小滴测序装置的制作方法

本发明涉及一种改进的小滴(droplet)测序装置和方法，其中在通过寡核苷酸探针系统捕获和使用荧光光谱鉴定之前将单核苷酸印制到基板上。

在我们先前提交的专利申请wo2014053854和wo2014167323中，我们已经公开了用于通过如下方法对核酸(诸如合成的和天然存在的dna和rna)进行测序的方法：所述方法涉及首先从相应的前体分析物产生有序的单核苷酸流，例如通过逐步焦磷酸解或核酸外切产生。此后，在水性微滴(microdroplet)中捕获单核苷酸，其中用猝灭的、荧光团标记的寡核苷酸探针系统处理它们，在捕获发生后，其经历逐步核酸外切以释放携带游离荧光团的单核苷酸，所述单核苷酸的特征荧光发射能使最初捕获的核苷酸被可靠地鉴定。已经在wo2014053853、wo2015121675、wo2015185564、wo2016012789和上述专利中描述了适用于该目的的探针和方法的实例。

虽然上述方法可以通过产生和操作例如在不可混溶的载体介质(诸如硅油)中分散的小滴流来实施，但是我们最近发现所述方法能够通过当小滴形成时将它们直接印制到基板的表面而有利地且更有效地进行。该方法是我们最近提交的申请wo2014199113的主题。据此，我们现在已经开发了用于设备本身的设计，这对于分析具有显著核苷酸长度(例如超过100个核苷酸)的核酸片段是特别有利的。

us2007015289公开了分配多个小滴的方法，但是不涉及使用微滴对核酸进行测序，并且没有提及单核苷酸的产生。此外，长度尺度和体积将不适于在我们的特定应用中使用。在us5879944、us2002074342和us2004021068中描述了另外的点样(spotting)装置以及分配和接口阵列，但是这些也不针对测序。

因此，根据本发明，提供了用于通过印制小滴对核酸进行测序的设备，所述小滴中的至少一些含有来源于所述核酸的单核苷酸，所述设备的特征在于包括：

●具有带有小滴接收位置的面的平面基板，所述小滴接收位置以平行于限定所述基板的第一轴线的至少一个轨道排列；

●包括多个小滴分配喷嘴组的打印机头，所述多个小滴分配喷嘴组并置于所述小滴接收位置上方，使得每个喷嘴组能够依次将小滴分配到所述小滴接收位置中；

●用于使打印机头相对于所述小滴接收位置沿着第一轴线逐步移动的装置；

●所述打印机头上游的核苷酸生成位点，通过所述核苷酸生成位点从核酸产生有序的单核苷酸流并将其递送到第一小滴分配喷嘴组；

●至少一个入射电磁辐射源，其适于照射所述小滴接收位置，和

●至少一个光检测器，其适于检测照射之后由每个小滴接收位置发射的荧光辐射。

用于本发明设备中的平面基板适当地是一张弹性材料片，其具有带有多个(适当地为数十个、数百个、数千个或数百万个)小滴接收位置的面，所述小滴接收位置能够将印制在其上的小滴保持就位。在一个实施方案中，这些位置是虚拟位置并且在打印机头印制小滴时产生。在另一个实施方案中，它们被图案化到所述面上，并且例如包括在基板的面上的凹陷(例如孔)或在其上形成的杯状物。在另一个实施方案中，小滴接收位置用亲水材料涂覆以进一步增强小滴对基板的粘附。在又一个实施方案中，凹陷或杯状物在形态上是半球形的，具有微米范围内的最大横截面。虽然也考虑整个基板可以包括光学透明的片诸如石英、玻璃或透明塑料，但是优选地，基板至少在每个小滴接收位置处是光学透明的。

如有需要，小滴接收位置可以设置有在底部的一个或多个孔以使其内容物在被询问之后能够排出。如果使用这个实施方案，优选的是首先用高熔点材料的塞子塞住每个孔；例如时间一到即能够熔化掉的蜡。

在一个实施方案中，小滴接收位置以线性轨道的形式排列，该线性轨道平行于基板的面的第一轴线，打印机头沿着该轴线逐步移动。在优选的实施方案中，基板设置有多个这样的轨道，其彼此平行从而形成矩形阵列。在另一个实施方案中，多个轨道可以被分组在一起以形成更高阶的轨道结构，每个轨道结构对应于沿着所述面的打印机头的一个横切线。

