涉及连续流动液滴反应的系统和方法与流程

交叉引用

本申请要求于2016年12月28日提交的美国临时申请号62/439,814和于2016年11月28日提交的美国临时申请号62/427,086的权益，其各自通过引用整体并入本文。

背景技术：

核酸的定量是医学和生物学应用中不可缺少的技术。用于检测和定量核酸的新方法，如基于乳液的数字核酸扩增，包括基于乳液的聚合酶链反应(pcr)，与传统的核酸扩增，如传统的聚合酶链反应(pcr)方法相比，提供更高的准确性和便利性。特别地，基于乳液的数字核酸扩增允许对样品中核酸序列的高度准确的绝对定量。然而，在大多数系统中进行基于乳液的数字核酸扩增仍然需要制备样品，其中在通过基于乳液的数字核酸扩增进行分析之前，将核酸与引物或探针组合。

技术实现要素：

本文提供了使用连续流动仪器检测和定量核酸的系统和相关方法。如本文所述的分析系统可以是连续流动仪器，其包括用于预期化学反应如包括pcr和逆转录pcr(rt-pcr)中的至少一种的核酸扩增以及对预期化学反应的产物的检测的所有组件。

本文的系统、装置和相关方法有助于对样品进行快速、可靠、准确的接触点分析。使用最少的预输入处理分析样品，以便于在现场条件下或当样品制备环境不是可行的实验室条件(非实验室条件)下进行分析。主要的样品处理在装置内部，使得可以实现只需极少外部样品处理的“进血出数据(blood-indata-out)”工作流程。流水线的样品处理允许数据采集在护理点(如临床环境)或样品采集点(如现场或疫源地)快速进行。由于样品处理很少，因此在一些情况下，在将样品应用到装置之前不需要将样品送到实验室进行处理。成本、处理时间、使用者的专业水平、样品处理中的人为错误风险以及实验室技术人员在处理传染性或其他危险样品时的风险显著降低。

本文配置的一些分析系统用于进行基于乳液的数字核酸扩增。分析系统通常包括存储区域，其被配置用于储存用于在系统上执行的化学反应的所有试剂，并且该系统包括用于在系统上的化学反应的所有装置组件。因此，使用者可以向系统提供包含靶核酸的样品，并且系统可以执行基于乳液的数字核酸扩增而无需来自使用者的进一步试剂输入。在一些实施方式中，该系统可以被配置为包括用于预处理包含靶核酸的样品的试剂，如用于核酸纯化和/或提取(例如，细胞裂解)的试剂。例如，细胞、血液、呼吸道液和/或尿液可以由系统预处理以提取dna或rna，而不必使用不同的工具进行预处理。通常，本文所述的系统是便携式的。如本文所述的系统允许处理靶核酸样品而不将样品暴露于外部污染。该系统可以被配置用于为工艺流程提供预期体积的样品核酸和/或试剂的准确和自动注射。由系统提供的预期量的样品核酸和试剂的准确和自动注射使得能够在现场按需和/或作为医院和研究实验室中的桌面工具对样品核酸进行紧凑、便携、连续流动处理。

援引并入

本说明书中提及的全部出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，其程度如同特别且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用并入。

附图说明

图1描绘了过程工作流程。

图2描绘了系统组件的示例性布置。

图3描绘了用于进行测定的系统的示例性布置，该系统包括聚结器(coalescer)、液滴发生器、反应器、探测器和控制器。

图4描绘了包括聚结器、反应器、探测器和控制器的系统的示例性布置。

图5描绘了包括独立注射器的注射器布置。

图6描绘了包括具有开关的相同注射器的注射器布置。

图7描绘了包括具有多个端口的注射器的注射器布置。

图8描述了使用注射器的过程工作流程。

图9描绘了注射器的组件。

图10描绘了注射器的入口和出口的布置。

图11描绘了注射器的腔的布置。

图12描绘了注射器的腔的替代布置。

图13描绘了包括一个通道的圆柱形筒的横截面。

图14描绘了包括两个通道的圆柱形筒的横截面。

图15描绘了注射器的腔的不同布置。

图16描绘了盒的组件。

图17描绘了盒的入口和出口的布置。

图18描绘了盒的腔的布置。

图19描绘了盒的腔的替代布置。

图20描绘了具有独立入口的聚结器布置。

图21描绘了具有共同入口的聚结器布置

图22描绘了具有相同高度的独立入口的聚结器布置。

图23描绘了具有独立入口和重力辅助收集的聚结器布置。

图24描绘了在连续相出口处具有阀的聚结器布置。

图25描绘了重力阱聚结器的横截面。

图26描绘了具有较小通道直径的重力阱聚结器的横截面。

图27描绘了具有旋转密封的重力阱聚结器的组件。

图28描绘了重力阱聚结器的入口和出口的布置。

图29描绘了重力阱聚结器的腔的布置。

图30描绘了重力阱聚结器的腔的替代布置。

图31描绘了探测器的过程工作流程。

图32描绘了包括光电探测器和不与光电探测器共同定位的激发源的探测器的配置。

图33描绘了包括光电探测器、激发源和二向色转向镜的探测器的配置。

图34描绘了包括光电探测器、激发源、二向色转向镜和滤波器的探测器的配置。

图35描绘了包括两个光电探测器、激发源和两个二向色镜的探测器的配置。

图36描绘了包括两个光电探测器、两个激发源、滤波器和二向色镜的探测器的配置。

图37描绘了包括光电探测器、两个激发源和控制器的探测器的配置。

图38描绘了包括两个激发源和光电探测器的探测器的配置。

图39描绘了允许多路复用的探测器的配置。

具体实施方式

本文提供了用于进行基于连续流动乳液的化学反应的系统和相关方法。在一些实施方式中，本文所述的一种或多种系统被配置用于在液滴中进行所需的化学反应，包括用于分析提供给系统的样品中的靶标分析物(如核酸)的化学反应，和/或用于化学合成的化学反应，包括药物化合物的化学合成。在一些实施方式中，本文所述的一个或多个系统被配置用于进行化学反应以处理包含感兴趣分析物的流体样品。如本文所述的系统可以被配置用于执行化学反应以提取或定量感兴趣的分析物，而无需提供分析物的分析。如本文所述的系统可以被配置用于进行裂解反应以从细胞中提取靶核酸，而不进行靶核酸的分析。如本文所述的系统可以被配置用于进一步进行靶核酸的分析。例如，该系统可以被配置用于进行靶核酸的核酸扩增。如本文所述的系统可以被配置用于进行化学反应以合成靶标化学化合物，包括靶标药物化合物的合成。

通过核酸扩增的核酸检测和定量可用于各种研究和医学应用。需要能够快速且准确地检测和定量核酸。与传统的核酸扩增如传统pcr方法相比，基于乳液的数字核酸扩增有更高的灵敏度。然而，基于乳液的数字核酸扩增通常涉及靶核酸样品和/或试剂的手动制备，以及液滴在系统中的稳定和转运。

本文提供了使用连续流动仪器检测和定量核酸的系统和相关方法，其中用于基于乳液的数字核酸扩增(如pcr)的所有组分是系统内自包含的。在一些实施方式中，配置用于基于乳液的数字核酸扩增的分析系统被配置为包括用于系统上的基于乳液的数字核酸扩增的所有试剂。在一些实施方式中，该系统可以被配置为包括用于进行除基于乳液的数字核酸扩增之外的反应的试剂，包括例如用于样品核酸纯化和/或提取(例如，细胞裂解)的试剂。通常，本文描述的系统是便携式的。如本文所述的分析系统提供了基于乳液的数字核酸扩增的所有必需组分，而无需在系统操作的不同阶段中的使用者干扰。例如，使用者可以向如本文所述的系统提供包含靶核酸的样品，并且样品的分析可以在连续工作流程中进行，而无需使用者进行任何额外的流体和/或消耗品处理。如本文所述的系统允许处理靶核酸样品而不将样品暴露于外部污染。在一些情况下，诸如包含细胞、血液、呼吸道液和/或尿液的水等样品在被处理以在如本文所述的系统中进行分析之前不需要进行预处理来提取dna或rna。

包含靶核酸的样品可以同时处理以用于并行多重检测或者顺序处理以用于串行多重检测。分析系统可以包括至少一个零死体积注射器(zero-deadvolumeinjector)，其配置用于自动且准确地注射样品核酸和/或试剂。如本文将进一步详细描述的，零死体积注射器可以包括注射阀，如具有零死体积的注射阀，使得系统中用于反应的流体可以在没有使用者干扰的情况下自动且精确地计量。核酸样品和试剂，如引物、探针、聚合酶和/或游离核苷酸可以从盒、系统上的储器或样品入口提供，并且可以在系统内组合以形成液滴，如反应液滴，其包含样品核酸和用于所需化学反应的试剂。在一些情况下，将包含样品核酸的液滴和包含试剂的液滴提供至聚结器，在此处将包含样品的液滴和包含试剂的液滴组合以形成包含样品核酸和用于核酸扩增反应的试剂的反应液滴，该核酸扩增反应包括pcr，如全基因组pcr和用于rna的逆转录pcr(rt-pcr)。在一些实施方式中，反应液滴从聚结器流到液滴发生器。液滴发生器可以将每个反应液滴分成多个液滴，例如以提供所需体积的液滴。在一些实施方式中，然后液滴可以通过反应器，其中在液滴内引发化学反应。例如，液滴可以通过热循环仪以通过一组引物和探针扩增靶分子。在一些实施方式中，反应液滴可以从聚结器流到热循环仪而不通过液滴发生器。分析系统可以包括在反应器下游的一个或多个探测器，该探测器被配置用于提供液滴内反应产物的所需分析。例如，包含反应产物的液滴或产物液滴可以流过一个或多个探测器组件，从而可以分析产物液滴的内容物。

在一些实施方式中，探测器可用于确定液滴内反应产物的浓度。可以使用泊松分布来分析浓度。例如，包含至少一个靶分子拷贝的液滴将在检测期间发荧光并计数为数字1，而不发荧光的液滴计数为数字0。然后可以计算1与总液滴的比率，并且校正泊松统计和注射体积以给出绝对浓度。

如本文所述，在一些实施方式中，分析系统可以被配置用于提供多路复用。多路复用允许多次分析单个样品，这对于诊断目的是有用的。如本文所述，允许多路复用的系统被配置为能够从单个初始样品串行和/或并行地检测靶标。在一些情况下，分析系统被配置用于并行检测靶核酸，使得同时分析样品中的多个靶标。例如，在并行多路复用中，系统可以包括探测器，该探测器包括多于1个光电探测器，其被配置用于测量来自靶核酸的多于一个发射频率和/或来自多于一个靶核酸的发射频率。在一些情况下，串行多路复用包括顺序地分析多个靶标。有时，使用流动路径中的一系列多个探测器来执行串行多路复用。通过并行多路复用和/或串行多路复用分析的样品可以通过串行和/或并行样品多路复用进一步分析。在一些实施方式中，可以对初始样品进行子采样以用于串行多路复用。串联样品多路复用可用于分析第一等分试样中的多个靶标，然后基于结果分析第二等分试样中的不同靶标。例如，可以针对一些常见的靶标组分析样品的第一等分试样。如果对这些靶标为阴性，则系统可以被配置为注射样品的第二等分试样以检测第二组不太常见的靶标的存在。该过程可以通过额外的等分试样和额外的测试继续进行。在一些情况下，通过将多组引物和探针组合来完成串行样品多路复用。在一些情况下，本文所述的系统使用多色检测来分析样品。如本文所述的系统和方法可以节省劳动力成本和时间，同时能够从单个样品中分析多个靶标。

本文描述了定量核酸的系统，该系统比先前的系统更稳健并且具有更宽的动态范围。使用先前的系统通常需要手动稀释、浓度计算和/或再次测定。如本文所述的系统包括能够进行自动分析的一个或多个组件。在一些实施方式中，系统可以包括控制器，其可用于控制注射的时机和体积、外部源向聚结器的施加、反应器的参数(包括反应时间)以及来自探测器的信号的处理中的一个或多个。例如，控制器可以调节添加到分散相中的稀释剂的量。在一些情况下，控制器是状态机。控制器可以允许多个体积的分散相连续地穿过反应流动路径。在一些情况下，系统是自动化的，以允许使用内部反馈回路完成检测和定量。例如，如果样品的第一等分试样在可检测范围之外，则系统将自动调整诸如量和浓度等参数并且将会注射第二等分试样。

与传统的基于乳液的数字核酸扩增系统相比，本文所述的系统可以允许在很少或没有污染的情况下发生反应。这对于提供可以表现出所需准确度和/或可靠性的生物测定法是重要的，包括用于研究和/或临床诊断的生物测定法。

除了核酸扩增之外，如本文所述的系统和方法可用于自动化药物合成。例如，第一体积的分散相中的第一药物前体与第二体积的分散相中的第二药物前体在聚结器中组合。

本文所述的系统和方法能够在没有或基本上没有用于化学反应的样品和/或试剂的手动测量和/或移液的情况下实现自动连续流动反应。该系统可以预加载与化学反应样品相容的试剂。该系统可以被配置成使样品的预处理和化学反应试剂的准确测量自动化。例如，可以向系统提供包含靶核酸的样品，并且系统可以执行所有过程以实现期望的化学反应，和/或提供样品的期望分析。化学反应可以在没有或基本上没有手动样品定量和/或操作的情况下进行。

