牡丹花粉的破壁方法与流程

本发明涉及食品加工、天然药物制药领域，尤其涉及牡丹花粉的破壁方法。

背景技术：

牡丹(paeoniasuffrutcosa)属于芍药科（paeoniaceae）芍药属(paeonia)牡丹组(sect.moutan)，又名鹿韭、白术、木芍药，为芍药科芍药属的多年生落叶灌木(赵兰勇《中国牡丹栽培与鉴赏》,2004,1-22)，在中国有2000多年的药用历史，始载于《神农本草经》，列为中品；据《新修本草》记载:牡丹“生汉中，剑南所出者，苗似羊桃，夏生白花，秋实圆绿，冬实赤色，凌冬不凋，根似芍药，肉白皮丹”;《名医别录》记载:“牡丹生巴郡山谷及汉中”，“今东间亦有”，说明该植物原产于中国西部秦岭和大巴山一带山区；约于8世纪东传日本，17世纪传入欧洲，19世纪传入美洲；国外也培育出了许多优良品种，有的已被我国引进（陈平平《中国牡丹的起源、演化与分类·生物学通报》,1997,32(3):5-7）。中国是世界牡丹的发祥地和世界牡丹王国，全国各地均有种植，广泛分布于河南洛阳、山东菏泽、安徽铜陵、陕西汉中、河北柏山、四川、甘肃、浙江等地，以洛阳、菏泽、安徽种植最多，据统计，我国牡丹的种植面积已达2万hm²（白喜婷,朱文学,罗磊,等《牡丹籽油的精炼及理化特性变化分析·食品科学》,2008,29(8):351-354.）。特产于中国的芍药属牡丹组药用植物共计有8个种，7个亚种（沈保安《中国芍药属牡丹组药用植物的分类鉴定研究与修订·时珍国医国药》,2001,12(4):330-333）。中国牡丹园艺品种根据栽培地区和野生原种的不同，可分为4个牡丹品种群，即中原品种群、西北品种群、江南品种群和西南品种群，其中以中原牡丹品种群品种最多（何秀丽,郑国生,王宗正《牡丹研究现状与进展·花卉园艺》,2006(2):8-9）。其根皮（牡丹皮）是中医临床常用中药之一，在历版《中华人民共和国药典》中也均有收载，性微寒，味苦、辛，归心、肝、肾经，具有清热凉血，活血化瘀的功能，用于热入营血、温毒发斑、吐血衄血、夜热早凉、无汗骨蒸、经闭痛经、跌扑伤痛、臃肿疮毒等症（国家药典委员会《牡丹皮·中华人民共和国药典(一部)》,2015:172）。

牡丹花大色艳、雍容华贵、富丽端庄、芳香浓郁，具有和平、繁荣、吉祥、富贵的象征意义，而且品种繁多，素有“国色天香”、“花中之王”的美称，不仅是一种重要的观赏植物，而且全身都是宝，除了其根和根皮的药用价值外，牡丹的花、籽、花粉、叶都有着很高的经济价值。其中，牡丹花粉中富含有多种营养素、维生素和矿物质，其矿物质含量虽然不高，但比较齐全。牡丹花粉中还含有大量天然活性物质，包括80多种酶、黄酮类化合物、激素、核酸和有机酸等。牡丹花粉中大量天然活性物质是促进健康、增加肌体防御能力的重要物质基础。每颗花粉都是微型的“营养库”，其蛋白质含量高达35%，有20多种氨基酸，并且一半以上的氨基酸处于游离状态，很容易被人体吸收（赵贵红《牡丹花粉保健面条的研制·粮油加工》,2006,3:66-68）。这是目前任何一种天然食物所不能比拟的。目前牡丹花粉已被开发成口服液(郑爱霞,赵小强,赵潜龙《牡丹花粉口服液及其制备方法·中国专利:cn200910117445.7》,2010-02-17)，以及作为保健面条（赵贵红《牡丹花粉保健面条的研制·粮油加工》,2006,37（3）:66-68）、酸奶（赵贵红《牡丹花粉山药酸奶的研究·食品科技》，2008,2:43-45）、啤酒（赵贵红《牡丹花粉蔬菜汁啤酒的研制·酿酒》，2005，32（5）：86-88）等的辅料。但未见牡丹花粉破壁的方法的相关报道。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种工艺简单、活性物质流失少的牡丹花粉的破壁方法。

为解决上述问题，本发明所述的牡丹花粉的破壁方法，其特征在于：该方法是指将牡丹花粉按厚度≤0.5cm均匀铺设后覆盖白布，并置于日光充足地方晒干或于40~50℃温度下烘干，当花粉中水分≤5%时经七号筛除杂，即得精选的牡丹花粉；所述精选的牡丹花粉经温差破壁法或超微粉碎法，即得破壁牡丹花粉成品。

