阴阳离子分别键合的两性离子亲水作用色谱固定相、制备方法及其应用与流程

本发明属于高效液相色谱固定相领域，具体涉及一种阴阳离子分别接枝的两性离子键合硅胶作为亲水作用色谱固定相、制备方法和分离应用。

背景技术：

近年来，亲水作用色谱(HILIC)在分离极性和亲水性样品方面得到越来越多的应用，得到了广泛的关注，目前已经成为色谱领域的研究热点，其能够很好的保留反相色谱(RPLC)中不保留或保留弱的强极性和亲水性物质，同时解决了正相色谱(NPLC)中样品的溶解性问题并提高了与质谱的兼容性，显示出非常好的应用前景。对HILIC的应用来说，固定相的开发对选择性和分离效率具有很大的影响，在一定程度上决定着HILIC的应用。然而，目前HILIC固定相方面仍然存在亲水性不足、柱效低下、寿命较短以及种类有限对极性化合物的覆盖不足等问题，因此，新型HILIC固定相的开发对于扩展HILIC的覆盖范围，促进其发展具有重要意义，现在已经成为色谱领域的重要研究分支。HILIC固定相目前主要包括直接使用的NPLC固定相(如裸硅胶、氨基、氰基和二醇基修饰的材料)以及近年来开发的专门用于HILIC的固定相，主要是将一些极性和亲水性分子键合到基质支撑材料表面(通常是硅胶)，如常见的酰胺基团、糖类等多羟基分子和两性离子等。其中，两性离子分子中同时存在着正负电荷中心，具有良好的亲水性使其非常适合作为HILIC键合相，这类HILIC固定相目前显示很好的色谱性能，得到广泛的应用。基于两性离子的HILIC固定相主要有基于磺基甜菜碱和磷酸胆碱的两性离子键合硅胶材料(ZIC-HILIC和ZIC-cHILIC)和一些新开发的两性离子键合固定相，如通过“巯基-烯基”点击化学反应制备的基于半胱氨酸的Click TE-Cys两性离子HILIC固定相，以及基于3-P，P-二苯基膦-丙基磺酸、赖氨酸、谷胱甘肽和1-乙烯基-3-(4-磺酸根丁烷)咪唑的两性离子HILIC固定相。这些两性离子固定相中，电荷基团和分布形式有一定差异，但是正负电荷中心均通过共价键连接于分子结构中，整个分子通过一定的方式键合于固定相表面，尽管对亲水性物质显示良好的HILIC保留和分离，但是正负电荷排布互相束缚，不能自由伸展以与分析物相互作用。

离子液体作为固定相键合分子，其设计性强，可以根据需求设计合成不同类型的满足要求的键合相，另外，离子液体多重溶剂化相互作用有利于与溶质分子的相互作用，从而提供良好的保留和分离选择性。因此，离子液体键合固定相在近十年来得到极大的发展，主要用于反相和离子交换模式，而近几年在HILIC领域也显示出初步的潜力，新报道的新型表面键合离子液体固定相在HILIC模式下显示很好的保留和分离，包括咪唑两性离子、葡糖胺离子液体、双阳和三阳离子液体表面键合HILIC固定相，而离子液体的可设计性也使得便于设计亲水性能良好的结构HILIC保留。目前离子液体键合硅胶固定相均是通过单一的阴离子或阳离子键合引入固定相表面，假如将阴阳离子均设计成具有活性官能团可键合于固定相表面的结构，那么得到的HILIC固定相是阴阳离子各自通过共价键分别键合于硅胶表面的固定相，既是表面键合离子液体固定相，也是新形式的两性离子固定相，正负电荷分布相互不受束缚，便于各自更好的与分析物相互作用，带来更好的保留和独特的分离选择性，并且阴阳离子比例调节来改善分离。本发明基于此，拟发展阴阳离子可分别共价接枝的离子液体，，将其键合至固体基质表面作为新型两性离子HILIC固定相，应该会显示良好的HILIC保留行为和独特的色谱性能。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供一种阴阳离子分别键合的两性离子亲水作用色谱固定相、制备方法及其应用。该两性离子亲水作用色谱固定相表面的阴阳离子分别通过化学键各自接枝于填料表面，正负电荷分布自由，可以更好的与分析物作用。

本发明的技术方案为：

阴阳离子分别键合的两性离子亲水作用色谱固定相，该两性离子亲水作用色谱固定相为3-巯基丙基修饰的二氧化硅球表面键合离子液体A的材料；通过“巯基-双键”点击化学反应，将离子液体A键合至3-巯基丙基修饰的二氧化硅球表面制备得到，键合分子为末端均为丙烯酸酯结构的阴阳离子的离子液体A。

所述的3-巯基丙基修饰的二氧化硅球，通过(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷或(3-巯基丙基)三乙氧基硅烷与二氧化硅球在无水甲苯中惰性气氛下加热回流制得。二氧化硅球表面的3-巯基丙基基团的键合摩尔量为2.0～4.0μmol/m²。