装置的自动动态范围

相对于实时pcr，数字pcr通常受低总体动态范围困扰。其中一个原因是难以获得适当的样品输入浓度以便在待分析的液滴中获得适当的分析物分布。

分析物通常在其细分的液滴中表现出泊松分布。通过将未填充分区与总分区的比率与潜在的泊松分布相关联来确定样品中特定dna序列的浓度的定量。由于填充了一个、两个或更多个dna分子的分区因定量的数字性质(即，它们都定量为“一”或“存在”)而无法区分，因此只有未填充的分区可以给出泊松分布中的中心参数的两度，并由此得出感兴趣样品中特定dna序列的原始浓度。如果原始浓度相对于产生的分区数目太高，则所有或大多数分区将定量为“一”，这使得定量变得复杂并且可能使其不可行。

本发明的自动化特性允许动态测量范围比典型的数字pcr大得多。特别地，将样品应用于装置，处理等分试样，并分析所得数据。如果样品分析物的密度太高，则在一些情况下已经在装置中的样品第二等分试样被稀释和处理，从而减少在单个液滴中具有多个分析物分子的、阻碍分析的液滴数目。或者，如果样品分析物在等分试样中的浓度太低(如过多的液滴没有样品或信号所证明的)，则在随后的重复中处理装置中更浓缩的样品等分试样，以便为下游分析达到最佳或改进的分析物浓度。

在高动态范围的示例中，将样品的第一等分试样吸入仪器中，自动与诸如pcr试剂等试剂混合、进行分区、热循环和测量。然后，自动控制器确定下一步。如果每个分区的平均分子数在下游分析(如数字pcr)的可接受误差范围内，则接受测量。在许多应用中，如一些pcr应用中，该可接受的范围在每个分区0.0001至5个分子之间。如果每个分区的平均分子数大于可接受误差范围内的分子数，则测量误差将很高或样品将无法定量(即，所有或太多的分区或液滴都被测量为“一个”或“存在”分析物，即使多个分析物在单个分区中)。

抽取样品的第二等分式样，并且系统将自动与来自机载储器的分析或反应试剂(如pcr试剂)以及稀释水或其他合适的稀释剂混合。自动选择稀释量以使每个分区的平均分子数回到可接受的或分析上有意义的范围内。在一些情况下，稀释量将样品稀释至原始浓度或先前浓度的1/10至1/2。然后将样品的第二等分式样分区、热循环或以其他方式经受反应条件，并在得到的分区中测量。如果每个分区的平均分子数在可接受的误差范围内，则接受测量；如果每个分区的平均分子数仍然太高，则重复该过程。如果每个分区的平均分子数太低，则选择较低的稀释因子。或者，对于第一等分试样，如果测量为“1”的分区数为零，则浓度可能太低从而引起取样误差(即，注射的等分试样不含任何靶分子，虽然样品确实包含少量的靶分子)。在这种情况下，系统可以重新注射比第一等分试样体积更大的样品第二等分试样，以便增加如果靶分子在样品中的情况下将被检测到的概率。以这种方式，用于给定反应(如数字pcr或其他分子反应或分析)的装置的动态范围可以自动扩展到超出本领域可用仪器的边界，直到和超出实时pcr的动态范围。

通过手动将样品第一等分试样和pcr试剂混合在一起、手动操作仪器以确定每个分区的平均靶分子数，并且如果对于准确定量来说太高，则手动稀释样品以达到每个分区可接受的平均靶分子数，可以实现在其他数字pcr仪器中手动获得可比较的结果。然而，手动实现可比较的结果需要显著更高的手动接口和劳动力。这引入了在稀释量的计算和测量以及污染的引入方面人为错误和可变性的可能性。增加的手动操作量还会减少装置可以部署的位置范围，因为手动操作的增加通常与对合适的实验室环境的需求增加相对应，这可能与直接的、即时的护理点分析或在现场或收集地点进行样品分析不一致。所述装置消除或大大减少了手动操作量，从而减少了手动错误的可能性、对使用者的风险、获得结果的时间和可变性，以及外部污染。

自动等分试样为本文公开的装置和方法增加了额外的效用。例如，在考虑针对多个靶标的测量的情况下(其中第一组一个或多个靶标与第二组一个或多个靶标处于基本上不同的浓度，例如更高的浓度)存在额外的益处。在这些情况下，首先测试最可能或更丰富的靶标通常是有益的，以便降低成本和解释费用。例如，在诊断情况下，医院实验室可能有患有呼吸道症状的患者；先检测正常的感冒和流感病毒，然后进行至细菌性脑膜炎等罕见疾病的检测是有意义的。如果罕见疾病可能由患者样品中浓度较低或非常低的分析物引起或与之相关，则尤其如此。

为实现此目的，系统注射样品第一等分并自动将其与检测试剂混合，该检测试剂是例如pcr试剂，在一些情况下包括与来自第一组的多达四种或更多种靶标相关联的多达四种或更多种引物和探针对。将第一等分试样分区、热循环并测量，或采用其他反应和检测方法。如果第一组中至少一种靶标的浓度高于第一阈值，则诊断与该靶标相关的病症，或者可以采取步骤以独立地研究与检测到的分析物相关的病症的存在。如果没有靶标高于与该靶标相关的浓度阈值，则系统注射第二等分试样并将其与pcr试剂混合，包括与来自第二组的多达四种或更多种靶标相关联的多达四种或更多种引物和探针对。将第二等分试样分区、热循环并测量，或采用其他反应和检测方法。如果第二组中至少一个靶标的浓度高于与该靶标相关的第二阈值，则诊断与该靶标相关的病症，或者可以采取步骤以独立地研究与检测到的分析物相关的病症的存在。该过程可以被扩展或重复执行，包括来自第三组、第四组等的逐渐更罕见的靶标，以便减少诊断共同靶标的时间以及与复杂和全面的测定相关的成本。这种方法的一个益处是可以连续而不是平行地从单个样品中测定一组疾病或病症或病痛，从而首先测定更可能的疾病或病症，并且用于检测罕见病症的试剂只有当由于未能检测到样品中的相关分析物而排除了最初的，更可能的疾病时才会消耗。也就是说，单个样品被串行分析而不是并行分析，其在一些情况下是针对标志物，例如逐渐更罕见疾病的核酸标志物，并且直到与可能的病症原因相关的分析物或病症的标志物在样品中检测到。由于该系统是自动化的，因此在样品处理中只需最少的手工劳动即可完成，从而减少或最小化所用试剂的量，因为用于检测与罕见或不太可能的疾病相关的分析物的试剂仅在已经测定了更常见的或更可能的病症并且发现它们不存在时才被消耗。

系统和方法

图1描绘了使用本文所述的一种或多种分析系统检测和/或定量靶核酸的示例性工作流程100。在一些情况下，靶核酸的浓度是未知的。参考图1，在框102中，可以制备原始样品。在一些实施方式中，原始样品的制备可以在系统上进行。例如，该系统可以包括一个或多个组件，其被配置用于存储用于制备原始样品的试剂。包含靶核酸的原始样品，如血液、尿液、血清、淋巴液、唾液和/或汗液，可以直接提供给分析系统进行处理。在框104中，可以将包含靶核酸的样品注射到分析系统的流动路径中。在一些实施方式中，该系统可以包括零死体积注射器，其被配置用于将所需体积的样品注射到流动路径中。零死体积注射器可以被配置用于形成包含在分散相中的样品核酸的乳液。在一些实施方式中，注射器可以被配置用于形成包含在连续相中的样品核酸的第一液滴群体。在框106中，可以将一定体积的试剂和/或稀释剂注射到分析系统的路径中。在一些实施方式中，该系统可以包括零死体积注射器，其被配置用于将所需体积的试剂注射到流动路径中。零死体积注射器可以被配置用于形成包含在分散相中的试剂的乳液。在一些实施方式中，注射器可以被配置用于形成包含在连续相中的试剂的第二液滴群体。该连续相可以与包含样品核酸的第一液滴群体的连续相相同。该零死体积注射器可以与用于样品的零死体积注射器相同或不同。

在框108中，可以将分散相体积聚结。例如，可以聚结第一分散相和第二分散相。在一些实施方式中，该系统包括聚结器，其被配置用于合并至少一个分散相的组分以提供合并的液滴。在一些实施方式中，合并的液滴包含适合于所需化学反应(例如，核酸扩增，包括pcr)的核酸和试剂。例如，来自第一群体的液滴可以与第二群体的液滴合并。在框110中，可以将分散相体积组分混合。在一些实施方式中，可以引发合并液滴内的混合，以促进试剂和/或样品核酸在液滴内的所需分布。在一些实施方式中，进行混合以促进试剂和/或核酸在液滴内的均匀分布。在框112中，可以生成液滴。在一些实施方式中，可以从合并的液滴产生多个液滴，例如以提供所需体积的液滴用于系统中的下游处理。多个液滴中的每一个可以具有用于所需化学反应(例如，核酸扩增，包括pcr)的核酸和试剂。在框114中，可以引发液滴内的反应。例如，包含核酸和试剂的液滴可以流过分析系统的反应器，使得可以引发液滴内的反应。在一些实施方式中，反应器包含热循环仪。例如，液滴可以流过热循环仪以在液滴内引发所需的核酸扩增反应。在框116中，可以执行反应产物的检测。包含反应产物的液滴可以流过探测器，使得可以检测液滴内的产物。在框118中，可以计算浓度。可以基于探测器提供的信息来计算液滴内反应产物的浓度。

在一些情况下，靶分子是核酸。例如，靶分子是脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)。通过如本文所述的一种或多种系统处理的靶核酸可以是自由漂浮的或包含在活生物体或非生物体内。在一些实施方式中，如本文所述的一种或多种系统可以被配置用于提取包含在活的或非活的生物体内的靶核酸。例如，一个或多个系统可以被配置用于进行裂解反应。在一些情况下，裂解在系统上进行。在一些情况下，一个或多个系统可以包括包含裂解剂的储器。裂解可以机械地、酶促地、化学地、加热地、声学地、超声地或其一些组合的方式进行。例如，化学裂解剂用于分解系统中的蛋白质、脂质和/或其他非核酸材料。在裂解反应之后，可以在系统内进行过滤步骤以过滤裂解反应的产物，使得可以保留感兴趣核酸用于在系统内进一步处理。

在一些情况下，裂解在系统外进行。在一些情况下，裂解系统的组件可以是一次性的。替代地或组合地，裂解由使用者例如实验室人员进行。

在一些情况下，靶核酸从细胞、病毒或微生物中分离。在一些情况下，靶核酸从受试者的体液(例如，血液、尿液、血清、淋巴液、唾液和/或汗液)中分离。在一些情况下，靶核酸从组织中分离。在一些实施方式中，通过如本文所述的裂解和随后的过滤从细胞中分离靶核酸。

在一些实施方式中，分离的核酸可以包封在水性流体中。然后在一些情况下将包封的核酸与不混溶的流体混合以形成乳液。例如，分离的核酸可以包含在乳液的分散相中。在一些情况下，不混溶的流体是油。示例性的油是氟化油、硅油、烃油和/或矿物油。在一些情况下，不混溶流体包含油和一种或多种表面活性剂。在一些情况下，不混溶流体和水性流体的不同密度允许通过重力分离两种流体。

注射器

在大多数情况下，通过注射阀将包含dna或rna的样品引入如本文所述的系统中。图2描绘了根据一些实施方式的示例性系统200的示意图。系统200包括用于第一分散相201的储器，用于第一连续相203的储器，用于第二分散相205的储器，用于第二连续相207的储器，零死体积注射器209，第二零死体积注射器211，聚结器213，反应器219和探测器221。

用于第一分散相201的储器和用于第一连续相203的储器被配置用于分别将第一分散相和第一连续相提供到第一零死体积注射器209。用于第二分散相205的储器和用于第二连续相207的储器被配置用于分别将第二分散相和第二连续相提供到第二零死体积注射器211。在一些实施方式中，第一分散相和第二分散相可以是包含用于由系统200分析的核酸和/或用于化学反应的试剂的水溶液，以使得能够分析核酸。在一些实施方式中，第一连续相和第二连续相可以包含一种或多种油和/或一种或多种表面活性剂。

参考图2，第一零死体积注射器209的第一入口231与第一分散相201的储器的出口流体连通，并且第一零死体积注射器209的第二入口233与第一连续相203的储器的出口流体连通。第一零死体积注射器209包括第一分散相和第一连续相。第一零死体积注射器209包括第一分散相和第一连续相。由零死体积注射器209形成的第一分散相和第一连续相可以通过零死体积注射器209的出口235离开，以在系统200内进一步处理。

零死体积注射器209可以与聚结器213和/或第一出口或废物215流体连通。在一些实施方式中，由第一零死体积注射器209形成的第一分散相和连续相的至少一部分被提供到聚结器213。在一些实施方式中，由第一零死体积注射器209形成的第一分散相和第一连续相的至少一部分被提供到第一出口或废物215。有时，连接是t形接头。在一些情况下，来自第一出口或废物215的第一分散相和第一连续相收集在废物储器中或丢弃。在一些情况下，来自第一出口或废物215的第一分散相和第一连续相可以再循环以再次使用。在一些情况下，第一出口或废物215包括管道和泵。在一些实施方式中，将分散相再循环至分散相容器。该分散相容器可以是分散相201的源。替代地或组合地，分散相容器是可除去的，以允许对包含在分散相容器中的样品进行进一步的反应或测定。

