施例中，通过以下方法进行PDMS微流控芯片表面多聚赖氨酸修饰，具体包括以下步骤：
(1)将PDMS微流控芯片用去离子水进行超声清洗，而后用等离子体活化处理3min，等离子体发生功率为20kw，等离子体空气流量250mL/min，得到等离子体活化处理后的PDMS微流控芯片；
(2)将等离子体活化处理后的PDMS微流控芯片置于浓度为2％的APTMS溶液中，60℃下处理45min，得到硅烷化处理的PDMS微流控芯片，氮气吹干，用水清洗，而后再用氮气吹干，备用。
(3)将硅烷化处理的PDMS微流控芯片置于多聚赖氨酸溶液中，在交联剂作用下进行共价结合，交联剂的用量使得其在反应体系中的浓度为0.1mg/mL，多聚赖氨酸溶液为多聚赖氨酸硼酸溶液，多聚赖氨酸的分子量为30万，多聚赖氨酸溶液的浓度为1mg/mL，得到多聚赖氨酸表面修饰的PDMS微流控芯片。
实施例3
在本实施例中，通过以下方法进行PDMS微流控芯片表面多聚赖氨酸修饰，具体包括以下步骤：
(1)将PDMS微流控芯片用去离子水进行超声清洗，而后用等离子体活化处理15min，等离子体发生功率为15kw，等离子体空气流量200mL/min，得到等离子体活化处理后的PDMS微流控芯片；
(2)将等离子体活化处理后的PDMS微流控芯片置于浓度为5％的APTMS溶液中，50℃下处理90min，得到硅烷化处理的PDMS微流控芯片，氮气吹干，用水清洗，而后再用氮气吹干，备用。
(3)将硅烷化处理的PDMS微流控芯片置于多聚赖氨酸溶液中，在交联剂作用下进行共价结合，交联剂的用量使得其在反应体系中的浓度为10mg/mL，多聚赖氨酸溶液为多聚赖氨酸硼酸溶液，多聚赖氨酸的分子量为90万，多聚赖氨酸溶液的浓度为0.1mg/mL，得到多聚赖氨酸表面修饰的PDMS微流控芯片。
实施例4
在本实施例中，通过以下方法进行PDMS微流控芯片表面多聚赖氨酸修饰，具体包括以下步骤：
(1)将PDMS微流控芯片用去离子水进行超声清洗，而后用等离子体活化处理1min，等离子体发生功率为10kw，等离子体空气流量300mL/min，得到等离子体活化处理后的PDMS微流控芯片；
(2)将等离子体活化处理后的PDMS微流控芯片置于浓度为10％的APTMS溶液中，70℃下处理25min，得到硅烷化处理的PDMS微流控芯片，氮气吹干，用水清洗，而后再用氮气吹干，备用。
(3)将硅烷化处理的PDMS微流控芯片置于多聚赖氨酸溶液中，在交联剂作用下进行共价结合，交联剂的用量使得其在反应体系中的浓度为0.05mg/mL，多聚赖氨酸溶液为多聚赖氨酸硼酸溶液，多聚赖氨酸的分子量为10万，多聚赖氨酸溶液的浓度为10mg/mL，得到多聚赖氨酸表面修饰的PDMS微流控芯片。
对比例1
本对比例与实施例1不同之处在于，在本对比例中不对PDMS微流控芯片进行等离子体活化，而是将PDMS微流控芯片用去离子水进行超声清洗后置于浓度为1％的APTMS溶液中进行硅烷化处理，硅烷化处理以及与多聚赖氨酸共价结合的过程以及条件的选择均与实施例相同。
对比例2
本对比例与实施例1不同之处在于，在本对比例中不进行等离子体活化处理后的PDMS微流控芯片进行硅烷化处理，除此之外，其余处理过程与条件的选择均与实施例相同。
对比例3
本对比例与实施例1不同之处在于，在本对比例中不进行等离子体活化处理及硅烷化处理，直接进行多聚赖氨酸处理，除此之外，其余处理过程与条件的选择均与实施例相同。
对比例4
本对比例与实施例1不同之处在于，在本对比例中不进行等离子体活化处理、硅烷化处理以及多聚赖氨酸处理，不做任何处理的PDMS基片进行检测，其余处理过程与条件的选择均与实施例相同。
对实施例1-4以及对比例1-4制备的多聚赖氨酸表面修饰的PDMS微流控芯片的性能进行测试，考察多聚赖氨酸共价修饰的微流控芯片信噪比、灵敏度、变异系数以及结合牢固性等性质。
测试方法如下：用多聚赖氨酸表面修饰的PDMS微流控芯片基片制备可层析的微流控试剂卡(如图1所示)，点酶仪将5μL浓度分别为0.01、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5mg/mL的人IgG抗体(PBST缓冲液稀释)均匀点样到试剂卡的相应区域，阴性对照选用等量的PBST缓冲液，在温度37℃、湿度50％左右静置2h。用水溶的10％牛血清白蛋白(BSA)封闭30min，水洗3次，晾干。向IgG抗体包被处加入10ul荧光标记的羊抗人IgG，37℃静置1h，PBST洗。
用Lepu Quant-Fluo 800荧光定量分析仪检测(该仪器将荧光信号值转化为电信号值(Int(mV))输出)，3个试剂卡为一组，一组所测得的平均信号值减去阴性对照组(PBST)的平均信号值即为最终的信号值。
用Lepu Quant-Fluo 800荧光定量分析仪检测得到的信号值计算变异系数：
变异系数(CV％)＝标准差/平均值×100％。
测试结果如图2所示，相比对比例1-4，实施例(多聚赖氨酸共价修饰得到的微流控芯片)具有较好的检测结果，实施例平均信号值均高于对比例，在动态层析过程中仍检测到了较高的信号值，说明实施例中多聚赖氨酸与基片的共价结合的牢固程度大于物理吸附；尤其是实施例1检测到的平均信号值最高，在IgG浓度为0.01mg/mL时就可检测到荧光值，灵敏度好；在浓度0.05mg/mL时就达到了平台期，说明实施例信噪比较高、结合容量高。
表1为实施例1-4和对比例1-4修饰下的微流控芯片在不同抗体包被浓度下的信号值变异系数。实施例1-4修饰下，芯片的平均变异系数在10％的范围内，低于对比例。
表1
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。