本发明属于生物药品制备技术领域，具体涉及一种层析柱的制备方法及其产品及其在提取、纯化糖胺聚糖中的应用。
背景技术：
糖胺聚糖是存在于每个哺乳动物组织中的天然杂多糖，由重复二糖单位构成，带大量负电荷，是蛋白聚糖中聚糖部分的总称。其二糖单位由硫酸化或非硫酸化的单糖组成。糖胺聚糖的分子大小和硫酸化程度均有组织特异性，以自由链或蛋白聚糖的形式存在。可分为以下几类：肝素、硫酸乙酰肝素、透明质酸、硫酸皮肤素、4-硫酸软骨素、6-硫酸软骨素、硫酸角质素。
国内多以加工粗品糖胺聚糖为主，存在产品效价低、产品收率差、生产效率低、生产成本高等问题。各国的提取加工工艺大致相同，但是在某些关键工序或关键技术上却有不同，因而出现了产品效价、产品得率、生产效率、生产成本等差异。国外比较先进的技术主要体现在酶解分离和精制两方面，采用的酶解技术和离子交换、凝胶柱层析、亲和柱层析等精制技术都较国内先进，其关键是采用的吸附分离材料具有极大的竞争优势。
但是无论国内还是国外，在提取分离技术上都存在着工艺繁琐问题，如酶解法，后续工序中还需要除去酶蛋白等；精制过程中，离子交换、凝胶柱层析等多采用的是固定床分离纯化装置，其设备投资大、运行时间长、运行成本高及洗脱剂用量大。为此，还需要继续探索新的提取与纯化技术，以求更大效益。
因此，研究一种高效、低成本的糖胺聚糖提取纯化新工艺技术，对改变目前落后的加工状态，提高产品的质量，提高生产效率具有重要意义。
技术实现要素：
以下给出一个或多个方面的简要概述以提供对这些方面的基本理解。此概述不是所有构想到的方面的详尽综览，并且既非旨在指认出所有方面的关键性或决定性要素亦非试图界定任何或所有方面的范围。其唯一的目的是要以简化形式给出一个或多个方面的一些概念以为稍后给出的更加详细的描述之序。
本发明的目的在于解决上述问题，提供了一种层析柱的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：包括，将甲壳素细粉装柱，封柱浸泡，高温洗涤，恒温封管，ph调节。
作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述甲壳素细粉，其粒径为50～100μm。
作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述封柱浸泡，其浸泡溶液为0.05～0.1mol/l盐酸的醇溶液，时间为50～90min。
作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述高温洗涤，其温度为30～90℃，洗涤溶液为0.01～0.05mol/l盐酸的醇溶液。
作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述ph调节，其为调节至6.5～7.5。
作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述恒温封管，其为15～35℃，时间为2h。
本发明另外一个目的是提供一种上述制备方法制得的层析柱。
为解决上述技术问题，根据本发明的另外一个方面，本发明提供了如下技术方案：其ph为6.5～7.5。
作为本发明所述药物组合物的一种优选方案，其中：其所用甲壳素细粉粒径为50～100μm。
本发明还有一个目的，是提供一种上述层析柱在提取、纯化糖胺聚糖中的应用，包括原料预处理，抽提，沉淀，纯化。
为解决上述技术问题，根据本发明的另外一个方面，本发明提供了如下技术方案：所述糖胺聚糖，其为肝素。
本发明的有益效果：
1、对糖胺聚糖的提取效率方面，最高可以提高23％；
2、对糖胺聚糖的提取纯度方面，最高可以提高15％；
3、在对糖胺聚糖的抗病毒功能特性的增益方面，最高可以提高2.0，使用组合柱的话，最高可以提高1.7；
4、其他方面，本发明制备工艺绿色环保，并且能就经济原料进行处理，具有巨大的工业应用前景。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1(制备层析柱1)