如图2所示，第二分散相可包括化学反应的第二组分。第二零死体积注射器211的第一入口239可以被配置用于从用于第二分散相205的储器接收第二分散相。在一些实施方式中，第二零死体积注射器211的第二入口241是配置用于从第二连续相207的储器接收第二连续相。在一些情况下，第一连续相和第二连续相可以存储在同一储器中。如本文进一步详细描述的，第二零死体积注射器211可以被配置用于形成第二分散相和第二连续相。第二零死体积注射器211可以包括出口237，其配置用于将第二分散相和第二连续相的至少一部分提供到聚结器213。在一些实施方式中，系统200可以被配置用于将至少一个第二分散相和第二连续相的一部分提供到出口或废物217。出口或废物217可以与连接到废物、再循环或连接到储存容器的组件流体连通。

如本文进一步详细描述的，聚结器213可以被配置用于聚结分散相体积，如分散相的液滴。聚结器213可以与反应器219流体连通。反应器219可以被配置用于引发化学反应。反应器219可以与探测器221流体连通，使得由反应器219引发的化学反应的产物可以由探测器221观察和/或分析。

反应流动路径可由各种材料组成。在一些情况下，反应流动路径包括由聚合物(如硅氧烷或聚氯乙烯(pvc))构成的微孔管。管的直径可以为至少0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.50、0.75、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0或大于3.0mm。在一些情况下，管的直径为至多0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.50、0.75、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0或大于3.0mm。管的直径可以为0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.50、0.75、1.0、1.5、2.0、2.5或3.0mm，或在横跨上述值的范围内。在一些情况下，反应流动路径包括一组铣削或蚀刻到材料中的流动通道。材料可以包括玻璃、硅、金属、陶瓷或其他材料，并且例如，通道通过烧蚀、蚀刻、模制、钻孔或凿孔中的至少一种产生。在一些情况下，反应流动路径包括管道段和形成在材料中的流动通道段。

在一些情况下，第一连续相203的储器和第二连续相205的储器可以包括注射器和/或容器中的至少一个，包括单剂量容器或可再填充容器。在一些实施方式中，压力源用于通过系统200注射连续相。压力源可以是泵，如注射泵、隔膜泵、蠕动泵、往复泵、离心泵和/或真空泵。在一些情况下，系统200包括控制器，该控制器被配置用于控制系统200的一个或多个组件的操作，包括例如重新填充储器201、203、205和207中的一个或多个。例如，控制器可以被配置用于控制泵，使得储器被自动再填充，如当注射泵中水平较低时，例如在完成的注射之后，和/或在完成的反应之后。

图3是根据一些实施方式的示例性系统300的示意图。在一些实施方式中，系统根据泊松分布进行反应测定。如图3所示，系统300可以包括连续相源301、第一分散相源303、第二分散相源305、聚结器307、液滴发生器309、反应器311和探测器313。在一些实施方式中，连续相源301可以被配置成与第一分散相源303的入口流体连通，例如通过流体通道315。可以组合第一分散相和第一连续相。在一些实施方式中，连续相源301可以被配置成与第二分散相源305的入口流体连通，例如通过流体通道319。在一些情况下，组合第二分散相和第二连续相。包含第一分散相和第二分散相以及第一连续相和第二连续相的乳液可以提供到聚结器307。第一连续相和第二连续相可以具有相同的组成。例如，第一分散相和第二分散相可以处于共同的连续相中。聚结器307可以与液滴发生器309流体连通。液滴发生器309可以与反应器311流体连通。反应器311可以与探测器313流体连通。

系统300可以包括控制器321，控制器321被配置用于控制系统300的一个或多个组件的操作，如第一连续相源301、第一分散相源303、第二分散相源305、聚结器307、液滴发生器309、反应器311和探测器313中的一个或多个的操作。

图4是根据一些实施方式的另一示例性系统400的示意图。在一些实施方式中，系统在未分区成液滴的分散相上进行反应。系统400可以包括连续相源401、第一分散相源403、第二分散相源405、聚结器407、反应器409和探测器411。系统400的流动路径类似于参考图3描述的系统300的流动路径，但系统400的流动路径不包括液滴发生器。流体从聚结器407流到反应器409而不流过液滴发生器。系统400可以包括控制器413以控制其一个或多个组件的操作。

在一些实施方式中，系统可以具有独立的注射器以形成所需的乳液。例如，注射器可以如图5中那样独立地布置。

在一些实施方式中，一个注射器可以用于注射多于一个分散相。在一些实施方式中，如图6中所示，系统可以包括选择阀，该选择阀配置用于控制向所述一个注射器的流动。在一些情况下，系统可以包括具有多个端口的注射器，如图7中所示。有时，至少有1、2、3、4、5、6、7、8或8个以上的注射器。在一些情况下，至少有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或10个以上的端口。有时，至少、约、至多有1、2、3、4、5、6、7或8个注射器，或有在横跨上述值的范围内的注射器。在一些情况下，至少、约、至多有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个端口，或有在横跨上述值的范围内的端口。

注射器

零死体积注射器，例如如上所述的零死体积注射器，可以具有穿过其中的多个流动路径。流动路径可包含至少一个入口和至少一个出口。在一些情况下，入口允许一定体积的流体，如包含样品核酸和/或试剂的一定体积的流体，从外部源引入系统。例如，样品核酸和/或试剂的源可以在系统外部。在一些实施方式中，入口允许样品核酸和/或试剂从在系统上的储器转移到系统的一个或多个下游组件。替代地或组合地，出口是用于废物。在一些情况下，可以使用一个或多个泵将样品核酸和/或试剂加载到注射器中和/或使样品核酸和/或试剂流入下游组件。例如，可以使用引入泵将样品核酸加载到注射器的入口中。

在一些情况下，同时使用多个流动路径。在一些情况下，注射器具有至少1、2、3、4、5、6、7或8个流动路径。在一些情况下，注射器具有多达1、2、3、4、5、6、7或8个流动路径。在一些情况下，注射器具有约1、2、3、4、5、6、7或8个流动路径，或具有在横跨上述值的范围内的流动路径。示例性的流动路径允许加载或注射样品。在一些情况下，手动选择流动路径。在一些情况下，自动选择流动路径。在一些情况下，软件用于自动或手动选择流动路径。可以部分地基于要注射到系统中的流体的期望体积来选择流动路径。有时，软件包含基于预加载公式调整注射体积的信息。在一些情况下，在提供样品核酸和/或试剂后，使用者不提供额外的输入。例如，系统可以被配置用于部分地基于所提供的样品和/或试剂的类型来选择注射器中的流动路径。使用多个流动路径常允许流体定量的灵活性，更大的动态范围，特别是当存在不同浓度的靶分子时。

图8描绘了根据一些实施方式的用于操作注射器的示例性工作流程800。在框802中，注射器的第一入口可以与注射器的筒的固定内部容积对准。在框804中，分散相可以流过注射器的第一入口。例如，分散相可以流过注射器的第一入口并进入固定的内部容积，直到固定的内部容积被分散相填充。固定内部体积中的分散相的体积等于或基本上等于固定内部容积的体积。在框806中，可以旋转该筒以密封该筒的固定内部容积。在框808中，注射器的第二入口可以与固定内部容积对准。在框810中，连续相可以流过第二入口，直到分散相被取代。例如，第二入口可以与用于连续相的源流体连通，并且固定内部容积可以与出口流体连通，该出口被配置用于为下游组件提供流体流动。连续相可以从连续相源流入固定内部容积，该连续相推出已经在固定内部容积中的分散相。连续相可以流动，直到连续相填充固定内部容积并取代所有分散相。流动以取代分散相的连续相的体积可等于或基本上等于固定内部容积的体积。在框812中，可以旋转该筒以密封固定内部容积。

在一些情况下，入口管连接到注射器。有时，注射器是旋转阀。注射器可以具有至少2个接口。在一些情况下，注射器具有至少1、2、3、4、5、6、7、8或超过8个接口。在一些情况下，注射器具有至少、至多、约1、2、3、4、5、6、7或8个接口，或具有在横跨上述值的范围内的接口。在一些情况下，注射器的表面对连续相的亲和力大于分散相。例如，注射器吸引的表面可以具有对油的亲和力并排斥水相。在一些情况下，注射器的表面是疏水性或亲氟性中的至少一种。

图9描绘了注射器的组件。图10描绘了注射器的入口和出口的布置。图11描绘了注射器的腔的布置。图12描绘了注射器的腔的替代布置。

在一些情况下，样品进入注射器的旋转筒。图13中描绘了示例性圆柱形筒1313的示意性横截面视图。圆柱形筒1313包括端帽盖1303、1315和具有固定内部容积1311的内部通道。每个帽盖1303、1315包括用于流体流入或流出固定内部容积的相应通道。帽盖1303包括通道1305和1309，并且帽盖1315包括通道1317和1319。在一些实施方式中，通道1305可以被配置成与注射器的入口1301对准。在一些实施方式中，通道1309可以被配置成与注射器的入口1307对准。入口通道1301可以连接到分散相的提供源。入口1307可以连接到连续相的提供源。通道1317可以被配置成与注射器的出口1321对准。通道1319可以被配置成与注射器的出口1323对准。在一些实施方式中，筒的通道的所有表面包括对连续相具有亲和力的涂层。有时，筒的通道的所有表面都包括疏水涂层。在一些实施方式中，筒的通道的所有表面包括亲水涂层。

根据一些实施方式的第二示例性筒1413的横截面视图在图14中示出。圆柱形筒1413包括端帽盖1403、1417，包括第一固定内部容积的第一内部通道1411和包括第二固定内部容积的第二内部通道1415。每个帽盖1403、1417包括用于使流体流入或流出内部通道1411或1415的通道。通道1405可以被配置成与注射器1413的第一入口1401对准。通道1409可以被配置成与注射器1413的第二入口1407对准。通道1419可以被配置成与注射器1413的第一出口1421对准。通道1423可以被配置成与注射器1413的第二出口1425对准。第一内部通道1411可以被配置成与通道1405和通道1421对准。第二内部通道1411可以被配置成与通道1409和通道1425对准。使用两个内部通道可以使得能够填充一个通道，同时另一个通道是清空。例如，第一内部通道1411或第二内部通道1415中的一个可以注射流体，而另一个被清洗。在一些实施方式中，筒的通道的所有表面包含疏水或亲氟涂层。在一些实施方式中，筒的通道的所有表面包括亲水涂层。

图15描绘了注射器的腔的不同布置。

在一些情况下，筒包含至少一个流体室，如具有本文所述固定容积的内部通道。在一些情况下，筒包含至少1、2、3、4、5、6、7、8或超过8个流体室。在一些情况下，筒包含至多、约1、2、3、4、5、6、7或8个流体室，或包含在横跨上述值的范围内的流体室。室容积可以为约1微升(μl)至约50μl。在一些情况下，室容积为至少约1μl、5μl、10μl、15μl、20μl、25μl、30μl、35μl、40μl、50μl、75μl、100μl、250μl、500μl或超过500μl。在一些情况下，室容积为至多约1μl、5μl、10μl、15μl、20μl、25μl、30μl、35μl、40μl、50μl、75μl、100μl、250μl、500μl或超过500μl。在一些情况下，室容积为约1μl、5μl、10μl、15μl、20μl、25μl、30μl、35μl、40μl、50μl、75μl、100μl、250μl或500μl，或在横跨上述值的范围内。在一些情况下，室容积为至少1μl、5μl、10μl、15μl、20μl、25μl、30μl、35μl、40μl、50μl、75μl、100μl、250μl、500μl或超过500μl。在一些情况下，室容积为至多1μl、5μl、10μl、15μl、20μl、25μl、30μl、35μl、40μl、50μl、75μl、100μl、250μl、500μl或超过500μl。在一些情况下，室容积为至少、至多、约0.01皮升(pl)、0.05pl、0.1pl、0.5pl、1pl、5pl、10pl、15pl、20pl、25pl、30pl、35pl、40pl、50pl、75pl、100pl、250pl、500pl、1000pl、0.01纳升(nl)、0.05nl、0.1nl、0.5nl、1nl、5nl、10nl、15nl、20nl、25nl、30nl、35nl、40nl、50nl、75nl、100nl、250nl、500nl、1000nl、0.01微升(μl)、0.05μl、0.1μl、0.5μl、1μl、5μl、10μl、15μl、20μl、25μl、30μl、35μl、40μl、50μl、75μl、100μl、250μl、500μl、1000μl、1毫升(ml)、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml或10ml，或在横跨上述值的范围内。在一些情况下，筒包含多于一个室。在一些实施方式中，筒包括一个室，该室包括与筒的另一个室的容积不同的容积。

通常，当筒的室被核酸和/或试剂的样品完全占据时，核酸和/或试剂的样品在注射器筒中的适当位置被限定，其中通过用过量的连续相过度填充筒室并且样品进入废物流，样品已取代了筒中的连续相。在一些情况下，样品的体积等于室的大小。这可以使样品处理自动化。