所述牡丹花粉为丹凤牡丹（paeoniaostiit.hongetj.x.zhang）或紫斑牡丹[paeoniarockii（s.g.haw.et.laeuner）t.hanget.t.j.li]的花粉。

所述温差破壁法是指将精选的牡丹花粉装入密闭容器内，经冷冻后，按冷冻后牡丹花粉体积的20倍迅速加入沸水，摇匀，置20℃水浴中以550~650rpm的速率搅拌7h，得到花粉混合溶液；所述花粉混合溶液以3000~3500rpm的速率离心8min~10min，得到固体物质，该固体物质于25℃~35℃干燥6~10h后，经灭菌处理即得破壁牡丹花粉成品。

所述冷冻条件是指温度为-150℃，冷冻时间为20~32h。

所述超微粉碎法是指将精选的牡丹花粉装入低温细胞壁破壁超微粉碎机料斗中，启动仪器粉碎20~25min，取出，经灭菌处理即得破壁牡丹花粉成品。

所述灭菌条件是指45℃微波处理30min。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、花粉是植物生命的精华，具有很高的营养价值、药用价值，富含蛋白质、脂肪酸、黄酮等多种活性成分。在花粉的利用过程中，由于其外部有一层坚硬的孢子壁，阻碍了内部营养物质的溶出，本发明对牡丹花粉进行破壁处理有利于活性物质的释放，提高生物利用率。

2、本发明牡丹花粉在破壁前后主要营养成分（氨基酸、脂肪酸）的含量指标：

2.1牡丹花粉中的脂肪酸类成分分析

2.1.1溶液的制备

混合对照品溶液：精密量取32种脂肪酸甲酯混合对照品（sigma-aldrich公司提供，批号：18919-1amp，供脂肪酸鉴别和含量测定用）76.1mg，置10ml容量瓶中，加入正己烷溶解并稀释至刻度，摇匀，即得脂肪酸甲酯混合对照品溶液，冰箱冷藏备用。

供试品溶液：取牡丹花粉（花粉采集于兰州中川牡丹园，原植物经兰州中川牡丹产业有限公司赵潜龙高级工程师鉴定为毛茛科芍药属植物紫斑牡丹[paeoniarockii（s.g.haw.et.laeuner）t.hanget.t.j.li]）约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加环己烷50ml，超声（功率：500w，频率：28khz）30min，放冷，摇匀，滤过，减压回收溶剂至干；加入0.5mol·l^-1氢氧化钠甲醇溶液1ml，置60℃水浴皂化反应30min至油滴消失；冷却后加入bf3-甲醇（14%）溶液1ml，于60℃水浴加热反应15min，取出，冷却后，精密加入正己烷2ml及异辛烷5ml，充分振摇，加饱和氯化钠溶液10ml，转移至分液漏斗中，分取上层异辛烷溶液，作为供试品溶液，备用。

2.1.2色谱和质谱条件

色谱条件：采用agilent7890b/7000cgc-ms-ms型气相色谱-质谱联用仪(配置有7693型自动进样器)，色谱柱：hp-5ms石英毛细管色谱柱（30m×0.25mm，0.25μm）；程序升温：起始温度50℃，以8℃·min^-1升至155℃，保持2min；再以10℃·min^-1升至175℃，保持2min；以1.3℃·min^-1升至190℃，保持8min；最后以6℃·min^-1升至280℃，保持5min。扫描模式：scan，sim；进样口温度：260℃；载气：氦气，纯度99.99%；不分流进样；流速：1.0ml·min^-1；进样量：1μl。在上述色谱条件下，混合对照品溶液与花粉样品中脂肪酸成分总离子流见图1、图2（色谱峰编号与表1中编号一致）。根据各色谱峰的保留时间及相对分子质量，结合nist谱库的检索结果，并与混合对照品进行比对，对样品中的脂肪酸组分进行定性鉴定，结果见表1。

质谱条件：电子轰击离子源（ei），离子源温度230℃，电子能量70ev，质量扫描范围m/z40~400amu，溶剂延迟4.0min。

表1紫斑牡丹花粉中脂肪酸成分的定性结果

注：“*”紫斑牡丹花粉样品中测得的脂肪酸。

2.1.3线性关系的考察

分别精密吸取“2.1.1”项下混合对照品储备液适量，加正己烷配制成浓度为2、4、5、6、9、10、15μg·ml^-1系列的标准溶液，按“2.1.2”项下所述条件分别进样1μl，进行gc-ms/sim分析，以脂肪酸甲酯对照品溶液质量浓度（x，μg·ml^-1）为横坐标，峰面积平均值（y）为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程和相关系数，见表2。结果显示，32个被测脂肪酸甲酯化成分在各自质量浓度范围内与其峰面积呈良好线性关系（r=0.9871~0.9976)。