甲壳素细粉制备装柱
将虾壳，分别用3％盐酸和4％naoh溶液反复浸泡后用去离子水洗至中性。烘干，得到甲壳素。取25g甲壳素烘干，磨成粒径为50μm细粉。将甲壳素粉装玻璃层析柱。
封住浸泡
使用0.05mol/lhcl溶液封柱浸泡，90min后用蒸馏水洗涤至中性。
高温洗涤
随后再用30-90℃0.01mol/lhcl溶液冲洗层析柱。
恒温封管
并在15℃下恒温封管2h。
ph调节
用1mol/lnaoh溶液，调ph至7.5，再用蒸馏水洗涤10个柱体积后即可使用。
实施例2(制备层析柱2)
甲壳素细粉制备装柱
将虾壳，分别用3％盐酸和4％naoh溶液反复浸泡后用去离子水洗至中性。烘干，得到甲壳素。取25g甲壳素烘干，磨成粒径为100μm细粉。将甲壳素粉装玻璃层析柱。
封住浸泡
使用1mol/lhcl溶液封柱浸泡，50min后用蒸馏水洗涤至中性。
高温洗涤
随后再用30-90℃0.01mol/lhcl溶液冲洗层析柱。
恒温封管
并在35℃下恒温封管2h。
ph调节
用1mol/lnaoh溶液，调ph至6.5，再用蒸馏水洗涤10个柱体积后即可使用。
实施例3(制备层析柱3)
甲壳素细粉制备装柱
将虾壳，分别用3％盐酸和4％naoh溶液反复浸泡后用去离子水洗至中性。烘干，得到甲壳素。取25g甲壳素烘干，磨成粒径为70μm细粉。将甲壳素粉装玻璃层析柱。
封住浸泡
使用0.75mol/lhcl溶液封柱浸泡，70min后用蒸馏水洗涤至中性。
高温洗涤
随后再用30-90℃0.01mol/lhcl溶液冲洗层析柱。
恒温封管
并在20℃下恒温封管2h。
ph调节
用1mol/lnaoh溶液，调ph至7.0，再用蒸馏水洗涤10个柱体积后即可使用。
实施例4(制备层析柱4)
甲壳素细粉制备装柱
将虾壳，分别用3％盐酸和4％naoh溶液反复浸泡后用去离子水洗至中性。烘干，得到甲壳素。取25g甲壳素烘干，磨成粒径为150μm细粉。将甲壳素粉装玻璃层析柱。
封住浸泡
使用2mol/lhcl溶液封柱浸泡，20min后用蒸馏水洗涤至中性。
高温洗涤
随后再用30-90℃0.01mol/lhcl溶液冲洗层析柱。
恒温封管
并在40℃下恒温封管1h。
ph调节
用1mol/lnaoh溶液，调ph至6.0，再用蒸馏水洗涤10个柱体积后即可使用。
实施例5(制备层析柱5)
甲壳素细粉制备装柱
将虾壳，分别用3％盐酸和4％naoh溶液反复浸泡后用去离子水洗至中性。烘干，得到甲壳素。取25g甲壳素烘干，磨成粒径为20μm细粉。将甲壳素粉装玻璃层析柱。
封住浸泡
使用0.05mol/lhcl溶液封柱浸泡，120min后用蒸馏水洗涤至中性。
高温洗涤
随后再用30-90℃0.01mol/lhcl溶液冲洗层析柱。
恒温封管
并在5℃下恒温封管4h。
ph调节
用1mol/lnaoh溶液，调ph至8.0，再用蒸馏水洗涤10个柱体积后即可使用。
实施例6(肝素分离提纯例)
甲壳素辅助肝素提取方法具体步骤如下：
(1)脱脂：畜产品的小肠、鱼类的内脏作为提取原料,组织搅碎机搅碎成糜后,按1:2(w/v)加4℃预冷丙酮脱脂，搅拌，离心去丙酮。丙酮完全挥发后，样品在4℃干燥保存。
(2)抽提：702g样品中加1000ml提取缓冲液(0.01mol/lpbsph6.0，含0.15mol/lnacl)搅拌30min。加0.25％胰蛋白酶，60℃过夜提取后，10000r/min、4℃离心40min后，弃沉淀取上清液。
(3)硫酸铵沉淀得到蛋白聚糖：上述抽提液浓缩后加入固体硫酸铵，至45％饱和度后搅拌30min，4℃静置4h后,10000r/min离心15min，弃上清液，沉淀物溶于200ml蒸镏水，透析脱盐，用0.1mol/lba(oh)2检验透析液中无so42-，离心去除不溶物。
(4)加入脱蛋白液(1:4正丁醇:三氯甲烷)脱蛋白，得到肝素粗品。
(5)肝素提取纯化