在样品处于注射器筒中之后，在一些情况下旋转该筒，然后样品通过下游流动路径到达聚结器。可以通过马达进行旋转。在一些情况下，使用带有位置开关的螺线管进行旋转。有时，样品使用样品注射泵通过流动路径到达聚结器。在一些情况下，不在筒中的样品流到废物出口。在一些情况下，不在筒中的样品处于流体路径中并被加载。有时，不在筒中的样品处于流体路径中但未被加载。

通常，与通过下游路径的样品接触的表面预涂不混溶的流体。在一些情况下，表面预涂油，如氟化油。在一些情况下，油防止样品中的靶分子接触仪器表面。

在一些情况下，注射器允许选择引物和探针。在一些情况下，引物和探针是预先设计和预先制备的，因此使用者不需要制备用于测定的试剂。在一些情况下，系统包括连接到引物和探针的储器的选择阀。储器可以单次填充或可再填充。在一些情况下，可以断开储器。盒

除了样品之外，有时还需要至少一种试剂，如酶、dntp、引物和探针，来进行核酸扩增，如pcr。有时，诸如盒的阀向本文所述的系统提供至少一种试剂。在一些情况下，盒包括至少一个预加载设定体积的室。在一些情况下，盒允许液体被储存和随后加载。盒通常具有至少两个接口。在一些情况下，注射阀具有至少1、2、3、4、5、6、7、8或超过8个接口。在一些情况下，注射阀具有约、至多1、2、3、4、5、6、7或8个接口，或具有在横跨上述值的范围内的接口。在一些情况下，盒包含1个流动路径。例如，具有一个流动路径的盒允许液体在1个流动路径中加载和卸载。在一些情况下，盒阀具有至少1、2、3、4、5、6、7、8或超过8个流动路径。在一些情况下，盒阀具有约、至多1、2、3、4、5、6、7或8个流动路径，或具有在横跨上述值的范围内的流动路径。在一些情况下，同时使用多个流动路径。

在一些情况下，盒包含筒。例如，筒具有至少一个流体室。室容积可以为约1μl至约50μl。一些实施方式的室容积为约0.05皮升(pl)至约5毫升(ml)。在一些情况下，室容积为至少约0.5μl、1μl、5μl、10μl、15μl、20μl、25μl、30μl、35μl、40μl、50μl、75μl、100μl、250μl或500μl。在一些情况下，室容积为至多约0.5μl、1μl、5μl、10μl、15μl、20μl、25μl、30μl、35μl、40μl、50μl、75μl、100μl、250μl、500μl或超过500μl。在一些情况下，室容积为至少0.5μl、1μl、5μl、10μl、15μl、20μl、25μl、30μl、35μl、40μl、50μl、75μl、100μl、250μl或500μl。在一些情况下，室容积为至多0.5μl、1μl、5μl、10μl、15μl、20μl、25μl、30μl、35μl、40μl、50μl、75μl、100μl、250μl、500μl或超过500μl。在一些情况下，室容积为约0.5μl、1μl、5μl、10μl、15μl、20μl、25μl、30μl、35μl、40μl、50μl、75μl、100μl、250μl或500μl，或在横跨上述值的范围内。在一些情况下，室容积为至少、至多、约0.01皮升(pl)、0.05pl、0.1pl、0.5pl、1pl、5pl、10pl、15pl、20pl、25pl、30pl、35pl、40pl、50pl、75pl、100pl、250pl、500pl、1000pl、0.01纳升(nl)、0.05nl、0.1nl、0.5nl、1nl、5nl、10nl、15nl、20nl、25nl、30nl、35nl、40nl、50nl、75nl、100nl、250nl、500nl、1000nl、0.01微升(μl)、0.05μl、0.1μl、0.5μl、1μl、5μl、10μl、15μl、20μl、25μl、30μl、35μl、40μl、50μl、75μl、100μl、250μl、500μl、1000μl、1毫升(ml)、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml或10ml，或在横跨上述值的范围内。在一些情况下，存在至少两个具有不同容积的室。

盒的表面通常是疏水性和亲氟性中的至少一种。在一些情况下，流体使用流体引入泵通过盒。在一些情况下，当存在经测量的量的流体时，加载或存储在盒中的流体被置于阀内的适当位置。在一些情况下，通过监测阀内流体的位置将盒置于阀内的位置。通常将流体引入盒中，直到指定的体积包含在盒的筒中。在一些情况下，将第二流体引入筒的第二通道中。在一些情况下，筒包含至少1、2、3、4、5、6、7、8或超过8个流体通道。在一些情况下，筒包含至多、约1、2、3、4、5、6、7或8个流体通道，或包含在横跨上述值的范围内的流体通道。

在一些情况下，盒包含试剂储器。例如，储器包含核酸扩增试剂。在一些情况下，储器是可再填充的。在一些情况下，来自储器的试剂通过零死体积阀。

图16描绘了盒的组件。图17描绘了盒的入口和出口的布置。图18描绘了盒的腔的布置。图19描绘了盒的腔的替代布置。

重力阱聚结器

在一些实施方式中，重力阱聚结器可以被配置用于聚结两个或更多个分散相。在一些实施方式中，重力阱聚结器可以被配置用于聚结第一分散相和第二分散相。例如，乳液包括在第一连续相中包含液滴的第一分散相和在第二连续相中包含至少一个液滴的第二分散相。重力阱聚结器可以被配置用于将第一分散相的液滴与第二分散相的液滴组合以形成第三液滴，使得第三液滴可以作为单个实体而不是多个分散的实体通过如本文所述的系统的一个或多个组件进一步处理。在一些实施方式中，重力阱聚结器可以被配置用于生成在第三连续相中的第三液滴。在一些实施方式中，第一连续相、第二连续相和第三连续相具有相同的组成。例如，第一连续相、第二连续相和第三连续相可包含一种或多种油和/或一种或多种表面活性剂。

在一些实施方式中，将包含试剂的第一分散相的液滴与包含靶分子(例如dna或rna)的第二分散相的液滴组合以生成包含试剂和靶分子两者的第三分散相的第三液滴。试剂可以是引物、探针、转录酶、缓冲液和dntp中的至少一种。在一些情况下，可以确定试剂的量。例如，可以基于第二分散相的液滴中的靶分子的类型和/或数量来选择第一分散相的液滴中的试剂的量，使得通过合并第一和第二分散相的液滴形成的液滴可包含适合于其间所需化学反应的数量的试剂和靶分子。

如本文所述，分散相可以是水性的。在一些情况下，分散相包含大于约51％(质量或摩尔浓度)的水。在一些情况下，连续相与分散相是不混溶的或基本上不混溶的。例如，连续相可以是疏水的，例如包含油，例如氟化油。有时，试剂和/或靶分子被包封在分散相的液滴中。在一些情况下，分散相涂有表面活性剂。有时表面活性剂通过注射器中的连续相递送。表面活性剂可稳定连续相内的分散相和/或防止分散相与连续相之间的交叉污染。替代地或组合地，分散相是疏水的，而连续相是亲水的。例如，分散相可以包含油，例如氟化油，而连续相可以是水性的。

可能合适的示例性氟化油以商品名fluorinert^tm(3m)出售，具体包括fluorinert^tmelectronicliquidfc-3283、fc-40、fc-43和fc-70。合适的氟化油的另一个示例以商品名novec^tm(3m)出售，包括novec^tmhfe7500engineeredfluid，即，3-乙氧基-1,1,1,2,3,4,4,5,5,6,6,6-十二氟-2-三氟甲基-己烷。在一些情况下，含氟化合物是cf3cf2cf2och3，以novec^tmhfe7000出售。在一些情况下，含氟化合物是2,2,3,3,4,4,4-七氟-1-丁醇，cf3cf2cf2ch2oh。在一些情况下，氟化油是全氟化碳，如全氟辛烷或全氟己烷。在一些情况下，含氟化合物是部分氟化的烃，如1,1,1-三氟辛烷或1,1,1,2,2-五氟癸烷(1,1,1,2,2-petantafluorodecane)。

在一些情况下，来自包含第一靶分子的第一分散相的液滴与来自包含第二靶分子的第二分散相的液滴合并。有时，样品包含来自至少两个分散相的核酸。在靶分子的第一分散相与靶分子的第二分散相合并的示例中，可以鉴定靶分子的每个分散相。例如，将核苷酸序列连接到分散相的靶分子上，其中该序列可以包括许多核苷酸(例如条形码)，从而提供足以鉴定靶分子来源的特异性。然后，有时对靶分子进行测序，并且可以基于核苷酸序列鉴定靶分子的来源。

在一些情况下，确定核酸的浓度，如质量浓度或摩尔浓度。有时，使用浓度来评估是否对靶分子进行测序。在一些情况下，通过稀释调节浓度。例如，用水稀释。替代地或组合地，将试剂稀释。在一些情况下，确定浓度以评估其对核酸测序的适合性。

图20中示出了如本文所述的系统的示例性操作。在加载状态下，接头的入口2001、2003包括分散相。分散相在接头2017的方向上行进。如果2015关闭，则接头出口处的可移除限制物处于“关闭”状态，并且如果2015打开，则接头出口处于“打开”状态。接头出口2013包括连续相。接头出口处没有提供外部电源。在“加载”状态下，至少两个分散相位于接头出口处，在那里它们被重力2009诱捕。通常在接头的第一出口处，分散相的至少两个部分未被组合。

如图21所示，第一和第二接头仅包括一个入口。在一些情况下，接头包括至少1、2、3、4、5、6、7、8或超过8个入口。在一些情况下，第二接头包括至多约1、2、3、4、5、6、7、8或超过8个入口。在一些情况下，接头包括至多、约1、2、3、4、5、6、7或8个入口，或包括在横跨上述值的范围内的接口。接头入口有时水平定向，使得垂直于入口横截面的入口轴线与平行于局部重力场方向的轴线成大于约75°的角度。在一些情况下，水平定向的轴线被定向成使得其垂直于第一接头出口的轴线，第一接头出口的轴线垂直于第二接头出口的横截面。在这种情况下，分散相向接头出口移动的倾向增加。有时，第一接头入口和第二接头入口水平相对，使得入口的水平分量的中心轴线相对于彼此成不小于160°的角度。在这种情况下，入口中连续相的相反流动将减缓分散相的一部分进入并增加分散相的一部分将朝向接头出口移动的倾向。

如图22所示，接头入口2201、2203在终止点处接合并形成连接到出口接头2215的通道2205、2207。在一些情况下，接头入口将至少一个点与出口连接。在一些情况下，接头入口在多个点处与出口连接。在一些情况下，在接头出口接头之前形成共同通道。参考图22，接头的出口在不同点处与接头入口2201、2203连接。这可以确保分散相被诱捕在接头出口中。如图22所示，接头入口2201、2203和接头出口2211连接并形成共同通道。

参考图23，出口具有通道的长度，使得分散相不会在垂直通道的第二方向上流到通道偏离垂直方向的点。如图23所示，包括入口2301、2303的通道的部分定向成使得入口2301、2303的中心轴线与通道2315的中心轴线偏离小于45°的角度。这可以允许分散相在进入与其相对于连续相的相对速度的方向对准的接头时具有垂直速度。例如，对于质量密度低于连续相的分散相，垂直速度是重力场强度降低的方向。尽管分散相具有比连续相更高的质量密度，但垂直速度可以是重力场强度增加的方向。在一些情况下，偏离小于20°。

参考图23，接头的入口垂直定向，使得垂直于入口的截面的轴线与平行于重力场方向的轴线成一定角度定向，该角度至多约为45°。在一些情况下，角度至多约为20°。垂直定向相对于减小场的方向指向，可以增加分散相向接头出口移动的倾向。当分散相的质量密度小于连续相的质量密度时，可以引导垂直定向，以便在重力场减小的方向上形成小角度。当分散相的质量密度大于连续相的质量密度时，可以引导垂直定向，以便在重力场增加的方向上形成小角度。

参考图24，柔性聚合物管中的阀2415可以提供接头出口所需的可移除限制物。接头出口遵循与整料2421的第一轴线同轴的路径2413。在一些情况下，接头出口不穿透整料的下平面。有时，接头出口偏离同轴方向并穿过整料的圆柱形侧平面。在一些情况下，接头的出口延续穿过整料的下平面。在一些情况下，出口通过装有相对于整料的防漏密封的通道延续出整料平面之外。

图25描绘了根据一些实施方式的重力阱聚结器的示意性横截面视图。图25示出了使用如本文所述的重力阱聚结器检测和定量至少一种靶分子的示例性工作流程。分散相的第一部分在点2503处被引入装置，在此其流过第一流动通道2507。分散相的第二部分在点2519处被引入装置，在此其流过第二流动通道2515。第一流动通道和第二流动通道在接头2505处相遇，并且被称为接头的第一入口和第二入口。接头具有第一出口和第二出口，连续相和分散相可以通过第一出口和第二出口离开接头。第一出口和第二出口共享垂直于包括第一出口和第二出口的通道的横截面的中心轴线。流体的流动路径具有垂直或接近垂直的区段(称为“垂直通道”)。对于第一出口，流动受到垂直通道2511的可移除限制物(“死端”)的阻碍。对于第二个出口，允许流动不受阻碍2509。

