一种具有血液净化功能的可逆自组装表面及其制备方法与流程

本发明涉及血液净化材料，特别涉及一种具有血液净化功能的可逆自组装表面及其制备方法。

背景技术：

肝是人体内的重要器官，它对体内的毒素如重金属离子、胆红素(Bilirubin)等具有解毒作用，很多疾病如各型病毒性肝炎、缺氧性肝损伤等易导致肝功能衰竭，肝功能衰竭后，解毒作用降低，体内毒素如胆红素的含量升高。人们自1918年起便对血液净化展开一系列研究，并发展了包括血液透析、血液过滤、血液灌流在内的多种净化方法，这些方法在净化原理上都遵循了活性炭、合成树脂等吸附材料对血液中毒素的非特异性或特异性吸附原则。临床上针对胆红素的吸附，广泛使用的是胆红素吸附器，即将高胆红素血症患者的血液引出体外，经血浆分离器分离出血浆，进行血浆吸附，清除患者体内的胆红素，达到净化血液的目的。常用的胆红素吸附剂有合成树脂吸附剂和亲和性吸附剂。

目前，胆红素吸附柱生产成本较高，价格较为昂贵，材料不可回收利用，使其应用受到限制。

技术实现要素：

为了克服现有技术的上述缺点与不足，本发明的目的在于一种具有血液净化功能的可逆自组装表面，既可实现对血液或血浆中胆红素的吸附，优化吸附柱性能，又可利用β-环糊精-金刚烷包合物的温度响应性质，实现吸附柱的循环利用。

本发明的另一目的在于提供上述具有血液净化功能的可逆自组装表面的制备方法。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种具有血液净化功能的可逆自组装表面的制备方法，包括以下步骤：

(1)将HS-PEG-NHS和Ad-NH₃Cl混合，加入溶剂中，在三乙胺作用下反应，得到R₁-PEG-Ad；

(2)在有机溶剂中，用IBX将β-环糊精氧化，合成β-环糊精単醛，在冰醋酸作用下，通过席夫碱反应与α,ω-二氨基烷烃或α,ω-二氨基聚乙二醇反应，再用硼氢化钠还原，混合合成β-环糊精二聚体；

(3)将步骤(1)得到的HS-PEG-Ad在溶液体系中接枝于金表面，得到带金刚烷末端的自组装表面；

(4)将步骤(3)得到的自组装表面和β-环糊精二聚体进行主客体自组装形成温度响应可逆自组装表面。

步骤(1)中的HS-PEG-NHS和Ad-NH₃Cl的摩尔比为1:1～1:15；HS-PEG-NHS和三乙胺摩尔比为1:3～1:15，在三乙胺作用下，于20～35℃反应1～2h。

步骤(1)所述的溶剂为二氯甲烷、二甲基亚砜或二甲基甲酰胺溶液。

步骤(2)所述的氧化为在20～35℃中进行18～24h，其中，β-环糊精和IBX的摩尔比为1:1～1:5。

步骤(2)所述的席夫碱反应，具体为：反应体系为二甲基亚砜、二甲基甲酰胺或四氢呋喃溶液，pH值为6.0～6.5；反应温度为50～70℃；反应时间为5～10h；α,ω-二氨基烷烃或α,ω-二氨基聚乙二醇与β-环糊精単醛的摩尔比为1:2～1:8。

步骤(2)所述用硼氢化钠还原，具体为：α,ω-二氨基烷烃或α,ω-二氨基聚乙二醇与硼氢化钠的摩尔比为1:20～1:40，还原反应在20～35℃下进行24h。

步骤(3)所述的溶液体系为水、四氢呋喃或叔丁醇溶液。

步骤(4)所述自组装，具体为：自组装反应在20～35℃中进行18～24h，溶液体系为水溶液或PBS体系。

具有血液净化功能的可逆自组装表面，由接枝有金刚烷末端的金表面通过金刚烷末端和β-环糊精二聚体自组装构成。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：

(1)本发明的具有血液净化功能的可逆自组装表面，将β-环糊精(β-Cyclodextrin)和金刚烷(Adamantane)结合并接枝在表面上，既可实现对血液或血浆中胆红素等中大分子的吸附，优化吸附柱性能，又可利用β-环糊精-金刚烷包合物的温度响应性质，实现吸附柱的循环利用。