用0.05mol/ltris-hcl(ph7.8，含3mol/l脲溶液)洗涤上述层析柱1～5，将(4)中的粗提样品上样，先用0.05mol/ltris-hcl(ph7.8，含3mol/l脲溶液)洗脱杂蛋白，然后用0.5:3mol/l的甲酸/脲溶液洗脱肝素，检测洗脱液的a595，对水透析、浓缩、冷冻干燥得纯品。
具体得率、纯度以及针对单纯疱疹病毒红细胞凝聚实验相关数据测算如下表1：
实施例7(硫酸软骨素分离提纯例)
甲壳素辅助硫酸软骨素提取方法具体步骤如下：
(1)脱脂：以畜产品、鱼类的骨作为提取原料,组织搅碎机搅碎成糜后,按1:2(w/v)加4℃预冷丙酮脱脂，搅拌，离心去丙酮。丙酮完全挥发后，样品在4℃干燥保存。
(2)抽提：702g样品中加1000ml提取缓冲液(0.01mol/lpbsph6.0，含0.15mol/lnacl)搅拌30min。加0.25％胰蛋白酶，60℃过夜提取后，10000r/min、4℃离心40min后，弃沉淀取上清液。
(3)硫酸铵沉淀得到蛋白聚糖：上述抽提液浓缩后加入固体硫酸铵，至45％饱和度后搅拌30min，4℃静置4h后,10000r/min离心15min，弃上清液，沉淀物溶于200ml蒸镏水，透析脱盐，用0.1mol/lba(oh)2检验透析液中无so42-，离心去除不溶物。
(4)加入脱蛋白液(1:4正丁醇:三氯甲烷)脱蛋白，得到肝素粗品。
(5)硫酸软骨素提取纯化
用0.05mol/ltris-hcl(ph7.8，含3mol/l脲溶液)洗涤上述层析柱1～5，将(4)中的粗提样品上样，先用0.05mol/ltris-hcl(ph7.8，含3mol/l脲溶液)洗脱杂蛋白，然后用0.5:3mol/l的甲酸/脲溶液洗脱硫酸软骨肝素，检测洗脱液的a595，对水透析、浓缩、冷冻干燥得纯品。
具体得率、纯度相关数据测算如下表2：
实施例8(硫酸皮肤素分离提纯例)
甲壳素辅助硫酸皮肤素提取方法具体步骤如下：
(1)脱脂：以畜产品、鱼类皮作为提取原料,组织搅碎机搅碎成糜后,按1:2(w/v)加4℃预冷丙酮脱脂，搅拌，离心去丙酮。丙酮完全挥发后，样品在4℃干燥保存。
(2)抽提：702g样品中加1000ml提取缓冲液(0.01mol/lpbsph6.0，含0.15mol/lnacl)搅拌30min。加0.25％胰蛋白酶，60℃过夜提取后，10000r/min、4℃离心40min后，弃沉淀取上清液。
(3)硫酸铵沉淀得到蛋白聚糖：上述抽提液浓缩后加入固体硫酸铵，至45％饱和度后搅拌30min，4℃静置4h后,10000r/min离心15min，弃上清液，沉淀物溶于200ml蒸镏水，透析脱盐，用0.1mol/lba(oh)2检验透析液中无so42-，离心去除不溶物。
(4)加入脱蛋白液(1:4正丁醇:三氯甲烷)脱蛋白，得到肝素粗品。
(5)硫酸皮肤素提取纯化
用0.05mol/ltris-hcl(ph7.8，含3mol/l脲溶液)洗涤上述层析柱1～5，将(4)中的粗提样品上样，先用0.05mol/ltris-hcl(ph7.8，含3mol/l脲溶液)洗脱杂蛋白，然后用0.5:3mol/l的甲酸/脲溶液洗脱硫酸皮肤素，检测洗脱液的a595，对水透析、浓缩、冷冻干燥得纯品。
具体得率、纯度相关数据测算如下表3：
实施例9(硫酸角质素分离提纯例)
甲壳素辅助硫酸角质素提取方法具体步骤如下：
(1)脱脂：以畜、鱼类的角膜、角作为提取原料,组织搅碎机搅碎成糜后,按1:2(w/v)加4℃预冷丙酮脱脂，搅拌，离心去丙酮。丙酮完全挥发后，样品在4℃干燥保存。
(2)抽提：702g样品中加1000ml提取缓冲液(0.01mol/lpbsph6.0，含0.15mol/lnacl)搅拌30min。加0.25％胰蛋白酶，60℃过夜提取后，10000r/min、4℃离心40min后，弃沉淀取上清液。
(3)硫酸铵沉淀得到蛋白聚糖：上述抽提液浓缩后加入固体硫酸铵，至45％饱和度后搅拌30min，4℃静置4h后,10000r/min离心15min，弃上清液，沉淀物溶于200ml蒸镏水，透析脱盐，用0.1mol/lba(oh)2检验透析液中无so42-，离心去除不溶物。
(4)加入脱蛋白液(1:4正丁醇:三氯甲烷)脱蛋白，得到肝素粗品。