参考图25，出口的定向允许分散相的至少一部分朝向死端2511行进。有时，分散相的密度小于连续相，使得与指向死端的第一出口的中心轴线对准的单位矢量相对于与局部重力场对准并指向重力场强度减小的方向的矢量偏离小于45°的角度。替代地或组合地，分散相的密度大于连续相的密度，使得与指向死端的第一出口的中心轴线对准的单位矢量相对于与局部重力场对准并指向重力场强度增大的方向的矢量偏离小于约45°的角度。偏离量可以变化。在一些情况下，偏离量为至多约10°、15°、20°、25°、30°、35°、40°或45°。在一些情况下，偏离量为至少10°、15°、20°、25°、30°、35°、40°、45°或超过45°。在一些情况下，偏离量为约10°、15°、20°、25°、30°、35°、40°或45°，或在横跨上述值的范围内。在一些情况下，偏离量小于约10°。

在图25中，分散相的至少两个部分被接头2505的第一出口中的死端通过重力诱捕在一起。连续相自由地流过接头2517的第二出口。至少一部分分散相可以具有至少一种表面能。例如，如果具有第一表面能的分散相的第一部分与具有第二表面能的第二部分分散相组合，则组合的表面能将更低。通常，组合的表面能低于第一表面能和第二表面能的总和，这是由于分散相的第一部分和分散相的第二部分所占据的总表面积减少。在一些情况下，增加能量以将分散相的第一部分和分散相的第二部分组合。

在一些情况下，至少一个分散相被表面活性剂包围。表面活性剂可以是电极化的。在应用外部源的一些情况下，由于表面活性剂被外部源极化，至少一个分散相变形。

图26显示了由整料形成的接头。如所示，整料采用近似圆柱形的形状。存在垂直于整料的横截面的整料2621的第一轴线，并且整料的接头包含轴线上的至少一个点。整料包含接头入口2603、2619和接头出口2611、2617。在一些情况下，分散相具有比连续相更低的质量密度。接头出口2617与整料2621的轴线同轴。接头出口2611延续穿过整料2621的上平面。在一些情况下，接头出口通过装配有防漏密封的通道延续到整料上平面。在一些情况下，通道包括内径为至少0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.50、0.75、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0或超过3.0mm的管。在一些情况下，管的直径为至多0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.50、0.75、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0或超过3.0mm。管可以通过烧蚀、蚀刻、模制、钻孔、压配或凿孔中的至少一种装配在整料中。在一些情况下，管涂有对连续相具有高亲和力的材料。例如，如果连续相是氟化油，则管涂有氟聚合物。

图27描绘了重力阱聚结器的示例的组件。图28描绘了重力阱聚结器的示例的入口和出口的布置。图29描绘了重力阱聚结器的示例的腔的布置。图30描绘了重力阱聚结器的示例的腔的替代布置。

在一些情况下，分散相具有比连续相更大的质量密度，并且接头出口的定向是相反的。接头出口穿过整料的至少一个下平面，穿过整料的上平面，或整料的圆柱形侧平面。接头的入口包括接头轴线上的至少一个点，并且入口延续穿过整料的圆柱形侧平面。在一些情况下，整料的下平面与接头入口与整料的圆柱形侧平面相交的点之间的距离不等于从整料的下平面到接头的入口与整料的圆柱形侧平面相交的点的距离。距离可以从垂直于整料下平面的横截面的整料下平面的圆周点测量到垂直于整料轴线的平面上的点，包括整料的圆柱形侧平面与的入口接头的轴线的交叉点。在一些情况下，这些距离是相同的。在一些情况下，从整料的圆周上的方位角位置测量的第一入口的方位角位置不同于接头的第二入口的方位角位置。第一入口和第二入口的方位角位置可以相同。在一些情况下，选择距离以适应组装考虑因素。例如，如果各个接头的防漏密封通过大连接器产生或者轮廓较小，则针对密封的大小和位置调整距离，如方位角位置。

在一些情况下，连续相与整料的表面接触。有时，连续相是氟化油。在一些情况下，分散相包括亲氟材料。示例性的亲氟材料是氟聚合物。在一些情况下，氟聚合物选自一系列材料，包括但不限于，聚氟乙烯(pvf)、聚偏二氟乙烯(pvdf)、聚四氟乙烯(ptfe)、聚三氟氯乙烯(pctfe)、全氟烷氧基聚合物、氟化乙丙烯(fep)、聚乙烯四氟乙烯(etfe)、聚乙烯三氟氯乙烯(ectfe)、全氟弹性体、碳氟化合物、含氟弹性体、全氟聚醚(pfpe)、全氟磺酸(pfsa)和全氟聚氧杂环丁烷。在一些情况下，整个整料由氟聚合物制成，以便不需要用亲氟材料内衬或涂覆流体通道。

可以容易地制造如本文所述的整料。例如，接头出口是例如在车床或钻床上的单个操作。在一些情况下，整料由以下列表中的金属组成，该列表包括但不限于钢、铝、铬、镍、铜或铁。有时，旨在与连续相流体接触的整料表面内衬或涂覆亲氟材料。在一些情况下，通过将氟聚合物的环形区段插入到整料的圆柱形开口区域中来实现内衬，该圆柱形开口区域包括接头的入口和出口，其中氟聚合物区段的外径和整料的圆柱形开口区域的内径在这样的范围内，使得氟聚合物区段的外径略大于整料的圆柱形开口区域的内径，以便压紧，并施加垂直于整料的圆柱形开放区域的内径的弹性力，并与整料形成液密密封。

接触连续相的整料的表面可以涂覆亲氟材料。在一些情况下，通过不限于以下的方式实现涂覆：化学气相沉积(cvd)、物理气相沉积(pvd)、引发式化学气相沉积(i-cvd)、原子层沉积(ald)、分子层沉积(mld)、常压cvd(apcvd)、低压cvd(lpcvd)、超高真空cvd(uhvcvd)、气溶胶辅助cvd(aacvd)、直接液体注射cvd(dlicvd)、微波等离子体辅助cvd(mpcvd)、等离子体增强cvd(pecvd)和燃烧化学气相沉积(ccvd)。

在一些情况下，聚结器包括可移除的限制物。可移除的限制物可以是闸阀、针阀、球阀、旋转销或滑动销中的至少一个。根据整料材料的接头出口上的示例性可移除限制物，圆柱形端口从与接头出口的轴线同轴的点延伸，该轴线垂直于接头和点的横截面。将与整料相容的圆柱形塞材料插入端口，以便基本上覆盖接头的第一出口的横截面。圆柱形塞的一部分延伸到由亲氟材料构成的接头出口中。圆柱形塞中的开口允许一系列旋转位置，使得出口关闭，因此分散相的任何部分都无法穿过。圆柱形塞中的开口还允许一系列旋转位置，使得出口打开并且分散相可以离开。在一些情况下，圆柱形塞的外径大于圆柱形端口的内径。有时，在圆柱形塞与整料之间提供紧密密封。圆柱形塞可以是弹性的。在一些情况下，允许小范围的旋转位置。

根据接头出口的可移除限制物的第二示例，接头的出口包括整料中的第一腔和通过防漏密封连接到整料的流体通道。通过阀产生可移除的限制物。阀由与连续相相容的材料组成。在一些情况下，连续相是氟化油，并且阀由亲氟材料组成。阀可以是闸阀或全通径球阀。在一些情况下，阀门不会完全接触阀体，并且允许分散相通过。当阀是全通径球阀时，阀的端口内径与入口通道或出口通道的内径相同。这可以防止分散相的部分被捕获或破坏。

在一些情况下，分散相使用物理或电子力(如静电力、磁力、压力或剪切力)聚结。力可以由外部源提供。例如，将增加的压力施加到连续相，使得分离相被分离。在一些情况下，聚结器使用重力使得水相上升而油不上升。室的形状，如圆锥形状，可以改善聚结。在一些情况下，分散相的第一部分和分散相的第二部分自发地组合。在一些情况下，组合至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或超过10个分散相。在一些情况下，组合至多约2、3、4、5、6、7、8、9、10或超过10个分散相。在一些情况下，组合至多、约2、3、4、5、6、7、8、9或10个分散相，或在横跨上述值的范围内的分散相。在一些情况下，在聚结之后，聚结的液滴通过湍流漩涡进一步混合。例如，湍流涡流采用通过流体加速(例如通过管弯曲部或湍流增强器)产生的剪切力和层流梯度来混合聚结液滴。

在聚结状态期间在接头处提供外部源。接头入口和出口仅包含分散相。接头出口包括分散相和连续相二者。接头中的可移除限制物处于“关闭”状态。接头出口处于“打开”状态。在“关闭”状态下，不允许分散相的任何部分通过可移除限制物。在一些情况下，连续相可以通过可移除限制物。在“冲洗”状态下，分散相的至少两部分已经组合。接头中的可移除限制物已经打开，使出口处于“打开”状态，并且组合的分散相和连续相通过接头出口。接头入口和出口包括连续相。接头出口处于“打开”状态。没有外部源施加于出口。在一些情况下，例如，出口包括可移除的限制物。在“冲洗”状态期间，接头出口关闭，使得连续相通过接头出口离开。在“就绪”状态下，接头入口和出口包括连续相。接头出口处于“关闭”状态，并且接头出口处于“打开”状态。系统中没有分散相的任何部分。在接头的出口处没有施加外部源。至少两个分散相流过接头入口。

根据实施方式，在接头出口处提供的电源可以包括位于接头出口的相对侧上的第一电极和第二电极。在电极之间产生跨接头出口的电势差。电场使接头出口种的分散相周围的表面活性剂极化，并提供能量以组合至少两个分散相。在一些情况下，电极被成形为尖点，以便增加跨接头出口的电场强度。在一些情况下，第一电极插入整料的第一端口中，而第二电极插入整料中的第二端口中。在一些情况下，电极之间的电势差为至少100v。在一些情况下，电极之间的电势差为至少100、200、500、750、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、15000、20000、25000、30000或40000、50000、60000、70000、80000、90000或超过100000v。在一些情况下，电势差为至多约100、200、500、750、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、15000、20000、25000、40000、50000、60000、70000、80000、90000或超过100000v。在一些情况下，电势差为至少、至多、约100、200、500、750、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、15000、20000、25000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000或100000v，或在横跨上述值的范围内。电势可以在约50-3000、100-25000、200-20000、300-18000、400-17000、500-16000、600-15000、700-14000、800-13000、900-12000、1000-10000、1200-8000、1400-7000、1600-6000、1800-5000和2000-4000v的范围内。在一些情况下，电势在约1000v至约10000v的范围内。有时，电流是直接的。在一些情况下，电流是交替的，在约10khz至100khz的范围内。在一些情况下，交替电流为至少5、10、20、30、40、50、60、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150或超过150khz。在一些情况下，交替电流为至多约5、10、20、30、40、50、60、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150或超过150khz。在一些情况下，交替电流为至多、约5、10、20、30、40、50、60、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150khz，或在横跨上述值的范围内。

在一些情况下，分散相的电导率大于连续相的电导率。电导率的差异可以引起电荷或离子的移动，从而部分或完全抵消电场。在一些情况下，分散相的表面具有非零表面电荷，其中不同体积的分散相具有相反的电荷并彼此吸引。然后可以取代连续相。在一些情况下，提供必要的能量来破坏表面并使分散相的体积聚结。

根据将外部源添加到接头的第一出口的另外示例，可移除限制物可以防止连续相和分散相的通过。入口端口位于接头出口与可移除限制物之间。入口端口可以填充连续相并连接到增加连续相压力的装置。在加载状态期间，第一可移除限制物打开，同时第二可移除限制物关闭，使得通过重力诱捕收集分散相的部分。一旦收集了分散相的所有部分，则第一可移除限制物关闭。可以开始聚结，其中连续相的压力在入口端口处增加，以使分散相的部分组合。可以通过诸如往复泵或蠕动泵等泵中的至少一种来增加压力。替代地或组合地，采用升高温度来聚结分散相。

液滴发生器

在一些实施方式中，通过聚结包含核酸样品的第一液滴和包含试剂的第二液滴形成的合并液滴可以提供给液滴发生器。例如，由如本文所述的聚结器生成的合并液滴可以流到液滴发生器。液滴发生器可以被配置用于将合并的液滴分割成多个液滴。在一些实施方式中，通过分割合并的液滴形成的多个液滴中的每一个均包含足够的核酸和试剂以进行所需的化学反应。

在一些情况下，液滴发生器包括t型接头型份化器(fractionator)，其被配置用于分割流体，如合并的液滴。替代地或组合地，通过流体搅动、微流体流动接头，和/或自发地生成液滴。合并的液滴通常在不混溶的流体(如本文所述的一种或多种油)中输送到液滴发生器。液滴发生器的表面可以是亲氟和疏水中的至少一种。

在一些情况下，液滴发生器进一步将液滴分成多个液滴。在一些实施方式中，液滴发生器可以被配置用于生成至少约1000、2000、4000、6000、8000、10000、12000、14000、16000、18000、20000、25000、30000、40000、50000、100000、200000、500000、1百万、2百万、3百万、4百万、5百万、1千万个液滴。在一些情况下，液滴发生器可以被配置用于生成至多约1000、2000、4000、6000、8000、10000、12000、14000、16000、18000、20000、25000、30000、40000、50000、100000、200000、500000、1百万、2百万、3百万、4百万、5百万、1千万个液滴。在一些实施方式中，液滴发生器可以被配置用于生成至少、至多、约1000、2000、4000、6000、8000、10000、12000、14000、16000、18000、20000、25000、30000、40000、50000、100000、200000、500000、1百万、2百万、3百万、4百万、5百万或1千万个液滴，或在横跨上述值的范围内的液滴。