表232种脂肪酸的线性关系考察结果

2.1.4样品测定取紫斑牡丹花粉样品按“2.1.1”项下方法操作制备供试品溶液，依“2.1.2”项下色谱条件进样分析，5批样品测定结果见表3。

表3紫斑牡丹花粉中脂肪酸含量测定结果（μg·mg^-1）

2.1.5结果

本发明采用gc-ms-sim法分析紫斑牡丹花粉脂肪酸含量，该方法分析速度快，专属性好，灵敏度高，操作简便。分析结果表明，甘肃紫斑牡丹花粉中主要含有c6~c24的18种脂肪酸，总量在7.49~8.67μg·mg^-1之间，其中辛酸、十四烷酸、十六烷酸、油酸、亚油酸、亚麻酸含量较高；紫斑牡丹花粉中的脂肪酸以不饱和脂肪酸为主，不饱和脂肪酸占脂肪酸总量的50.46%~60.96%。

本发明对破壁紫斑牡丹花粉中的脂肪酸进行分析，结果表明，破壁的紫斑牡丹花粉中脂肪酸类化合物的含量明显高于不破壁的花粉，破壁的紫斑牡丹花粉中脂肪酸总量是未破壁样品的6~7倍，其中亚油酸、γ-亚麻酸、油酸、十六烷酸的提取分别增高了15、11.6、1.7、8.5倍。由此可见，紫斑牡丹花粉的破壁，更有利于脂肪酸类成分的溶出与提取，这为进一步开发利用紫斑牡丹花粉提供了技术支撑。

2.2牡丹花粉氨基酸的含量测定

2.2.1溶液的制备混合对照品溶液：精密量取混合氨基酸对照品（由sigma-aldrich公司提供，批号：slbm6769v，供氨基酸鉴别和含量测定用，包括ala、arg、asp、cys、glu、gly、his、ile、leu、lys、met、phe、pro，ser、thr、tyr、val）适量，加稀释液制成浓度为50nmol·l^-1(胱氨酸)和100nmol·l^-1(其余16种氨基酸)的混合对照品溶液，4℃保存。

缓冲液a：称取柠檬酸三钠11.8g、柠檬酸6g，加适量水溶解，再加乙醇65ml和浓盐酸5.6ml，然后用水稀释至1l（调ph至3.45），并用0.45μm滤膜过滤。

缓冲液b：称取柠檬酸三钠19.6g、氢氧化钠3.1g、硼酸5.0g，加适量水溶解，稀释至1l（调ph至10.85），并用0.45μm滤膜过滤。

再生液c：称取氢氧化钠20.0g、edta0.2g，用水溶解，稀释至1l，并用0.45μm滤膜过滤。

样品稀释液：称取柠檬酸三钠11.8g、浓盐酸10.4ml，用水稀至1l（调ph至2.20），并用0.45μm滤膜过滤。

茚三酮衍生化试剂：称取茚三酮20g、苯酚2g、用400ml钾钠缓冲液和600ml甲醇溶解，并用0.45μm滤膜过滤。

供试品溶液：精密称取样品粉末0.2g，置于水解管中，加6mol·l^-1盐酸10ml，加入新蒸馏的苯酚3滴；将水解管置于-18℃冰箱中冷冻5min后，通氮气封口，置110℃烘箱内水解22h，取出放冷至室温，打开水解管，将水解液过滤后，用去离子水多次冲洗水解管，将水解液全部转移至250ml容量瓶内用去离子水定容；吸取上述溶液1ml于10ml烧杯内，蒸干，残留物用1ml水溶解，再干燥，反复进行两次。将残渣用1ml样品稀释液溶解至离心管中，10000r·min^-1离心10min，0.45μm微孔滤膜滤过，即得。

2.2.2色谱条件采用德国sykam公司s-433d氨基酸全自动分析仪(含s7130溶剂存放单元、s5200全自动进样器、s4300氨基酸反应模块、s2100梯度泵)，色谱柱：磺酸基强酸性阳离子交换树脂lcak06/na，（4.6mm×150mm，5μm）；流动相：缓冲液a、缓冲液b、再生液c；茚三酮为衍生化试剂。检测波长440nm（脯氨酸）和570nm（其余氨基酸）；进样量：50μl；流速：a泵（洗脱泵）0.45ml·min^-1，m泵（衍生泵）0.25ml·min^-1，梯度洗脱程序见表4。分别精密吸取上述混合对照品溶液和供试品溶液各50μl，按“2.2.2”项下色谱条件进行测定。结果：选择2个检测波长440nm(脯氨酸)和570nm(其余氨基酸)，混合对照品和样品中的氨基酸得到了很好的分离，色谱图见图3、图4。