除了小滴接收位置的轨道之外，基板可以具有围绕其末端或其中的区域的一个或多个唇缘(lip)，以确保优选的与小滴不可混溶的溶剂涂层被保持就位。在另一个实施方案中，轨道的任一侧运行一种装置以确保当打印机头在基板上方移动时，打印机头保持精确地位于小滴接收位置上方。在一种布置中，该装置包括一对平行于所述轨道的轮廓轨道(profiledrail)，其可以与打印机头上的轮子、沟槽等上的相应轮廓配合。然而，这只是技术人员将容易想到的许多可能的布置中的一个实例；例如其中轨道位于打印机头上并且轮子或沟槽位于基板上的镜像布置将立即显而易见并且包括在本发明的范围内。

来看打印机头，其包括多个小滴打印喷嘴组，当打印机头在使用时，所述喷嘴组紧接于小滴接收位置上方并置，使得每个喷嘴可以依次将小滴分配到其中。每个喷嘴组可以由单个喷嘴或多个类似的喷嘴组成。可以通过本领域中的任何已知方式(包括例如通过电的或静电的方式)引起分配。由于小滴的尺寸优选具有微米范围内的尺寸，所以优选的是喷嘴具有类似的尺寸。在一个实施方案中，给定组中的喷嘴连接到用于分配材料的储存器或微流体系统。

在一个优选的实施方案中，每个喷嘴组包括多个喷嘴，并且给定喷嘴组中的每个喷嘴沿着垂直于基板的面的第一轴线的第二轴线排列成一行，并且其中在该行中每个相邻喷嘴之间的距离与相邻轨道中相邻小滴接收位置之间的距离是相同的或是其整数倍。在该实施方案中，表示给定喷嘴组的喷嘴的行一个接一个地平行排列，以使从每个小滴组中的喷嘴中流出的液体能够顺序地填充轨道中的每个小滴位置。

在另一个优选的实施方案中，打印机头包括至少第一和第二喷嘴组，其中第一组分配水性小滴，所述水性小滴中的至少一些含有单核苷酸；合适的是一磷酸核苷酸、二磷酸核苷酸或最优选是三磷酸核苷酸，并且第二喷嘴组分配一个或多个(优选四个)不同的寡核苷酸探针系统，所述系统具有wo2014053853、wo2014167323、wo2015121675、wo2015185564和wo2016012789中的一个中描述的特征，其内容通过引用并入本文并在下面进一步讨论。

简言之，这些探针系统包含一个或多个寡核苷酸组分，其中至少一个寡核苷酸组分包括一个或多个荧光团，所述荧光团在探针系统的未使用状态下基本上是猝灭的且不发荧光。一旦探针已经捕获了它们对其具有选择性的单核苷酸，则它们变得对逐步核酸外切降解敏感，从而释放未猝灭的荧光团标记的核苷酸。

典型地，第二喷嘴组将分配水性小滴，所述水性小滴包含探针系统和引起发生捕获反应和任选的降解所需的各种试剂(包括聚合酶、连接酶和任选的外切核酸酶)。然而，如有需要，考虑这些组分可以通过一个或多个另外的喷嘴组分别地引入到小滴接收位置。因此，在优选的实施方案中，第一和第二喷嘴组可以通过一个或多个第三喷嘴组而增强，所述第三喷嘴组分配含有酶的小滴。例如，在由第一喷嘴组分配的小滴含有通过前体dna或rna分析物的逐步焦磷酸解产生的单个三磷酸核苷酸的情况下，可以使用第三喷嘴组将含有焦磷酸酶的小滴引入到小滴接收位置，以在引入探针系统之前破坏与三磷酸核苷酸一起存在的任何焦磷酸盐。在这种特定情况下，第三喷嘴组便利地位于打印机头上的第一和第二喷嘴组之间。然而，该实施方案不被解释为是限制性的，并且还可能希望在印制过程中在其它点引入其它酶；例如上面提到的外切核酸酶。

与每个喷嘴组相关联的喷嘴可以设置有加热器或冷却器元件，以在任何液体从喷嘴流出之前加热或冷却所述液体。这对于确保在印制的任何给定点处小滴接收位置的内容物处于最佳温度是特别有用的。