(2)本发明的具有血液净化功能的可逆自组装表面可应用于临床医学领域，特别适用于制备血液净化材料、改善吸附性能，并通过温度响应降低材料成本，提高利用率。

附图说明

图1(a)为实施例1的HS-PEG-Ad的合成路线。

图1(b)为实施例1的β-CD Dimer的合成路线。

图1(c)为实施例1的可逆自组装表面的制备过程。

图2为实施例1所得HS-PEG-Ad(n＝3)的¹H-NMR谱图，氘代DMSO作溶剂。

图3为实施例1所得β-CD Dimer的¹H-NMR谱图，氘代DMSO作溶剂。

图4为实施例1测试a所得胆红素吸附图。

图5为实施例1测试b所得温敏效应表征图。

图6(a)为实施例1测试c所得Blank对血小板黏附的SEM电镜照片。

图6(b)为实施例1测试c所得SAM对血小板黏附的SEM电镜照片。

图6(c)为实施例1测试c所得SAB对血小板黏附的SEM电镜照片。

图6(d)为实施例1测试c所得吸附胆红素后的表面SAB-BR对血小板黏附的SEM电镜照片。

图7为实施例2所得HS-PEG-Ad的¹³C-NMR谱图。

图8为实施例2所得β-CD dimer的¹H-NMR谱图，氘代DMSO作溶剂。

图9为实施例3所得HS-PEG-Ad的红外谱图。

图10为实施例3所得β-CD dimer的红外谱图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

本实施例的具有血液净化功能的可逆自组装表面的制备方法，合成路线见图1(a)～(c)，包括以下步骤：

(1)在2mL二氯甲烷中加入79.04mg Ad-NH₃Cl，42.5mg三乙胺，10mgHS-PEG-NHS(n＝3)，Ad-NH₃Cl、三乙胺和HS-PEG-NHS的摩尔比为15:15:1，在25℃反应2h，真空抽去溶剂，加少量去离子水溶解，离心，收集溶液，冻干，得到HS-PEG-Ad。其核磁谱图见图2。

(2)将1.135g的β-环糊精和1.82mg的IBX溶于12mL的DMSO中，β-环糊精和IBX的摩尔比为1:5，搅拌溶解后在30℃下反应24h，用180mL丙酮沉淀，离心，真空干燥，用一定量去离子水溶解，过滤，冻干，得β-环糊精単醛；称取1.904gβ-环糊精単醛和12mg1,2-二氨基乙烷溶于20mL DMSO，β-环糊精単醛和1,12-二氨基十二烷(DAD)摩尔比为8:1，加入30μL冰醋酸，于70℃反应5h，加入250mg硼氢化钠还原碳氮双键，30℃下搅拌24h，用丙酮沉淀，真空干燥，得β-环糊精二聚体。其核磁谱图见图3。

(3)取步骤(1)中产物配成5mg/mLHS-PEG-Ad水溶液，浸泡Blank金片24h，超声清洗，得到带金刚烷末端的自组装表面(SAM)。

(4)取步骤(2)最终产物配成2mg/mLβ-环糊精二聚体水溶液，浸泡自组装表面24h，超声清洗，得基于温度响应β-环糊精-金刚烷可逆自组装表面(SAB)。

对本实施例制备的可逆自组装表面的胆红素吸附、温度响应及血小板粘附进行测试：

测试a、利用石英晶体微天平(QCM)对本实施例制备的可逆自组装表面的血液净化性能进行检测：

(a1)以PBS(pH＝7.4)为溶剂，配置浓度为0.1mg/mL胆红素溶液，用0.01M盐酸溶液调pH值为8.09；

(a2)安装自组装表面(SAM)通入PBS至基线平稳，再通入胆红素溶液，得到吸附胆红素后的表面SAB-BR，观察曲线变化趋势，平稳后通入PBS冲洗，曲线不在浮动后停止。

检测结果见图4，通入胆红素溶液后，曲线下降到△F为-58.50，清洗后曲线略有上升，△F为-52.97时基本平稳。

测试b、利用石英晶体微天平(QCM)检测可逆自组装表面(SAB)的温度响应性能

(b1)用水为溶剂，分别配置2.5mg/mL HS-PEG-Ad溶液和0.5mg/mLβ-环糊精溶液；

(b2)安装清洗干净的镀金Blank芯片，通水，基线平稳后通入HS-PEG-Ad溶液，曲线平稳后通水清洗，直到曲线平稳；

(b3)通入β-环糊精溶液，曲线平稳后通水清洗，直到曲线平稳；

(b4)温度升高至30℃，曲线平稳后降温，直到曲线平稳；

(b5)重复步骤(b3)到(b4)两次。

测试得到的温度响应性能曲线如图5所示，温度升高后，曲线随之上升，平稳改变温度基本不影响曲线，再次通入β-环糊精溶液曲线下降，温度响应的重复性较好。

测试c、对本实施例制备的SAM、SAB、SAB-BR及空白样Blank进行血小板粘附实验：

(c1)取10mL新鲜兔血置于除菌离心管中，离心15min，得到上层清液为富血小板血浆；

(c2)将Blank、SAM、SAB、SAB-BR置于24孔板中，用PBS(pH＝7.4)溶液润洗样品，用移液枪取富血小板血浆1mL，在37℃恒温恒湿箱中使血浆与材料表面接触2h，再用PBS溶液清洗掉吸附不牢固的血小板；

