电场可控毛细管尺寸排阻色谱分离方法与流程

本发明涉及一种通过交流电场可以控制色谱柱内固定相尺寸大小的方法，即一种电场可控毛细管尺寸排阻色谱分离方法，具体是指可以根据交流电场改变色谱柱内所修饰的碳纳米纤维所形成的孔隙和间隙的大小，从而实现对多种微尺度物质分离的一种方法。

背景技术：

目前，微尺度物质如细胞、蛋白质的分离已越来越受到人们的重视，因此，各种分离方法也应运而生，尺寸排阻色谱法作为其中一种常用的分离方法，主要是用于大分子的分离分析。此方法与其他色谱法的分离原理是不同的，因为它不是靠物质在固定相和流动相之间的吸附、脱附和溶解、挥发或者离子交换作用来实现大分子物质间的分离，而是基于所分离的物质本身的尺寸和形状的不同来实现的。尺寸排阻色谱的固定相为多孔物质—凝胶，它类似于分子筛，但是其孔径比分子筛大。由于凝胶具有一定大小的孔穴，故进样后，体积较大的分子不能渗透到孔穴而被排阻，即较早的被淋洗出来，而中等体积的分子部分渗透，小分子可完全渗透入内，最后被洗出色谱柱。因此，微尺度物质就可以按其分子大小先后排阻，从柱中流出，从而实现分离。但对于尺寸排阻色谱法来说，由于其固定相—凝胶的孔径是一定的，因此，该方法仅对于相对分子质量差别大于10％的物质才能实现有效的分离，不能同时实现对多种尺度物质的高效分离。此外，该方法对于填料要求很高，对于不同的目标物质需要选择不同填料，需要连续进样导致操作过程繁琐而且也存在溶剂消耗量大等缺陷，所以需要开发一种新型的尺寸排阻色谱分离方法，从而实现对于多种微尺度物质的高效分离。

技术实现要素：

本发明的目的是为了克服现有的尺寸排阻色谱法对于填料要求高、溶剂消耗量大、不能同时并且高效的分离相对分子量差别在10％以内的微尺度物质等缺陷，而提出的一种电场可控毛细管尺寸排阻色谱分离方法。该尺寸排阻色谱分离方法无需更换固定相，并且该固定相能重复使用。通过在毛细管柱外施加合适的交流电场使碳纳米纤维上下运动，通过施加的电压控制碳纳米纤维之间形成孔隙和间隙的大小，通过频率控制碳纳米纤维之间孔隙和间隙的变化速度，通过Duty值控制碳纳米纤维在一定方向上保持该孔隙和间隙的时间，从而使色谱柱内得到纵向、横向尺寸不同的分离通道，实现同时对多种微尺度物质的分离。

为了实现上述目的，所提供的技术方案为：

一种电场可控毛细管尺寸排阻色谱分离方法，包括如下步骤：

①提供分离柱，选择石英毛细管柱或不锈钢管柱，制备碳纳米纤维/石英毛细管或不锈钢管柱；

②在制备好的分离柱两端放置两个电极，电极与交流电源连接，使分离柱内形成交流电场，修饰在分离柱内的碳纳米纤维头部带电荷，将受到交流电场的作用在分离柱内上下运动；

③通过调节所施加电场的电压、频率、Duty值等参数来控制碳纳米纤维所形成的孔隙和间隙的情况；施加电压越大，碳纳米纤维所受电场力作用越大，纵向上的碳纳米纤维之间形成的孔隙越小，横向上的碳纳米纤维之间的间隙越大；频率越高，碳纳米纤维来回摆动的次数也越频繁，即孔隙和间隙变化速度也越快，而Duty值越大，单位时间内所施加的正向电压时间相对越长，使碳纳米纤维在某一方向上保持该孔隙和间隙的时间越长，故进入该体系内的尺寸较大的微尺度物质由于不能进入到孔隙内而最早被排阻出来，尺寸较小的微尺度物质进入到孔隙内而后被洗脱出来；从而实现对不同尺寸的微尺度物质的高效分离。

进一步地，所述的分离柱根据所要生长的碳纳米纤维的长度不同而进行选择，分离柱为不锈钢管柱或石英毛细管柱，内径范围在5-200 μm，长度为10-100 cm。

进一步地，所述的碳纳米纤维长度范围为0.5 μm-100 μm，碳纳米纤维头部带电荷。

进一步地，所述的电场为交流电场，电参数（电压：0-30 kV、频率：0-10 Hz、Duty值：1%-99%）根据碳纳米纤维长度以及目标物大小可以进行调节。

由于采用上述技术方案，本发明提供的电场可控的尺寸排阻色谱法具有如下优点：能够通过电场控制碳纳米纤维的运动情况，从而控制分离柱内的固定相所形成孔隙以及间隙的大小，使同一根色谱柱内可以形成尺寸不同的分离通道，来实现多种微尺度物质的快速、高效分离，且不受分离物质本身相对分子质量差异的限制，无需更换固定相，分离方法简单，经济，绿色安全。