打印机头还可以进一步包括分配器，用于在使用之前将与水不混溶的涂层分配到携带小滴接收位置的基板的所述面上。在一个实施方案中，该液体包含油，例如硅油，任选地含有一种或多种表面活性剂。在另一个实施方案中，这种油在相对高的温度下是液体，但是当印制完成时可以被冷冻成固体蜡。这具有这样的优点：进一步将小滴接收位置的内容物限制在固体基质中，同时例如对内容物进行分析。

打印机头还可以含有至少一个第二分配器，用于将清洗液分配到携带小滴接收位置的基板的所述面上。这使得基板能够在运行之间被清洗。使其再使用。

适当地，用于逐步移动打印机头的装置包括微处理器控制的电动机，用于驱动位于打印机头下侧的轮子，并且其与轨道衔接，或者更优选地与相对于基板移动它(反之亦然)的线性移动台或步进电动机衔接。

根据与本发明设备一起使用的测序方法，所述设备包括打印机头上游的核苷酸生成位点，通过所述核苷酸生成位点从核酸产生有序的单核苷酸流并将其递送到打印机头中的第一小滴分配喷嘴组。该流的这种排序对应于核酸中的核苷酸序列。在一个实施方案中，该位点位于设置有能够容纳核酸的分析物接收位置的室中，例如适于接收珠子和将其保持就位的杯状物，连接核酸的珠子；例如通过抽吸。所述室还设置有流体入口和出口；后者与打印机头连接，并通过所述室可以引入和去除流动的水性介质；例如通过微流体管道。在另一个实施方案中，使核酸在所述位点处进行逐步焦磷酸解，以在酶和流动的水性流的存在下形成有序的三磷酸核苷酸流，所述水性流进一步包含焦磷酸盐和根据上面提到的我们专利的那些教导实施该反应所需的那些其它试剂。

用于利用电磁辐射照射小滴接收位置的源适当地是等离子灯(plasmalamp)、卤素灯或优选地是激光器或led，其以将刺激在小滴接收位置产生的游离荧光团的频率操作。在一个实施方案中，打印机头和这种源位于基板的同一侧，但是在更优选的实施方案中，它们位于相对侧，以使入射辐射穿过光学透明基板传递。类似地，光检测器可以与所述源位于基板的同一侧或相对侧，但是优选地其位于相对侧。在这种情况下，光检测器可以与打印机头一体制成，以便在横穿所述面时与其一起移动。使用的光检测器可以是能够检测使用的不同荧光团的辐射频率特征的任何类型。

除了上述组件之外，所述设备可以包括其它项，诸如辅助光学器件(例如，镜子、波导、滤波器和透镜，以操纵和聚焦入射辐射束和荧光辐射束)、微流体管道以及一个或多个用于控制以下功能中的一些或全部的微处理器；小滴进入小滴接收位置的添加和定时，照射和询问小滴接收位置的定时以及由光检测器产生的任何信号的分析。然而，如有需要，这种分析可以在独立计算机上进行。

在本发明的第二个方面，提供了适于与该设备一起使用的方法。其包括对核酸进行测序的方法，特征在于包括以下步骤：(1)将含有来源于核酸的有序的单核苷酸流的水性介质递送到打印机头的第一小滴喷嘴组；(2)将含有单核苷酸的第一小滴从第一小滴喷嘴组印制到平面基板上的至少一个小滴接收位置；(3)随后将含有至少一种探针系统的第二水性小滴印制到相同的小滴接收位置，所述探针系统包含用荧光团标记的寡核苷酸、聚合酶和连接酶，其中所述荧光团仅在通过核酸外切释放后是可检测的；(4)允许荧光团在小滴接收位置处释放；(5)用入射电磁辐射照射小滴接收位置并检测从其发射的单核苷酸的荧光辐射特征。

在该方法的一个实施方案中，核酸是合成的或天然存在的dna或rna或其片段；在另一个实施方案中，单核苷酸是已经通过核酸的逐步焦磷酸解产生的三磷酸核苷酸。在该后一个实施方案的情况下，该方法优选地在步骤(2)和步骤(3)之间进一步包括以下额外步骤：将含有焦磷酸酶的第三水性流印制到小滴接收位置，以消耗剩余的焦磷酸盐。在该方法的又一个实施方案中，通常第二小滴还含有外切核酸酶，或者备选地，在步骤(3)和(4)之间将含有外切核酸酶的第四水性小滴印制到小滴接收位置。