表4梯度洗脱程序

2.2.3线性关系考察分别精密吸取氨基酸混合对照品溶液配制成浓度分别为20、40、80、160、200nmol·l^-1的系列对照品溶液，按上述色谱条件注入氨基酸分析仪，测定峰面积，以峰面积y对氨基酸浓度x(μg·ml^-1)进行线性回归，得回归方程见表5。

表517种氨基酸的线性关系

2.2.4样品测定精密称取破壁前后紫斑牡丹花粉样品，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，平行制样3份，按上述色谱条件，分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液各50μl进样测定，以外标法计算含量。结果表明，破壁前紫斑牡丹花粉中平均总氨基酸含量为31.67%，破壁紫斑牡丹花粉中平均总氨基酸含量为33.05%，见表6。

表6紫斑牡丹花粉中水解氨基酸的测定结果(%，n=3)

注:*代表必需氨基酸。

2.2.5结果

本发明将样品酸水解处理，采用柱后衍生阳离子交换色谱法，建立的测定甘肃紫斑牡丹花粉中17种氨基酸的方法，具有操作方便、快捷、稳定性好等特点。分析结果表明：紫斑牡丹花粉中，含有人体必须氨基酸总含量达130.6mg·g-1，营养丰富，值得深入开发和利用。

本发明通过对紫斑牡丹花粉破壁前后水解氨基酸的含量进行测定，发现花粉破壁前后氨基酸的总量及各氨基酸含量没有显著性差异，究其原因可能与它们均经过水解且都水解的比较彻底有关。另外也说明破壁花粉的活性物质流失少。

3、本发明所获得的牡丹破壁花粉具有很高的营养价值、药用价值，且获得的牡丹花粉破壁产品更利于人体吸收，可制成胶囊剂、片剂、颗粒剂、口服液等剂型及其复方制剂。

4、本发明工艺简单、成本低、易操作，破壁效率高，纯度高，具有很好的市场前景和利润空间。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1为本发明紫斑牡丹花粉32种脂肪酸甲酯混合对照品总离子流色谱图。

图2为本发明紫斑牡丹花粉中脂肪酸甲酯总离子流色谱图。

图3为本发明混合对照品色谱图。图中1.天冬氨酸(asp)；2.苏氨酸(thr)；3.丝氨酸(ser)；4.谷氨酸(glu)；5.甘氨酸(gly)；6.丙氨酸(ala)；7.缬氨酸(val)；8.蛋氨酸(met)；9.胱氨酸(cys)；10.异亮氨酸(ile)；11.亮氨酸(leu)；12.酪氨酸(tyr)；13.苯丙氨酸(phe)；14.组氨酸(his)；15.赖氨酸(lys)；16.精氨酸(arg)；17.脯氨酸(pro)。

图4为本发明紫斑牡丹花粉样品色谱图。

具体实施方式

实施例1牡丹花粉的破壁方法，该方法是指将牡丹花粉200g按厚度≤0.5cm均匀铺设在白色瓷盘上面后覆盖白布，并置于日光充足地方晒干或于40~50℃温度下烘干，当花粉中水分≤5%时经七号筛除杂，即得精选的牡丹花粉；将精选的牡丹花粉装入密闭容器（塑料容器中并加盖密封）内，并置于日本三洋mdf-c2156van低温冷冻存储箱中经-150℃冷冻冷冻20~32h后，按冷冻后牡丹花粉体积的20倍迅速加入沸水，摇匀，置20℃水浴中以550~650rpm的速率搅拌7h，得到花粉混合溶液；花粉混合溶液在深圳市优米仪器设备有限公司生产的gl21m立式高速冷冻离心机中以3000~3500rpm的速率离心8min~10min，得到固体物质，该固体物质于25℃~35℃干燥6~10h后，经45℃微波灭菌处理30min即得破壁牡丹花粉成品（破壁率大于92%）。

实施例2牡丹花粉的破壁方法，该方法是指将牡丹花粉200g按厚度≤0.5cm均匀铺设在白色瓷盘上面后覆盖白布，并置于日光充足地方晒干或于40~50℃温度下烘干，当花粉中水分≤5%时经七号筛除杂，即得精选的牡丹花粉；将精选的牡丹花粉装入济南龙威制药设备有限公司生产的lwf6-tbi低温细胞壁破壁超微粉粹机料斗中，启动仪器粉碎20~25min，取出，经45℃微波灭菌处理30min即得破壁牡丹花粉成品（破壁率大于97%）。

上述实施例1~2中，牡丹花粉为丹凤牡丹（paeoniaostiit.hongetj.x.zhang）或紫斑牡丹[paeoniarockii（s.g.haw.et.laeuner）t.hanget.t.j.li]的花粉。