所述的离子液体A末端均为丙烯酸酯结构的阴阳离子，是由反离子为无机负离子和无机正离子的两种离子液体通过离子交换制备得到的；固定相中离子液体A的表面键合摩尔量为1.5～3.0μmol/m²；其结构式如下：

其中，n和m为0～2的整数；阴离子部分X^-为SO₃^-、PO₄^-、PF₆^-、BF₄^-或COO^-中的一种；阳离子部分Y⁺为咪唑正电荷季铵根正离子、膦盐正离子或其它一些正离子结构。

上述两性离子亲水作用色谱固定相的制备方法，包括如下步骤：

1)制备3-巯基丙基修饰的二氧化硅球

将二氧化硅球与(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷或(3-巯基丙基)三乙氧基硅烷按质量比为1：1～2：1加入无水甲苯中，惰性气体保护下，在105-115℃条件加热回流反应18～25小时，得到表面键合有3-巯基丙基的二氧化硅球。其中，二氧化硅球质量与无水甲苯的体积用量比为1g：10～15mL。

2)将步骤1)得到的表面键合有3-巯基丙基的二氧化硅球分散于溶解离子液体A的甲醇中，再加入引发剂AIBN，搅拌均匀后，惰性气体保护下，在50～70℃条件加热至回流反应16～30小时得到目标固定相。

所述的离子液体A中的丙烯酸酯双键与3-巯基丙基官能团的摩尔比为1.0～2.0：1；所述的引发剂的质量为3-巯基丙基的二氧化硅球和离子液体A总质量的0.5～2％。

离子液体A的制备方法为：制备末端为丙烯酸酯结构的甲基咪唑离子液体，并通过离子交换得到末端均为丙烯酸酯结构的阴阳离子结合的离子液体A。

3)采用匀浆法，将步骤2)得到的目标固定相填料分散于甲醇中制成匀浆液，其中，目标固定相质量与甲醇体积用量的比例为1.0g：10～15mL；再以甲醇作为顶替液，在50～65MPa的压力下，填充至不锈钢管柱中得到阴阳离子分别键合的两性离子亲水作用色谱固定柱，色谱固定柱内为阴阳离子分别键合的两性离子亲水作用色谱固定相。

上述两性离子亲水作用色谱固定相在亲水作用色谱模式下用于分离不同类型的极性和亲水性物质，选择性能够通过改变阴阳离子的比例调节。所述的极性和亲水性物质为核苷和碱基、有机酸、碱性药物以及氨基酸等两性类物质。

本发明的有益效果为，本发明提供的两性离子HILIC固定相构型和电荷排布新颖，正负电荷结构自由且相互不受影响，还可根据需要调整正负电荷的比例，对不同类型的极性和亲水性物质分离，均显示有效的保留和良好的分离选择性，具有一定的应用前景。

附图说明

图1为阴阳离子分别键合的两性离子固定相的制备示意图；

图2为17种核苷混合物在所制备的本发明两性离子柱上的分离色谱图；其中，色谱峰：1.5′-脱氧-5′-甲硫腺苷，2.胸腺嘧啶核苷，3.3-甲基尿苷，4.N6-甲基腺苷，5.5-甲基尿苷，6.尿苷，7.腺苷，8.5-甲基胞嘧啶，9.1-甲基鸟苷，10.肌苷，11.假尿苷，12.2′-脱氧鸟苷，13.胞苷，14.鸟苷，15.1-甲基腺苷，16.黄苷，17.7-甲基鸟苷；分离条件为流动相95％ACN(10mM NH₄FA)/H₂O(10mM NH₄FA)＝90/10(v/v)，等度洗脱；DAD：254nm；流速：0.4mL/min；柱温：30℃；

图3为11种碱基的分离色谱图；其中，色谱峰：1.胸腺嘧啶，2.尿嘧啶，3.1-甲基黄嘌呤，4.N⁴-乙酰胞嘧啶，5.1-甲基鸟嘌呤，6.腺嘌呤，7.黄嘌呤，8.次黄嘌呤，9.7-甲基鸟嘌呤，10.胞嘧啶，11.鸟嘌呤；分离条件：流动相95％ACN(10mM NH₄FA)/H₂O(10mM NH₄FA)＝90/10(v/v)，等度洗脱；DAD：254nm；流速：0.4mL/min；柱温：30℃

图4为12种核苷酸混合物的分离色谱图；其中，色谱峰：1.cTMP，2.3'：5′-cAMP，3.2′：3′-cAMP，4.cIMP，5.cGMP，6.cCMP；7.TMP，8.UMP，9.AMP，10.IMP，11.CMP，12.GMP；分离条件：流动相A相为H₂O(10mM NH₄FA)，B相为ACN/H₂O(95/5，v/v，10mM NH₄FA)，梯度洗脱以20％A起始并保持5min，5-10min内线性增加至40％A并保持，DAD 254nm；流速0.4mL/min，柱温：30℃；