在上述方法的所有实施方案中，使用的探针系统可以从wo2014053853、wo2014167323、wo2015121675、wo2015185564和wo2016012789中描述的那些中的任一种中选择，它们的内容应该被技术人员参考并通过引用并入本文。然而，在第一个优选的方面，探针系统包含一类第一和第二寡核苷酸对中的一种。这种对中的第一寡核苷酸优选包含：(a)第一双链区域和(b)第二单链区域，所述第二单链区域由n个核苷酸碱基构成，其中n大于1，优选大于5。在一个亚类中，所述第一寡核苷酸可以被认为具有来源于概念上的或实际上的单链寡核苷酸前体的分子结构，其中双链区域通过将前体的3’端部分回折于其自身上从而产生可以被称为“j形”的构型而形成。在另一个亚类中，第一寡核苷酸通过以下方式产生：将第三、较短的单链寡核苷酸杂交在较长的第四单链寡核苷酸的3’端上并随后借助保护基团(其例如将两条链的最后的核苷酸桥接)使得得到的双链分子‘钝化’。通常，第一寡核苷酸的总长多至150个核苷酸碱基，优选20至100个核苷酸碱基。同时，优选的是，整数n为5至40，优选10至30。

关于所述对中的第二寡核苷酸，这是单链的并且适当地具有与始于超过双链区域末端的一个核苷酸碱基的第一寡核苷酸的单链区域的核苷酸碱基序列完全或部分互补的核苷酸碱基序列。第二寡核苷酸的长度不重要，并且可以长于或短于它可以结合的单链区域，但是其长度优选不是n-1个核苷酸碱基。更优选地，选择第二寡核苷酸的长度，以使得在捕获的分子中，在其两条链中的一条或另一条上仍然有短的未配对核苷酸碱基的突出端(例如2至10个核苷酸碱基)。优选地，在这种类型中，荧光团位于第二寡核苷酸上。该类型的探针系统通过下述起作用：将单核苷酸碱基连接于第一寡核苷酸的双链末端，并且将第二寡核苷酸杂交到剩余的单链区域上，以产生捕获的分子(除了其突出端之外，其是双链的)。

在第二个优选的方面，探针系统包含一类单寡核苷酸，其各自由单链核苷酸区域组成，所述单链核苷酸区域的末端连接于两个不同的双链区域。此处，所述单链核苷酸区域由仅使得探针对靶标(即所述小滴中的互补单核苷酸碱基)的检测极具选择性的一个核苷酸碱基构成。

来看双链寡核苷酸区域，优选的是，它们来源于或可来源于各自优选为闭环的两个寡核苷酸前体，或通过以下方式来源于或可来源于共同的单链寡核苷酸前体：将后者的末端回折于其自身上以产生两个闭环的寡核苷酸碱基区域，其中中间的缺口构成单链核苷酸区域。在所有的情况中，效果相同；邻近单链核苷酸区域末端的将是寡核苷酸区域的另一条链上的3’和5’自由末端，其可以连接靶标的相应的5’和3’端。因此，所述探针系统的使用涉及这样的步骤：通过结合探针系统的可用的3’和5’端，将单链核苷酸区域连接于靶标单核苷酸碱基，以产生使用的探针系统，所述使用的探针系统沿其整个长度是双链的。

适当地，所述双链寡核苷酸区域的长度多至50个核苷酸碱基对，优选地多至45个核苷酸碱基对，更优选在5至40个核苷酸碱基对的范围内，并且最优选在10至30个核苷酸碱基对的范围内。可以使用更长的区域，但靶标接近单链核苷酸区域的潜在风险可能由于缠结而变成限制性的。这使得该实施方案可能不那么有吸引力。

在该实施方案中，优选的是，与双链寡核苷酸区域结合的荧光团位于远离单链核苷酸区域处。最后，在一个实施方案中，优选的是，双链寡核苷酸区域中的至少一个包含至少一个限制性酶识别位点，所述位点优选与荧光团定位或集中的区域相邻。对于这些探针系统，通过首先限制性酶呈现核酸内切作用并且使双链在使用的探针系统中在上述位点处被切割而出现荧光团的释放。然后这样产生的短片段可以由外切核酸酶进一步降解为单核苷酸，所述单核苷酸中至少一些将标记有荧光团。因此，当使用的探针系统包含多个荧光团时，这导致荧光团的级联释放，所述荧光团由于其现在彼此分离和/或与它们关联的猝灭剂分离而在现在以正常方式自由发荧光。这种限制性酶识别位点将通常包含2至8个核苷酸对的特定序列。在另一个优选的实施方案中，所述限制性酶识别位点将是通过将单核苷酸与单链核苷酸区域结合而产生的位点。