(5)硫酸角质素提取纯化
用0.05mol/ltris-hcl(ph7.8，含3mol/l脲溶液)洗涤上述层析柱1～5，将(4)中的粗提样品上样，先用0.05mol/ltris-hcl(ph7.8，含3mol/l脲溶液)洗脱杂蛋白，然后用0.5:3mol/l的甲酸/脲溶液洗脱硫酸角质素，检测洗脱液的a595，对水透析、浓缩、冷冻干燥得纯品。
具体得率、纯度相关数据测算如下表4：
实施例10(ab组合柱)
制备b柱
材料准备
将需要活化的cnbr-activatedsepharosetm4b，悬浮于1mmol/lhcl中，溶胀15min后用1mmol/lhcl在烧结玻璃滤器中进行洗涤，分数次洗涤后待用；
称取所需量的，溶解在0.1mol/lnahco3溶液中(ph8.3，含0.5mol/lnacl)，按每1gsyndecan-1加5ml比例加入。
偶联反应
取cnbr-activatedsepharosetm4b湿胶10ml加2mol/lna2co3溶液10ml，4℃边搅拌边加入每1ml含cnbr2g的乙腈溶液1.25ml，用1mol/lnaoh调至ph6.5～7.5，反应5min，抽滤。
分别用4℃冷蒸馏水洗至中性，再用0.1mol/lph7.5磷酸盐缓冲液(pbs)洗涤，抽滤。
加0.1mol/lph7.5的pbs5ml，搅拌均匀，按每1ml凝胶加8mg的比例混合溶液和已处理好的凝胶于带塞的玻璃容器中。
在15～20℃下，调节振幅为15～20mm，振荡频率为100～150rpm，震荡1～1.5h。
用至少5倍凝胶体积的2％nacl、蒸馏水洗涤，将多余未偶联的凝集素洗去，抽滤，得偶联的syndecan-1-sepharose4b。
用2～3倍凝胶体积的ph8.0、0.1mol/ltris-hcl缓冲液封闭cnbr-activatedsepharosetm4b上多余的活性基团，4℃过夜。
再用0.1mol/lph7.5的pbs洗涤凝胶，待用。
功能肝素分离提纯
甲壳素辅助肝素提取方法具体步骤如下：
(1)脱脂：畜产品的小肠、鱼类的内脏作为提取原料,组织搅碎机搅碎成糜后,按1:2(w/v)加4℃预冷丙酮脱脂，搅拌，离心去丙酮。丙酮完全挥发后，样品在4℃干燥保存。
(2)抽提：702g样品中加1000ml提取缓冲液(0.01mol/lpbsph6.0，含0.15mol/lnacl)搅拌30min。加0.25％胰蛋白酶，60℃过夜提取后，10000r/min、4℃离心40min后，弃沉淀取上清液。
(3)硫酸铵沉淀得到蛋白聚糖：上述抽提液浓缩后加入固体硫酸铵，至45％饱和度后搅拌30min，4℃静置4h后,10000r/min离心15min，弃上清液，沉淀物溶于200ml蒸镏水，透析脱盐，用0.1mol/lba(oh)2检验透析液中无so42-，离心去除不溶物。
(4)加入脱蛋白液(1:4正丁醇:三氯甲烷)脱蛋白，得到肝素粗品。
(5)肝素提取纯化
用0.05mol/ltris-hcl(ph7.8，含3mol/l脲溶液)洗涤上述层析柱1～5，将(4)中的粗提样品上样，出样后进行梅姐，在进入b柱上样。出样后，用0.05mol/ltris-hcl(ph7.8，含3mol/l脲溶液)洗脱杂蛋白，然后用0.5:3mol/l的甲酸/脲溶液洗脱肝素，检测洗脱液的a595，对水透析、浓缩、冷冻干燥得纯品。
具体得率、纯度以及针对单纯疱疹病毒红细胞凝聚实验相关数据测算如下表5：
由上述实施例可见，本发明提供的产品及方法，在提取糖胺聚糖方面有显著优异效果。这是因为其优选了ph和甲壳素粒径的范围，综合各个环节温度、时间的控制的协同增益作用。发明人经研究发现，对糖胺聚糖分离提纯的效果好坏，取决于微观上甲壳素在柱载体中的分布情况，柱压的高低，以及醇酸反应中p条件和温度、时间的综合作用。本发明通过对各个环节的参数有效控制，保证反应中，甲壳素活性位点多，ph和反应时间及温度保证甲壳素表面活性适度，继而得到较好效果。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。