在一些情况下，由液滴发生器生成的液滴的直径为至少约10、25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000或超过1000微米(μm)。在一些情况下，液滴的直径为至多约10、25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975或1000μm。在一些情况下，液滴的直径为至少、至多、约10、25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975或1000μm。或在横跨上述值的范围内。

反应器

本文描述了用于检测和定量至少一种靶分子的系统。在一些情况下，化学反应由反应器引发。反应器可以包括配置用于引发化学反应的温度、电场、磁场、声能和电磁辐射源中的至少一种。

在一些情况下，反应器包括热循环仪。传统的热循环仪以这样的方式操作，其中反应被固定并且热循环仪内的温度根据确定的热分布升高或降低。如本文所述的热循环仪可以包括处于固定的相应温度的至少两个温度区域。可以基于反应器被配置用于引发的化学反应来选择温度。包含一定量的样品核酸和用于所需化学反应的试剂的液滴，或反应液滴通常被使得与至少两个温度区域热接触。在一些情况下，反应液滴流过通道，使得可以实现不同温度的区域之间的交替热接触。因此，以这种方式配置的热循环仪通常更有效。

在一些情况下，反应液滴通过反应器或热循环仪以实现预定的热分布。可以选择热分布以引发所需的化学反应。在一些实施方式中，可以选择热分布以引发核酸扩增反应。反应液滴可以流过反应器或热循环仪，以在反应液滴中实现核酸扩增。例如，反应液滴可以在第一温度下保持第一指定的持续时间，并在第二温度下保持第二指定的持续时间。在一些实施方式中，可以来回改变反应液滴与至少两个温度区域之间的热接触以实现期望的热分布。反应器热循环仪可以具有至少1、2、3、4、5、6、7、8或超过8个区域或源。在一些情况下，反应器或热循环仪具有至多约1、2、3、4、5、6、7或8个区域或源。反应器或热循环仪可以具有至多、约1、2、3、4、5、6、7或8个区域或源，或具有在横跨上述值的范围内的区域或源。在一些情况下，区域包含特定温度。区域温度或温度源可以为至少约10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃或95℃。区域温度或温度源可以为至少、至多、约10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃或95℃或更高，或在横跨上述值的范围内。例如，区域或来源具有95℃的温度，如用于激活核酸扩增酶。在一些情况下，第一温度区域或第一温度源具有在85℃或更低，至95℃或更高的范围内的温度。第二温度区域或第二温度源可以在55℃或更低，至70℃或更高的范围内。在一些情况下，第二区域或第二温度源具有小于、大于、约60℃或在与60℃相差不超过一度的范围内的温度。可以选择温度区域或温度源的温度以实现核酸扩增反应的核酸变性、核酸退火和核酸延伸阶段中的至少一个。

热循环仪通常包括缠绕在一个或多个组件周围的管，该组件被配置成保持在不同的温度下。反应液滴可以流过管道，使得反应液滴达到反应液滴的所需热分布。在一些情况下，管缠绕在加热块周围。在一些实施方式中，热循环仪包括围绕两个加热块缠绕的管，每个加热块配置成保持在特定的温度下。在一些情况下，管以蛇形方式缠绕。管的内部水力直径可以在约0.000001英寸(”)和约0.25”的范围内。管的内部水力直径可以在约或小于0.000001英寸(”)至约或大于5.0”的范围内。在一些情况下，内径为至少约0.000001”、0.000005”、0.00001”、0.00005”、0.0001”、0.0005”、0.001”、0.005”、0.01”、0.05”、0.1”、0.5”或1.0”。在一些情况下，内径为至多约0.000001”、0.000005”、0.00001”、0.00005”、0.0001”、0.0005”、0.001”、0.005”、0.01”、0.05”、0.1”、0.5”、1.0”或超过1.0”。在一些情况下，内径为至少、至多、约0.000001”、0.000005”、0.00001”、0.00005”、0.0001”、0.0005”、0.001”、0.005”、0.01”、0.05”、0.1”、0.5”、1.0”、1.5”、2.0”、2.5”、3.0”、3.5”、4.0”、4.5”或5.0”，或在横跨上述值的范围内。在一些情况下，热循环仪包括在芯片上的微流体通道。

在一些情况下，反应时间由管和/或通道内的流速决定。在一些情况下，反应时间由管和/或通道的长度决定。通常，通过改变流速和长度中的至少一个来改变反应时间。在一些情况下，反应液滴不止一次地通过与至少两个加热块接触的管和/或通道。例如，反应液滴多次通过与至少两个加热块接触的管和/或通道允许相应次数的核酸扩增循环。

在传统的热循环仪中，为了在加热块周围容纳多个包裹物，将通道的轴线定向成使得存在浮力问题。具体地，分散相的液滴不能完全填充通道直径，并且由于浮力，不同大小的液滴可能以不同的速度移动。这可能导致液滴轴向分散、液滴碰撞，以及潜在的聚结、破坏和污染。

如本文所述的热循环仪可通过将流动约束成平面或基本上平面的布置来解决浮力问题。在一些实施方式中，热循环仪包括一个或多个加热块，该加热块包括板坯配置。加热块可以是加热卡。在一些实施方式中，热循环仪可以包括用于每个温度区域的加热块。在一些情况下，使管和/或通道与每个加热块进行热传递连通，并以蛇形方式在每个区域内通过。热循环仪可以包括在每个加热块的外部上的管，该管被配置成缠绕在每个加热块周围，其中管沿着垂直于每个加热块的最长尺寸的方向行进。

或者，热循环仪包括块，而没有管。例如，热循环仪包括一个或多个块，包括在一个或多个块中的每一个内的通道。通道可以缠绕在加热块周围并沿垂直于其最长尺寸的方向行进。示例性通道包括在加热块内产生的微流体通道，或在加热块中产生的微流体通道的一部分。在一些情况下，通道包含封盖层。有时，封盖层具有高导热性。

在一些实施方式中，热循环仪包括与一个或多个加热块热接触的管和通道。在一些实施方式中，热循环仪包括粘附到加热块的独立式柔性管。在一些情况下，调节柔性管以匹配加热块上的所需表面图案。在一些情况下，柔性管安装在块表面上的预切割通道内的加热块中。

在一些情况下，热循环仪被配置用于改善传导性传热和温度均匀性中的至少一个。例如，这通过使用高导热性浆料来消除热循环仪内的气隙(如在管道与加热块的一个或多个表面之间的气隙)而实现。

在一些情况下，热循环仪在扩增之前引发逆转录的一种或多种化学反应。在一些情况下，这通过设置在被配置用于引发逆转录的温度下的单独加热块来实现。加热块可以包括矩形形状。在一些情况下，系统包括一组选择阀，以允许使用者选择是否使反应液滴流过配置用于引发逆转录的加热块。在一些情况下，将单独的加热块设置在配置用于核酸扩增的温度下，该核酸扩增包括用于酶活化(如聚合酶活化)的“热启动”步骤。在一些实施方式中，“热启动”步骤可以在约95℃的温度下进行以活化聚合酶。

作为温度的替代或与其组合，通过施加电磁辐射引发反应。在一些情况下，电磁辐射在反应流动路径外部提供，其中反应流动路径对至少一个频率的电磁辐射部分透明。在一些情况下，反应流动路径包括玻璃、陶瓷或聚合物材料中的至少一种的管。在一些情况下，反应流动路径是材料中的通道，其对至少一个电磁辐射频率是透明的。在一些情况下，电磁辐射的波长为至少约10、25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000或超过1000nm。在一些情况下，电磁辐射的波长为至多约10、25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975或1000nm。在一些情况下，电磁辐射的波长为至少、至多、约小于10、10、25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000nm或大于1000nm，或在横跨上述值的范围内。

液滴检测

在使反应通过诸如热循环仪等反应器之后，通常个体地分析液滴。如本文所述，在一些实施方式中，系统包括在反应器下游的探测器。在一些情况下，系统包括配置用于在将液滴流到探测器之前将流体(如通过流体接头)引入液滴流中以进一步将液滴彼此分离的装置。一旦液滴分离，常设置探测器以便每个通过的液滴获得至少1个数据点。在一些情况下，每个液滴收集至少1、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500或超过500个数据点。在一些情况下，每个液滴收集至多约1、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500或超过500个数据点。在一些情况下，每个液滴收集至少、至多、约1、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475或500个数据点，或在横跨上述值的范围内的数据点。

在一些情况下，液滴然后流过液滴探测器，并且信号得到检测。通常，以光学、电学、机械和磁力的方式中的至少一种测量液滴。信号可以是，但不限于，电磁辐射的强度、电磁辐射的频率、电场或磁场的强度，或电场或磁场的定向中的至少一种。在一些情况下，将液滴与背景进行比较。替代地或组合地，将液滴与另一液滴进行比较。例如，通过确定与不包含至少一种靶液滴分子的液滴相比，包含至少一种靶核酸分子的液滴的数目来定量浓度。在一些情况下，计算具有靶分子的液滴数目与不包含靶分子的液滴数目的比率以根据液滴确定浓度。

通常，本文所述的一个或多个系统的数学运算原理适用于遵循泊松分布模型的靶分子。当事件在某些条件下发生时，泊松分布模拟事件在时间区间内发生的次数。例如，事件是每个液滴发生液滴包含一定浓度的靶分子的次数。泊松分布是一个合适的模型，因为以下假设对于液滴形成的方式而言为真：

·k是可能在单个液滴中发现的靶分子的数目。k可以取0、1、2等值。

·具有某个值k的液滴的出现不会影响其他液滴以任何其他值k出现的概率。也就是说，靶分子的液滴占据在每个液滴中独立地发生。·以某个值k生成液滴的比率是恒定的。该比率不会在某些时间间隔中较高而在其他时间间隔中较低。

·具有浓度k的液滴将在某个间隔中出现的概率与间隔的长度成比例。

当满足这些条件时，k被称为泊松随机变量，并且k的分布是泊松分布。因此，液滴中分子靶标的分布呈现为下式，

其中p[k]是泊松分布，其可以解释为当μ是区间中每个液滴的平均分子浓度时，在该区间中随机选择的液滴将包含k个拷贝的靶分子的概率。k是整数，μ是0至区间中k的最大值之间的某个实数。对于测量靶标组分浓度的测定，靶标组分的单元或分子将按照泊松分布分布液滴之间，并且给定液滴将包含靶标组分的k个单元或分子的概率由p[k]给出。系统中的探测器不能区分1种组分与超过1种组分，但它可以区分0拷贝与1个拷贝。获得零拷贝的概率可以通过p[0]＝n[0]/(n[0]+n[1+])估算，其中n[0]是具有零拷贝的液滴数目而n[1+]是具有一个或多个拷贝的液滴数目。对于该系统，可以通过计算发射强度低于发射阈值强度的液滴数目来确定n[0]，并且可以通过计算发射强度超过阈值强度的液滴数目来确定n[1]。使用其中k＝0的p[k]的等式，我们得到μ＝-ln(n[0]/(n[0]+n[1]))，其中ln是自然对数。因此，群体中具有零个单元或靶分子的液滴数目与群体中液滴总数的比率提供了平均浓度μ的直接测量。对于液滴流中的任何连续间隔都是如此。通过将该测量值乘以间隔中所有反应液滴的总体积，间隔中包含的靶分子的绝对浓度测量为

c＝μ∑vd，

其中c是样品中的靶分子浓度，vd是液滴体积，∑vd是间隔中包含的总反应体积。通过样品注射器、聚结器和液滴发生器的高度精确和可重复特性，可以实现这种靶标浓度定量的直接方法。具体地，通过控制注射的总体积，提前知道液滴体积。竞争方法将预测的液滴体积乘以液滴的总数，要求精确控制液滴大小并拒绝不符合该大小的液滴。这在其硬件设计和软件分析中引入了显著的复杂性，并且降低了其准确性、精度和灵敏度(因为必须拒绝一些液滴)。注射器和混合器与液滴发生器相结合的设计允许我们进行精确和可重复的等分。通过允许产生的液滴数目和大小的灵活性，并且通过避免为了获得n[0]和n[1]的值而在测量中排除异常液滴的需要，该仪器能够以较低的理论检测极限、在任意的动态范围内并且以比其他当前使用的商业方法更高的准确性定量靶分子浓度。

液滴探测器包括光学激发源、准直光学器件、二向色滤波器、物镜光学器件、发射滤波器、探测器、激发滤波器和针孔滤波器中的至少一个。示例性光学激发源是激光器、发光二极管、光电二极管、光电倍增管和滤光的宽带源。在一些情况下，激发源是功率门控的或持续供电。在一些情况下，针孔滤波器位于探测器的前方，以阻挡相邻液滴和来自被分析的中心液滴的流体。替代地或组合地，当定位于物镜的后焦平面处时，针孔用作共焦孔。在一些情况下，共焦孔排除自动发射和从焦点体积外部的散射。在一些情况下，液滴探测器包含流体通道。可以收缩流体通道以允许单个液滴在垂直于光轴的轴线上通过。滑动聚焦器可以用于在围绕聚焦体积的三个正交方向上定位流体通道。