在第三个优选的方面，探针系统包含三种组分；(a)第一单链寡核苷酸，其用处于不可检测状态的荧光团标记，和(b)第二和第三未标记的单链寡核苷酸，其能够杂交于第一寡核苷酸上的互补区。在一个实施方案中，所述第二和第三寡核苷酸是分开的实体，而在另一个实施方案中，它们通过接头区的方式彼此连接。在该后一种情形中，在一个实施方案中，所述接头区连接第二和第三寡核苷酸的末端；优选地，连接第二寡核苷酸的5’端和第三寡核苷酸的3’端。接头区原则上可以是任意二价的基团，但是便利地是另一种单链或双链的寡核苷酸片段。在一个实施方案中，所述接头区不能基本上杂交于第一寡核苷酸。

选择第一、第二和第三寡核苷酸，使得第二和第三寡核苷酸可以分别杂交到第一寡核苷酸上的3’侧和5’侧的侧翼区，它们本身并置在捕获区的任一侧，所述捕获区包含核苷酸碱基与待检测的三磷酸核苷酸携带的核苷酸碱基互补的单核苷酸。这使得该三组分的探针系统对所述特定的三磷酸核苷酸有高度选择性。因此，例如，如果分析物来源于dna，并且第一、第二和第三寡核苷酸是脱氧核糖核苷酸，则当捕获区包含的核苷酸携带胸腺嘧啶碱基时，所述捕获区将对三磷酸脱氧腺苷有高度选择性。

典型地，第一寡核苷酸的长度多至150个核苷酸，优选为20-100个核苷酸。在一个实施方案中，第二寡核苷酸比第一寡核苷酸的互补性3’侧侧翼区长多至10个、优选1-5个核苷酸。在另一个实施方案中，在第一寡核苷酸的3’端与在第二寡核苷酸上与其相对的核苷酸之间存在单个核苷酸错配，以防止三磷酸核苷酸在这一点上被聚合酶捕获。在另一个实施方案中，第三寡核苷酸的3’端包含耐受核酸外切降解的元件，以确保步骤(3)中产生的第四寡核苷酸本身不被接着消化掉。例如，这可以通过在该特定末端处或接近该特定末端处结合一个或多个硫代磷酸酯键、g-四联体、硼酸化的核苷酸、倒置的dt或ddt、c3间隔臂或磷酸基团而实现。

使用该第三类的探针系统产生双链的使用的探针，其组成链分别是第一寡核苷酸和互补的第四寡核苷酸，当以其5’-3’方向读取时，其包含第二寡核苷酸，然后是来源于单三磷酸核苷酸的核苷酸，并且最后是第三寡核苷酸。如果第二和第三寡核苷酸之前已经通过接头区连接在一起，那么容易明显可见，第四寡核苷酸将包含高度耐受核酸外切的闭环链。然后，该闭环可以用于与使另外的荧光团释放的另外的第一寡核苷酸结合；由此产生增加荧光信号强度的循环过程。

在所有三个方面的探针系统中，探针系统中寡核苷酸组分中的至少一个被其本身独特类型的荧光团多重标记，并且这些荧光团在探针系统处在未使用状态时基本上是不可检测的。因此，尽管荧光团可能呈现跨电磁谱的一个宽部分的普遍的、低水平的背景荧光，但是通常将存在荧光强度处于最大值的一个或少数特定波长或波长范围(wavelengthenvelopes)。在荧光团被特征性检测的这些最大值中的一个或多个处，荧光基本上不应该发生。在本专利的语境中，术语‘基本上不发荧光’或等效用词意为，与探针系统连接的荧光团总数在相关特征波长或波长范围处的荧光强度不到相等数量的游离荧光团的相应荧光强度的25％；优选不到10％；更优选不到1％并且最优选不到0.1％。