下面结合附图和实例对本发明进一步说明。

附图说明

图1是电场可控毛细管尺寸排阻色谱分离法不施加交流电场时碳纳米纤维状态示意图。

图2是施加交流电场后分离柱内的碳纳米纤维运动情况示意图。

图3是改变交流电场方向后分离柱内的碳纳米纤维运动情况示意图。

图4是不同尺寸微尺度物质进入碳纳米纤维/石英毛细管或不锈钢管柱内分离行为示意图。

图5是改变电场方向后不同尺寸微尺度物质分离情况示意图。

图1-5中，1、石英毛细管柱或不锈钢管柱，2、电极，3、碳纳米纤维，4、交流电源，5、癌细胞（13-20 μm），6、白细胞（10-14 μm），7、红细胞（7-10 μm）。

具体实施方式

一种电场可控毛细管尺寸排阻色谱分离方法，其具体实施方式如图1至图5所示，其中包括如下步骤：

① 选择作为尺寸排阻色谱方法的分离柱为内径为5-200 μm，长度为10-100 cm的石英毛细管柱或不锈钢管柱1，制备碳纳米纤维/石英毛细管或不锈钢管柱，首先将掺杂Ni催化剂的介孔材料通入到石英毛细管或不锈钢管柱1中，在高温煅烧条件下形成介孔后，利用化学气相沉积法通入碳源(乙炔)使石英毛细管或不锈钢管柱内生长碳纳米纤维，所生长的碳纳米纤维3长度为0.5-100 μm, 碳纳米纤维3头部带电荷，如图1所示（正负电荷均可，图1-图5中以负电荷为例进行说明）；

② 在毛细管1的两侧放置两电极2，电极2与交流电源4相连，打开交流电源4在毛细管1内部形成交流电场后，修饰在石英毛细管柱或不锈钢管柱1内的碳纳米纤维3由于头部带负电，将受到交流电场的作用在空间内可上下运动，如图2、图3所示；

③ 通过施加电压的大小控制碳纳米纤维3运动的情况，施加电压越大，石英毛细管柱或不锈钢管柱1内的碳纳米纤维3运动幅度越大，从而形成的孔隙越小，分离通道越大，部分碳纳米纤维3所受电场力较小，导致碳纳米纤维3之间所形成的孔隙较大，分离通道较小；

④ 控制频率调控碳纳米纤维3的上下运动过程，频率越高，碳纳米纤维来回运动的次数也越频繁，即柱内的孔隙和间隙变化速度也越快；

⑤ 控制Duty值调节碳纳米纤维在一定方向上保持该孔隙的时间，Duty值越大，单位时间内所施加的正向电压时间相对越长，即碳纳米纤维在正向上保持该孔隙和间隙的时间越长，微尺度物质更容易进入到碳纳米纤维形成的孔隙中。

综合上述，通过调节交流电的电压、频率、Duty值调控碳纳米纤维/石英毛细管或不锈钢管内的纵向、横向尺寸不同的分离通道大小，以此来达到电场可控毛细管尺寸排阻色谱分离微尺度物质的效果。

具体的电场可控毛细管尺寸排阻色谱分离方法分离微尺度物质时，如图4、图5所示，以癌细胞5、白细胞6以及红细胞7为例，首先打开交流电源4使之在石英毛细管柱或不锈钢管柱1两侧形成交流电场，由于柱内的碳纳米纤维3头部带负电荷，因此，会受电场力的作用形成上下运动的过程，将不同尺寸的癌细胞5、白细胞6以及红细胞7注入到分离柱内部时，由于碳纳米纤维3受交流电场的作用，形成的分离通道以及孔隙不同，尺寸较小的红细胞7保留在柱内并进入到碳纳米纤维3所形成小孔隙的部位中，中等尺寸的白细胞6保留在柱内，进入到碳纳米纤维3形成的中等孔隙的部位中，而相对来说大尺寸的癌细胞5由于部分进入或不能进入到碳纳米纤维3所形成的孔穴内而最早从中间的分离通道被洗脱出来，以此来达到分离不同尺寸的微尺度物质。