在一些情况下，在暴露于诸如电磁辐射等激发源之后，探测器测量发射的电磁辐射。有时，探测器包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或超过10个激发源。在一些情况下，探测器包括3个激发源。在一些情况下，探测器包括至少、至多、约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个激发源，或在横跨上述值的范围内的激发源。在一些情况下，激发在约300nm至约900nm的范围内。激发可以为至少约300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850或900nm。有时激发为至多约300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900或超过900nm。在一些情况下，激发为至少、至多、约300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850或900nm，或在横跨上述值的范围内。探测器可以测量至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或超过10个由分散相发射的频率范围。探测器可以测量至多、约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个由分散相发射的频率范围，或在横跨上述值的范围内的频率范围。有时，探测器测量3个频率范围。发射可以为至少约300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900或超过900nm。有时，发射为至多约300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900或超过900nm。发射可以为至少、至多、约300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850或900nm，或在横跨上述值的范围内。在一些情况下，使用光学滤波器。光学滤波器可以用于阻挡在所需频率范围或一组所需频率范围之外的电磁辐射。有时，光学针孔用于防止分散相发射的电磁辐射到达光电探测器。

图31示出了包括调制激发以执行多路复用的探测器的过程工作流程的示例。在一些情况下，探测器工作流程包括激发源和检测。如图31所示，可以将连续相添加到流动路径，以在将液滴引入探测器之前增加相邻液滴之间的距离。液滴可以暴露于一个或多个激发源，使得可以检测由于刺激而由液滴产生的信号。可以处理检测到的信号以去除系统中存在的任何噪声，并将该信号用于进行各种测量以确定反应进程。

参考图32，探测器包括连续相源和连续相的入口，该入口位于通过电磁辐射照射分散相之处的上游。注射连续相以在空间上分离分散相体积(图32)。

参考图33和图34，探测器包括激发源、光电探测器、至少一个二向色镜3303、3403和至少一个滤波器3405、3407。在一些情况下，探测器包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或超过10个二向色镜。在一些情况下，探测器包括至多、约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个二向色镜，或在横跨上述值的范围内的数目。在一些情况下，探测器包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或超过10个滤波器。在一些情况下，探测器包括至多、约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个滤波器，或在横跨上述值的范围内的数目。在一些情况下，探测器包括2个二向色镜3503、3505(例如图35)。参考图36，探测器包括至少一个激发源和至少一个光电探测器。每个光电探测器包括至少一个滤波器3603、3605，其定位于反应流动路径与光电探测器之间。参考图36，探测器包括至少一个滤波器3607、3609和至少一个二向色镜3611、3613(图36)。

在一些情况下，探测器包括控制器。控制器可以用于在激发源的开启和关闭状态之间交替(例如，图37)。例如，控制器在第一激发源的关闭状态与第二激发源的开启状态之间交替。在一些情况下，控制器施加信号滤波以增加信噪比。示例性信号滤波是锁定放大器。在一些情况下，反应流动路径的一部分是透明的。控制器可以同步来自探测器的数据以将信号分配给分散相的体积。

在一些情况下，同时跟进反应进程。例如，系统包括多个激发源和可以探测所述多个激发源的多个光电探测器。在一些情况下，反应流动路径的一部分是透明的。反应流动路径对于激发源可以是透明的，使得分散相可以通过电磁辐射激发，并且辐射强度可以与反应进程相关联。有时，探测器包括色散光栅，以在空间上区分由一个源发射的电磁辐射与由第二源发射的电磁辐射(例如图38)。图39描绘了允许多路复用的探测器的配置。例如，如图39所示，探测器可以包括两个检测区域，包括与第二激发源和光电探测器间隔开的第一激发源和光电探测器。

光电探测器可以包括多个检测区域。在一些情况下，信号由光学响应物质(如染料或荧光探针)的活性产生。染料的示例包括sybr绿i、sybr绿ii、sybr金、溴化乙锭、亚甲基蓝、派洛宁y、dapi、吖啶橙、blueview或藻红蛋白。还可以使用多种反应性荧光探针。荧光团可以是芳族或杂芳族化合物。荧光团可以是，例如，芘、蒽、萘、吖啶、芪、苯并噁唑、吲哚、苯并吲哚、噁唑、噻唑、苯并噻唑、花青、羰花青、水杨酸盐、邻氨基苯甲酸盐、呫吨染料、香豆素。示例性的呫吨染料包括，例如，荧光素和罗丹明染料。荧光素和罗丹明染料包括，但不限于，6-羧基荧光素(fam)、2'7'-二甲氧基-4'5'-二氯-6-羧基荧光素(joe)、四氯荧光素(tet)、6-羧基罗丹明(r6g)、n,n,n；n'-四甲基-6-羧基罗丹明(tamra)、6-羧基-x-罗丹明(rox)。合适的荧光探针还包括在α或β位具有氨基基团的萘胺染料。例如，萘氨化合物包括1-二甲基氨基萘基-5-磺酸盐、1-苯胺基-8-萘磺酸盐和2-对甲苯胺基-6-萘磺酸盐、5-(2'-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(edans)。示例性香豆素包括，例如，3-苯基-7-异氰酸基香豆素；吖啶，如9-异硫氰基吖啶和吖啶橙；n-(对-(2-苯并噁唑基)苯基)马来酰亚胺；花青，例如，吲哚二碳菁3(cy3)、吲哚二碳菁5(cy5)、吲哚二碳菁5.5(cy5.5)、3-(-羧基-戊基)-3'-乙基-5,5'-二甲基氧杂菁(cya)；1h,5h,11h,15h-呫吨[2,3,4-ij:5,6,7-i'j']二喹嗪-18-鎓、9-[2(或4)-[[[6-[2,5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]-6-氧代己基]氨基]磺酰基]-4(或2)-磺基苯基]-2,3,6,7,12,13,16,17-八氢-内盐(tr或德克萨斯红)；或bodipytm染料。

可以同时测量多个荧光团信号。例如，通过使用与发出不同频率的报告染料缀合的多个序列特异性探针来分析核酸扩增反应中的多个靶序列。在一些情况下，使用至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或超过20种多序列特异性探针。在一些情况下，使用至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或超过20种多序列特异性探针。在一些情况下，使用至多、约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种，或在横跨上述值的范围内的多序列特异性探针。本文描述了可以使用单个光电探测器和多个激发源，而不是使用多个探测器，来执行的多路复用方法。在一些情况下，多通滤波器用于将来自每个激发源的光发送到样品上并返回到探测器。激发源与探测器之间的这种循环可以允许实现多路复用。在一些情况下，测量每个波长处的每个液滴的多次读取，这可以用于抵消背景。有时，例如在单分子检测中(例如，抗原和其他蛋白质)，使用循环来扩增低水平信号。在一些情况下，执行串行多路复用。

在一些情况下，本文公开的系统和方法包括至少一个计算机程序或其使用。计算机程序包括可在数字处理装置的cpu中执行的一系列指令，其被编写以执行指定的任务。计算机可读指令可以实现为执行特定任务或实现特定数据类型的程序模块，如函数、对象、应用程序编程接口(api)、数据结构等。例如，计算机程序上的一系列指令用于串行多路复用，以鉴定待测试的序列靶标。待测试的靶序列的鉴定可以自动化或由使用者选择。

在一些示例中，计算机程序包括独立应用程序，该独立应用程序是作为独立计算机进程运行的程序，而不是现有进程的附加组件，例如，不是插件。例如，使用者将从机载触摸屏中选择要在系统上执行的测试。

在一些情况下，计算机包括外部装置。在一些情况下，计算机与外部装置之间的通信通过物理电缆、存储装置、存储器装置和无线连接中的至少一个发生。在一些情况下，系统与个人计算机、平板计算机或移动装置上的软件系统接口。

例如，系统包括存储和/或存储器装置。存储和/或存储器装置是用于临时或永久存储数据或程序的一个或多个物理设备。在一些情况下，装置是易失性存储器，并且需要电源来保持存储的信息。替代地或组合地，装置是非易失性存储器，并且在数字处理装置未通电时保留存储的信息。例如，非易失性存储器包括闪存、动态随机存取存储器(dram)、铁电随机存取存储器(fram)、相变随机存取存储器(pram)中的至少一个。在一些情况下，装置是存储装置，作为非限制性示例，包括cd-rom、dvd、闪存装置、磁盘驱动器、磁带驱动器、光盘驱动器和基于云计算的存储。在一些情况下，存储和/或存储器装置是如本文所公开的那些装置的组合。替代地或组合地，数据可以存储在数据库中，该数据库可以在稍后被访问或由第三方应用程序分析。

定义

除非另外限定，否则本文使用的所有技术术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。

如本文所使用的，术语“包括”及其语法等同物指定所述特征、整数、步骤、操作、元素和/或组件的存在，但不排除存在或添加一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、元素、组件和/或其组。如本文所使用的，术语“和/或”包括一个或多个相关所列项目的任何和所有组合。

除非在上下文中明确说明或显而易见，否则如本文所使用的，关于数字或数字范围的术语“约”应理解为表示所述数字和其+/-10％的数字，或对于列出范围的值，表示低于所列下限10％至高于所列上限的10％。

如本文所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代，除非上下文另有明确说明。

如本文所使用的，术语“扩增(amplifying)”和“扩增(amplification)”可互换使用，并且通常是指产生核酸的一个或多个拷贝。

如本文所使用的，术语“核酸”和“核酸分子”可互换使用，并且通常是指任何长度的核苷酸的聚合形式，即脱氧核糖核苷酸(dntp)或核糖核苷酸(rntp)或其类似物。核酸可以具有任何三维结构，并且可以执行已知或未知的任何功能。核酸的非限制性示例包括脱氧核糖核酸(dna)、核糖核酸(rna)、肽核酸(pna)、基因或基因片段的编码或非编码区、由连锁分析定义的基因座、外显子、内含子、信使rna(mrna)、转移rna、核糖体rna、短干扰rna(sirna)、短发夹rna(shrna)、微rna(mirna)、核酶、cdna、重组核酸、支链核酸、质粒、载体、任何序列的分离的dna、任何序列的分离的rna、核酸探针和引物。核酸可以包含一种或多种修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物，例如锁核酸(lna)、氟化核酸(fna)、桥接核酸和硫代核苷酸。对核苷酸结构的修饰如果存在，可以在核酸组装之前或之后进行。核酸的核苷酸序列可以被非核苷酸组分(如接头或其他类型的间隔区)中断。核酸可以在聚合后被进一步修饰，如通过与可检测物质缀合或结合。在一些情况下，核酸可以是在一些实施方式中可以用于扩增另一种核酸分子的引物。

如本文所使用的，术语“引物”通常是指能够与模板核酸分子杂交并且能够通过模板核酸分子以模板指导的方式延伸的核酸分子。

如本文所使用的，术语“靶核酸”和“靶核酸分子”可互换使用，并且通常是指在核酸分子的起始群体中具有靶序列的核酸分子，期望这些核酸分子的存在、量和/或核苷酸序列，或这些中的一个种或多种的变化得到确定。在一些情况下，靶核酸分子可以是双链的。在一些情况下，靶核酸分子可以是单链的。通常，术语“靶核酸链”是指单链靶核酸分子。通常，术语“靶核酸序列”是指靶核酸链上的核酸序列。靶核酸分子或靶核酸序列可以是基因的一部分、调节序列、基因组dna、cdna、rna(包括mrna、mirna、rrna)或其他。靶核酸序列或靶核酸分子可以是来自样品的靶核酸序列或靶核酸分子，或是次级靶标，如扩增反应的产物。

如本文所使用的，术语“圆柱形”或其语法等同物是指这样的三维形状，其包括通过沿着与曲线平面相交的轴线投影闭合的二维曲线而形成的表面。该曲线可以是圆形、矩形或椭圆形，但并非在所有情况下都限于此。在一些情况下，术语“圆柱形”是指圆柱体。