原则上，可以使用任何方法保证在探针系统的未使用状态下，荧光团基本不发荧光。一种方式是在与其紧邻处额外地连接猝灭剂。另一种是基于这样的观察，即当多个荧光团彼此紧邻地连接时，它们倾向于彼此充分猝灭，以致可以在不需要猝灭剂的情况下实现前一段所述的标准。在本专利的语境中，什么构成荧光团之间或荧光团与猝灭剂之间的‘紧邻’将取决于使用的特定荧光团和猝灭剂，并且可能取决于与其连接的寡核苷酸的结构特征。因此，意在表示，应该根据所需结果而不是各种元件的任何特定结构布置来理解该术语。然而，并且仅为了提供例证，要指出的是，当相邻的荧光团或相邻的荧光团和猝灭剂被分开的距离对应于特征性距离(通常小于5nm)时，通常将实现充分的猝灭。

适当地，上述提及的探针系统的相关组分用至少1个、优选多至20个荧光团标记。为了获得最大的优势，优选的是，该组分用至少2个、优选至少3个荧光团标记。因此，本文中特别地设想由这些最大值和最小值的任意排列构成的范围。如果使用猝灭剂，同样优选的是，该组分用多至20个、优选多至10个并且最优选多至5个荧光团标记。

就荧光团自身而言，它们原则上可以从本领域中常规使用的那些中的任一种中选择，其包括但不限于呫吨结构部分例如荧光素，罗丹明和它们的衍生物诸如荧光素异硫氰酸酯、罗丹明b等；香豆素结构部分(例如羟基-、甲基-和氨基香豆素)和花青结构部分诸如cy2、cy3、cy5和cy7。具体实例包括来源于以下常用的染料的荧光团：alexa染料、花青染料、attotec染料和罗丹明染料。实例还包括：atto633(atto-tecgmbh)、德克萨斯红(texasred)、atto740(atto-tecgmbh)、rosebengal、alexafluor^tm750c5-马来酰亚胺(invitrogen)、alexafluor^tm532c2-马来酰亚胺(invitrogen)和罗丹明红c2-马来酰亚胺和罗丹明绿以及亚磷酰胺染料诸如quasar570。备选地，可以使用量子点或近红外染料如由li-corbiosciences提供的那些。荧光团通常使用本领域已知的化学方法经核苷酸碱基连接于相关寡核苷酸组分。

合适的猝灭剂包括通过共振能量转移(fret)机制起作用的那些。可以与以上提及的荧光团联合使用的可商购的猝灭剂的实例包括但不限于ddq-1，dabcyl，eclipse，iowablackfq和rq，irdye-qc1，bhq-0，bhq-1、-2和-3以及qsy-7和-21。

如上所述，在30至1000c的范围内发生核酸外切反应的情况下，通过上述探针系统捕获单三磷酸核苷酸适当地在20至80℃范围内的温度在连接酶和聚合酶的存在下在小滴接收位置处进行。

本发明的设备尤其适于对来源于天然存在的来源的长链dna或rna进行测序，现在通过以下实施例对其进行阐明，其中：

图1显示了设备中使用的基板的平面图；

图2a和2b显示了沿着线x-x的基板的横截面；

图3显示了打印机头的底面视图；

图4显示了沿着线y-y的使用的打印机头的纵截面，且

图5显示了沿着线z-z的打印机头的横截面。

参考图1，根据本发明的平面基板包括一张透明石英片1，其用作为小滴接收位置的半球形孔2的11x4矩形阵列进行图案化。整个阵列被唇缘3包围以含有油，并且轨道4和5具有轮廓以接收打印机头的轮子。图2a和2b显示了典型基板的两个不同的横截面。在图2a中，所述孔没有完全地延伸穿过1，而在图2b中，1设置有由蜡6塞住的穿孔，蜡6在室温下是固体，但是当所述片加热至超过80℃时熔化掉。每个2还包括微型加热元件(未显示)，以使内容物的温度能够被控制。在使用中，1的底面以由来自led(也未显示)的光所示的方向照射。

图3显示了打印机头7的底面的平面图。其包括对应于以横向行排列的第一、第三和第二喷嘴组8、9、10的3x4喷嘴阵列，当使用7时，其对应于1上的2的相应横向行。在该特定实施方案中，一行光检测器11与7一体制成，并且类似地，与喷嘴间隔开地以相应横向行排列在7上。最后，7的底面包括四个槽轮12，其设计成可定位在4和5上并由电动机(未显示)驱动，以使得7能够以箭头所示方向在1上逐步移动。