(c3)将经过步骤(c2)处理后的表面材料样于1mL戊二醛固定液固定，固定时间为4h；

(c4)用高纯水轻轻清洗材料表面3次，依次用30％、50％、60％、70％、80％、90％、100％乙醇/溶液脱水处理，各梯度脱水时间为10-20min；

(c5)用乙酸异戊酯浸泡30min，吹干，将处理后的表面材料置于干燥柜中保存以备电镜测试。

图6(a)～(d)分别为空白组Blank、步骤(3)得到的带金刚烷末端的自组装表面SAM、步骤(4)得到的β-环糊精-金刚烷可逆自组装表面SAB、吸附有胆红素的β-环糊精-金刚烷可逆自组装表面SAB-BR的SEM电镜照片，由图可知，SAM、SAB、SAB-BR对血小板的吸附量很少，材料的血液相容性较好。

实施例2

本实施例的具有血液净化功能的可逆自组装表面的制备方法，包括以下步骤：

(1)在2mL二氯甲烷中加入3.75mg Ad-NH₃Cl，6.08mg三乙胺，100mgHS-PEG-NHS(n＝120)，Ad-NH₃Cl、三乙胺和HS-PEG-NHS的摩尔比为1:3:1，在20℃反应2h，真空抽去溶剂，加去离子水溶解，离心，收集溶液，冻干，得到HS-PEG-Ad。其核磁谱图见图7。

(2)将1.135gβ-环糊精和364mg IBX溶于12mL DMSO中，β-环糊精和IBX的摩尔比为1:1，搅拌溶解后在20℃下反应18h，用180mL丙酮沉淀，离心，真空干燥，用一定量去离子水溶解，过滤，冻干，得β-环糊精単醛；称取476mgβ-环糊精単醛和124mgα,ω-二氨基烷烃(m₁＝40)溶于20mL DMSO，β-环糊精単醛和1,12-二氨基十二烷摩尔比为2:1，加入20μL冰醋酸，于50℃反应7h，加入250mg硼氢化钠还原碳氮双键，20℃下搅拌24h，用丙酮沉淀，离心，真空干燥，得β-环糊精二聚体。其核磁谱图见图8。

(3)取步骤(1)中产物配成0.5mg/mL HS-PEG-Ad水溶液，浸泡金片24h，超声清洗，得到带金刚烷末端的自组装表面(SAM)。

(4)取步骤(2)最终产物配成0.5mg/mLβ-环糊精二聚体水溶液，浸泡自组装表面24h，超声清洗，得基于温度响应β-环糊精-金刚烷可逆自组装表面(SAB)。

实施例3

本实施例的具有血液净化功能的可逆自组装表面的制备方法，包括以下步骤：

(1)在2mL二氯甲烷中加入3.752mg Ad-NH₃Cl，2.02mg三乙胺，10mg分子量为5000的HS-PEG-NHS，Ad-NH₃Cl和HS-PEG-NHS的摩尔比为10:10:1，在25℃反应1h，真空抽去溶剂，加去离子水溶解，离心，收集溶液，冻干，得到HS-PEG-Ad。其红外谱图见图9。

(2)将1.135gβ-环糊精和1.092g IBX溶于12mLDMSO中，β-环糊精和IBX的摩尔比为1:3，搅拌溶解后在25℃下反应24h，用180mL丙酮沉淀，离心，真空干燥，用一定量去离子水溶解，过滤，冻干，得β-环糊精単醛；称取1.190mgβ-环糊精単醛和40mgα,ω-二氨基聚乙二醇(NH₂-PEG-NH₂(m₂＝3))溶于20mL DMSO，β-环糊精単醛和1,12-二氨基十二烷摩尔比为5:1，加入25μL冰醋酸，于60℃反应7h，加入250mg硼氢化钠还原碳氮双键，20℃下搅拌24h，用丙酮沉淀，离心，真空干燥，得β-环糊精二聚体。其红外谱图见图10。

(3)取步骤(1)中产物配成2.5mg/mL HS-PEG-Ad水溶液，浸泡金片24h，超声清洗，得到带金刚烷末端的自组装表面(SAM)。

(4)取步骤(2)最终产物配成2.5mg/mLβ-环糊精二聚体水溶液，浸泡自组装表面24h，超声清洗，得基于温度响应β-环糊精-金刚烷可逆自组装表面(SAB)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。