图5(a)为6种碱性物质的分离色谱图；其中，色谱峰：1.Diphenhydramine苯海拉明；2.Nortriptyline去甲替林；3.Benzyltrimethylammonium苄基三甲铵；4.trimethylphenyl；5.procainamide；6.Benzylamine苄胺；

图5(b)为8种酸性物质的分离色谱图；其中，色谱峰：1.苯酚；2.3，5-二硝基苯甲酸；3.对甲氧基苯甲酸；4.对硝基苯甲酸；5.3-氯苯甲酸；6.苯甲酸；7.对羟基苯甲酸；8.间羟基苯甲酸.分离条件：分离条件：流动相95％ACN(10mM NH₄FA)/H₂O(10mM NH₄FA)＝90/10(v/v)，等度洗脱；DAD：254nm；流速：0.4mL/min；柱温：30℃；

图6为7种两性物质的分离色谱图；其中，色谱峰：1.对氨基苯甲酸；2.马尿酸；3.烟酸；4.乳清酸；5.phe；6.try；7.tyr；分离条件：流动相95％ACN(10mM NH₄FA)/H₂O(10mM NH₄FA)＝85/15(v/v)，等度洗脱；DAD：254nm；流速：0.4mL/min；柱温：30℃。

具体实施方式

下面通过实例进一步阐释本发明，实例仅限于说明本发明以便于理解，而非对本发明的限定。

阴阳离子可分别键合的离子液体的制备

阴阳离子分别键合的两性离子固定相的制备步骤如图1所示。将1.23g 2-溴乙基丙烯酸酯溶解在少量乙酸乙酯在中，边搅拌边加入3.0g 1-甲基咪唑，在氩气保护下反应液避光反应约24小时，直至反应物生成致搅拌不动。静置除去上层溶剂，粘稠的产物用乙酸乙酯洗涤4-5除去未反应的原料，60℃真空干燥，得到产物1。得到的产物1与3-磺丙基丙烯酸盐钾盐通过离子交换得到产物2，然后将产物2键合至二氧化硅球表面得到目标固定相。

将合成的产物1与3-磺丙基丙烯酸盐钾盐进行离子交换，制备阴阳离子中均含有可反应的活性基团的产物2，具体步骤如下。将1.4957g的产物1溶解在15mL去离子水中，搅拌下加入溶解在15mL去离子水中的3-磺丙基丙烯酸盐钾盐1.3332g，充分搅拌下离子交换反应进行约30小时。反应液直接减压旋蒸出去水分，得到的产物2于60℃真空干燥，生成的NaBr盐未除去，在后续将产物2键合至硅胶表面的步骤中通过洗涤和离心出去。

阴阳离子分别键合的两性离子固定相的制备

首先，通过硅烷化反应在二氧化硅球表面接枝活性官能团3-巯基丙基，将6.6g二氧化硅球(粒径5μm，孔径10nm，比表面积310m²g^-1)分散在72mL无水甲苯中，搅拌均匀，加入4.0mL(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷，在氩气保护下加热回流24小时，离心，用甲醇洗涤6次，得到3-巯基丙基修饰的二氧化硅球，真空60℃干燥待用。

其次，将实施例得到的产物2通过巯基与双键的点击化学反应键合至3-巯基丙基修饰的二氧化硅球表面，将3.24g 3-巯基丙基修饰的硅球分散于溶解有产物2的55mL甲醇中，搅拌分散混合均匀，加入0.08g溶解在10mL甲醇中的引发剂AIBN，在氩气保护下加热至60℃回流反应26小时，反应液离心后，用甲醇、水、甲醇依次洗涤，得到目标固定相，真空60℃干燥待装柱。

最后，将得到的阴阳离子分别键合的两性离子固定相填料装填成3.0mm×15cm的液相色谱柱，采用匀浆法，以50mL甲醇作为顶替液，在60MPa的压力下将匀浆液(目标固定相1.2g分散在12mL甲醇中)填充至不锈钢管柱中。

阴阳离子分别键合的两性离子固定相的评价

对所得固定相进行元素分析表征表面键合量，结果为C％14.94，N％1.65，S％4.27，3-巯基丙基的二氧化硅球元素分析结果为C％3.93，S％2.64，以N和S元素含量计算，固定相的阴阳离子键合量相当，约为2.05～2.30μmol/m²。

对所制备的两性离子色谱柱和HILIC保留性能和分离选择性进行了评价，首先分离了典型的亲水和极性化合物，如图2和图3所示分别为对核苷混合物和碱基混合物的分离色谱图。结果显示，制备的固定相显示典型的HILIC保留行为，对典型亲水性化合物具有很好的分离选择性。之后，采用不同类型的亲水和极性混合物对两性离子固定相的色谱性能进行了进一步表征，图4、图5(a)、(b)和图6分别为核苷酸、碱性化合物和酸性化合物以及两性物质的分离结果，可以看出，所制备的色谱柱对不同类型的极性和亲水性化合物均具有良好的保留和分离选择性，作为新型HILIC固定相具有一定的应用潜力。