图4和5显示了沿着分别由线y-y’和z-z’限定的平面的7的截面轮廓。从这些图示可以看出，阵列中的每个喷嘴组9和10与对应的储存器13、14连接，并且给定组的每个储存器通过微流体管道15和入口16与同一组的其它部分连接。16可以与压力驱动的泵或压电致动器连接或者使其经受电场，该电场可以被操作以使得小滴17能够从各喷嘴中排出。每个第一喷嘴组通过其自身的微流体管道18分别与核苷酸生成位点19连接，在核苷酸生成位点19中通过经由聚合酶的逐步焦磷酸解由dna样品产生在水性介质中的三磷酸核苷酸流。然后通过正压将水性介质引入到18中，从而使小滴从8中排出用于印制到2。使小滴以使得非常少的小滴含有多于一个三磷酸核苷酸的速度从8中排出。实际上，这可以意味着可以排出不含三磷酸核苷酸的小滴。通常，使小滴以用微处理器(未显示)与7沿着1上的2的阵列的移动同步的速率从8、9和10排出。在所示实施方案中，喷嘴组9分配含有热稳定性无机焦磷酸酶(tpp)的水性小滴，而喷嘴组10分配含有实施例中如下所述的组的探针系统的水性小滴。在使用中，一旦每个2被来自8、9和10的小滴填充并且已经进行温育，则其最初含有的三磷酸核苷酸的荧光特征在其穿过1时由每个11测量。这依次产生电信号，其被供应到微处理器或独立计算机(未显示)用于分析。

用于在设备中使用的探针系统的实施例(exgb1412977.9)

制备第一单链寡核苷酸，其具有下述核苷酸序列：

5′tcgtgcctcatcgaacatgacgaggxxqxxggtttgtggt3′

其中a、c、g和t表示携带dna的相关特征性核苷酸碱基的核苷酸；x表示使用常规的胺连接化学用atto655染料标记的脱氧胸苷核苷酸(t)，并且q表示用bhq-2猝灭剂标记的脱氧胸苷核苷酸。其还包含捕获区(a核苷酸)，所述捕获区对捕获三磷酸脱氧核苷酸(dntps)混合物中的三磷酸脱氧胸苷核苷酸(dttps)具有选择性。随后制备三种其它版本的第一寡核苷酸，其中每个(t)核苷酸用另一种不同的染料标记，并且捕获区分别是分别对三磷酸脱氧腺苷(datp)、三磷酸脱氧胞苷(dctp)和三磷酸脱氧鸟苷(dgtp)具有选择性的t、g和c核苷酸。

还制备第二单链寡核苷酸，其包含：(1)第二寡核苷酸区，其具有与第一寡核苷酸的3’端互补且具有单个碱基错配的序列；(2)第三寡核苷酸区，其具有与第一寡核苷酸的5’端互补的序列，和(3)76个碱基对的单链接头区。其具有下述核苷酸序列：

5’pcatgttcgatgaggcacgatagatgtacgctttgacatacgctttgacaatacttgagcagtcggcagatataggatgttgcaagctccgtgagtcccacaaaccaaaaacctcg3′

其中，另外地，p表示5’磷酸基团。

然后制备包含探针系统的微滴，用于在上述示例设备的喷嘴组10中使用。其具有与来源于下述配方的组成相对应的组成：

56ul5x缓冲液，ph7.5

28ul包含4种不同的第一寡核苷酸(a、g、c和t选择性的)，100nm

28ul第二寡核苷酸，10nm

0.4uphusionii热启动聚合酶(外切核酸酶)

1.6ubst大片段聚合酶

20u大肠杆菌(e.coli)连接酶

加水至280ul

其中5x缓冲液包含下述混合物：

200ul三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(trizmahydrochloride)，1m，ph7.5

13.75ulmgcl2水溶液，1m

2.5ul二硫苏糖醇，1m

50ultritonx-100表面活性剂(10％)

20ul烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，100um

166.67ulkcl

加水至1ml

将该小滴印制到石英载片的孔中，其含有包含2.8uldttp(10nm)的水性介质。然后，通过将内容物在37℃温育50分钟，然后将温度升高至70℃温育另外的50分钟而在孔中进行dttp的捕获以及第二寡核苷酸与第一寡核苷酸的连接以形成闭环的使用的探针。然后，当出现核酸外切的循环和使用的探针的再产生时观察到在孔中出现相关荧光团染料的荧光的增长。