编号实施方式

编号实施方式1包括用于在连续流动中自动进行测定的系统，所述系统包括：(a)流动路径，包括用于连续相的第一入口，和第一出口；(b)第一零死体积注射器，其中所述注射器被配置用于提供第一分散相；(c)第二零死体积注射器，其中所述注射器被配置用于提供第二分散相；(d)聚结器；(e)反应器；(f)探测器；以及(g)控制器。编号实施方式2包括编号实施方式1所述的系统，其中所述反应器被配置用于引发化学反应。编号实施方式3包括编号实施方式1-2所述的系统，其中所述反应器包括外部能量源。编号实施方式4包括编号实施方式1-3所述的系统，其中所述反应器是热循环仪。编号实施方式5包括编号实施方式1-4所述的系统，其中所述连续相包括疏水氟化油。编号实施方式6包括编号实施方式1-5所述的系统，其中所述第一分散相和所述第二分散相中的至少一个包括水。编号实施方式7包括编号实施方式1-6所述的系统，其中所述流动路径的表面包括氟聚合物，并且其中所述第一分散相和所述第二分散相中的至少一个不污染所述流动路径。编号实施方式8包括编号实施方式1-7所述的系统，其中所述氟化油为fc-3283、fc-40、fc-43、fc-70、3-乙氧基-1,1,1,2,3,4,4,5,5,6,6,6-十二氟-2-三氟甲基-己烷、2,2,3,3,4,4,4-七氟-1-丁醇、cf3cf2cf2ch2oh、全氟辛烷、全氟己烷、1,1,1-三氟辛烷和1,1,1,2,2-五氟癸烷中的至少一种。编号实施方式9包括编号实施方式1-8所述的系统，其中所述氟聚合物为聚氟乙烯(pvf)、聚偏二氟乙烯(pvdf)、聚四氟乙烯(ptfe)、聚三氟氯乙烯(pctfe)、全氟烷氧基聚合物、氟化乙丙烯(fep)、聚乙烯四氟乙烯(etfe)、聚乙烯三氟氯乙烯(ectfe)、全氟弹性体、碳氟化合物、含氟弹性体、全氟聚醚(pfpe)、全氟磺酸(pfsa)和全氟聚氧杂环丁烷中的至少一种。编号实施方式10包括编号实施方式1-9所述的系统，还包括表面活性剂。编号实施方式11包括编号实施方式1-10所述的系统，其中所述表面活性剂为碳氟化合物、碳氢化合物和硅氧烷中的至少一种。编号实施方式12包括编号实施方式1-11所述的系统，其中所述第一分散相和所述第二分散相中的至少一个的体积在约1皮升至约1毫升的范围内。编号实施方式13包括编号实施方式1-12所述的系统，其中所述流动路径包括在约0.001”至约0.5”的范围内的内部水力直径。编号实施方式14包括编号实施方式1-13所述的系统，其中所述系统进行核酸扩增反应。编号实施方式15包括编号实施方式1-14所述的系统，其中所述第一分散相包括至少一种核酸分子，并且其中所述第二分散相包括核酸扩增试剂。编号实施方式16包括编号实施方式1-15所述的系统，其中核酸扩增试剂为引物、探针、共混物(mastermix)、dntp、缓冲剂和酶中的至少一种。编号实施方式17包括编号实施方式1-16所述的系统，其中所述流动路径从第一温度区域循环到第二温度区域，以进行核酸扩增。编号实施方式18包括编号实施方式1-17所述的系统，其中所述探测器测量荧光信号。编号实施方式19包括编号实施方式1-18所述的系统，其中所述聚结器包括外部能量源。编号实施方式20包括编号实施方式1-19所述的系统，其中所述外部能量源由在至少两个电极之间的电场提供。编号实施方式21包括编号实施方式1-20所述的系统，其中在所述至少两个电极之间的电势在约100v至约25000v的范围内。编号实施方式22包括编号实施方式1-21所述的系统，其中所述外部能量源为压力源和机械源中的至少一种。编号实施方式23包括编号实施方式1-22所述的系统，其中所述压力源由泵提供。编号实施方式24包括编号实施方式1-23所述的系统，其中所述反应器包括固定温度区域。编号实施方式25包括编号实施方式1-24所述的系统，其中所述反应器包括至少两个固定温度区域。编号实施方式26包括编号实施方式1-25所述的系统，其中流动路径在所述至少两个固定温度区域之间循环。编号实施方式27包括编号实施方式1-26所述的系统，其中反应路径沿指定长度和速率中的至少一种循环。编号实施方式28包括编号实施方式1-27所述的系统，其中所述第一分散相包括生物样品，并且其中所述第二分散相包括裂解试剂。编号实施方式29包括编号实施方式1-28所述的系统，其中所述第一分散相包括第一药物前体，并且其中所述第二分散相包括第二药物前体。编号实施方式30包括用于在连续流动中自动进行测定的系统，所述系统包括：(a)流动路径，包括用于连续相的第一入口，和第一出口；(b)第一零死体积注射器，其中所述注射器提供第一分散相；(c)第二零死体积注射器，其中所述注射器提供第二分散相；(d)聚结器；(e)反应器；(f)液滴发生器；(g)探测器；以及(h)控制器，其中所述流动路径的表面对所述连续相具有增大的亲和力，并且其中所述第一分散相和所述第二分散相中的至少一个涂覆有表面活性剂。编号实施方式31包括编号实施方式1-30所述的系统，其中使用泊松分布分析液滴的聚集。编号实施方式32包括编号实施方式1-31所述的系统，其中所述液滴发生器产生数目在约2000个至约1000000个的范围内的液滴。编号实施方式33包括编号实施方式1-32所述的系统，其中所述液滴发生器产生数目在约3000个至30000个的范围内的液滴。编号实施方式34包括编号实施方式1-33所述的系统，其中所述系统进行基于乳液的数字核酸扩增。编号实施方式35包括编号实施方式1-34所述的系统，其中所述第一分散相包括至少一种靶核酸分子，并且其中所述第二分散相包括核酸扩增试剂。编号实施方式36包括编号实施方式1-35所述的系统，其中所述核酸扩增试剂为引物、探针、共混物、dntp、缓冲剂和酶中的至少一种。编号实施方式37包括编号实施方式1-36所述的系统，其中所述探测器测量荧光信号。编号实施方式38包括编号实施方式1-37所述的系统，其中所述荧光信号为染料、荧光探针、分子信标、杂交探针和蝎型探针中的至少一种。编号实施方式39包括编号实施方式1-38所述的系统，其中所述基于乳液的数字核酸扩增是连续多路复用的。编号实施方式40包括编号实施方式1-39所述的系统，其中所述基于乳液的数字核酸扩增是平行多路复用的。编号实施方式41包括编号实施方式1-40所述的系统，其中所述控制器使用自动聚类算法自动确定阈值信号。编号实施方式42包括编号实施方式1-41所述的系统，其中所述自动聚类算法为k均值聚类、单链接聚类、全链接聚类、高斯混合模型和基于密度的聚类中的至少一种。编号实施方式43包括编号实施方式1-42所述的系统，其中所述连续相包括疏水氟化油。编号实施方式44包括编号实施方式1-43所述的系统，其中所述第一分散相和所述第二分散相中的至少一个包括水。编号实施方式45包括编号实施方式1-44所述的系统，其中所述流动路径的表面包括氟聚合物，并且其中所述第一分散相和第二分散相中的至少一个不污染所述流动路径。编号实施方式46包括编号实施方式1-45所述的系统，其中所述氟化油为fc-3283、fc-40、fc-43、fc-70、3-乙氧基-1,1,1,2,3,4,4,5,5,6,6,6-十二氟-2-三氟甲基-己烷、2,2,3,3,4,4,4-七氟-1-丁醇、cf3cf2cf2ch2oh、全氟辛烷、全氟己烷、1,1,1-三氟辛烷和1,1,1,2,2-五氟癸烷中的至少一种。编号实施方式47包括编号实施方式1-46所述的系统，其中所述氟聚合物为聚氟乙烯(pvf)、聚偏二氟乙烯(pvdf)、聚四氟乙烯(ptfe)、聚三氟氯乙烯(pctfe)、全氟烷氧基聚合物、氟化乙丙烯(fep)、聚乙烯四氟乙烯(etfe)、聚乙烯三氟氯乙烯(ectfe)、全氟弹性体、碳氟化合物、含氟弹性体、全氟聚醚(pfpe)、全氟磺酸(pfsa)和全氟聚氧杂环丁烷中的至少一种。编号实施方式48包括编号实施方式1-47所述的系统，其中所述表面活性剂为碳氟化合物、碳氢化合物和硅氧烷中的至少一种。编号实施方式49包括编号实施方式1-48所述的系统，其中所述反应器从第一温度区域循环到第二温度区域，以进行核酸扩增。编号实施方式50包括编号实施方式1-49所述的系统，其中在所述第一温度区域在约85℃至约95℃的范围内。编号实施方式51包括编号实施方式1-50所述的系统，其中dna的变性发生在所述第一温度区域中。编号实施方式52包括编号实施方式1-51所述的系统，其中在所述第二温度区域在约55℃至约70℃的范围内。编号实施方式53包括编号实施方式1-52所述的系统，其中退火和延伸中的至少一个发生在所述第二温度区域中。编号实施方式54包括编号实施方式1-53所述的系统，其中产生循环的数目在约25个至约45个的范围内。编号实施方式55包括编号实施方式1-54所述的系统，还包括第三温度区域。编号实施方式56包括编号实施方式1-55所述的系统，其中逆转录发生在所述第三温度区域中。编号实施方式57包括编号实施方式1-56所述的系统，其中核酸扩增的“热启动”步骤发生在所述第三温度区域中。编号实施方式58包括编号实施方式1-57所述的系统，其中所述第一分散相包括rna、dna和蛋白质中的至少一种。编号实施方式59包括编号实施方式1-58所述的系统，其中所述第二分散相包括抗原、报道分子、引物、探针、共混物、缓冲剂和酶中的至少一种。编号实施方式60包括用于在连续流动中自动进行测定的方法，所述方法包括：(a)在第一分散相中制备包括至少一种靶分子的样品；(b)向包含乳液连续相的流动路径中自动注射预期量的所述第一分散相；(c)自动注射预期量的第二分散相；(d)将所述第一分散相和所述第二分散相收集在彼此附近；(e)聚结所述第一分散相和所述第二分散相；(f)从所合并的第一分散相和第二分散相生成液滴；(g)在液滴中引发反应；(h)检测所述反应；以及(i)通过将每个液滴中所检测到的至少一个化学反应的最终进展高于临界阈值的液滴数目与所检测到的至少一个化学反应的最终进展低于所述临界阈值的液滴数目进行比较，确定所述样品中靶分子的量。编号实施方式61包括编号实施方式1-60中的任一项，还包括自动调整由反馈回路确定的第二测定的参数。编号实施方式62包括编号实施方式1-61中的任一项，其中靶分子为dna、rna和蛋白质中的至少一种。编号实施方式63包括编号实施方式1-62中的任一项，其中所述反应为核酸扩增。编号实施方式64包括编号实施方式1-63中的任一项，其中核酸扩增试剂为引物、探针、共混物、dntp、缓冲剂和酶中的至少一种。编号实施方式65包括编号实施方式1-64中的任一项，还包括裂解所述样品。编号实施方式66包括编号实施方式1-65中的任一项，其中在第一测定的结果之后自动注射一定体积的水。编号实施方式67包括编号实施方式1-66中的任一项，其中所述样品为细胞、病毒、微生物流体中的至少一种。编号实施方式68包括编号实施方式1-67中的任一项，其中所述样品来自受试者。编号实施方式69包括用于计量乳液的分散相的体积的系统，所述系统包括：(a)滚筒，包括具有固定内部开放容积的整料；(b)滚筒的第一盖罩，包括用于入口的通道；(c)用于滚筒的第二帽盖，包括用于出口的通道；(d)引发分散相流过第一入口至第一流动路径的手段；(e)引发连续相流过第二入口至第二流动路径的手段，使得包含在所述固定内部容积中的任何分散相均流入所述第二流动路径。编号实施方式70包括编号实施方式1-69中的任一项，还包括多个入口。编号实施方式71包括编号实施方式1-70中的任一项，还包括多个出口。编号实施方式72包括编号实施方式1-71中的任一项，还包括多个用于注射的端口。编号实施方式73包括编号实施方式1-72中的任一项，其中待注射的体积在约1ul至约500ul的范围内。编号实施方式74包括编号实施方式1-73中的任一项，还包括盒。编号实施方式75包括编号实施方式1-74中的任一项，其中所述盒为用于基于乳液的数字核酸扩增试剂的储器。编号实施方式76包括用于在乳液的连续相中聚结至少一定体积的分散相的系统，所述系统包括：(a)第一流动通道，包括连接至乳液的分散相和连续相的第一源的第一入口；(b)第二流动通道，包括连接至乳液的分散相和连续相的第二源的第二入口；(c))第三流动通道，包括连接至流动路径的第一入口，其中第一轴线垂直于所述通道的横截面，并且其中所述第一轴线与对齐于增加的重力场方向的第二轴线形成小于45°的角度；(d)可移除的限制物；(e)第四流动通道，包括连接至连续相出口的第二出口，并且其中对于所述第四流动通道的长度的至少一部分，第三轴线与第四轴线成小于45°的角度；(f)所述第一流动通道、所述第二流动通道、所述第三流动通道和所述第四流动通道的接口；(g)外部源；以及(h)控制器，用于自动进行聚结。编号实施方式77包括编号实施方式1-76中的任一项，其中所述外部源应用于所述第三流动通道。编号实施方式78包括编号实施方式1-77中的任一项，其中所述第一流动通道、所述第二流动通道、所述第三流动通道和所述第四流动通道中的至少一个为整料中的腔。编号实施方式79包括编号实施方式1-78中的任一项，其中腔具有在约1/32”至约1/2”范围内的直径。编号实施方式80包括编号实施方式1-79中的任一项，其中所述第三流动通道和所述第四流动通道的长度在约1/16”至约6”的范围内。编号实施方式81包括编号实施方式1-80中的任一项，其中所述第一流动通道、所述第二流动通道、所述第三流动通道和所述第四流动通道中的至少一个包括管道。编号实施方式82包括编号实施方式1-81中的任一项，其中所述第一流动通道、所述第二流动通道、所述第三流动通道和所述第四流动通道中的至少一个被布置成增加聚结。编号实施方式83包括编号实施方式1-82中的任一项，其中所述可移除的限制物为闸阀、针阀、球阀、旋转销和滑动销中的至少一个。编号实施方式84包括编号实施方式1-83中的任一项，其中所述外部源为在至少两个电极之间的电场。编号实施方式85包括编号实施方式1-84中的任一项，其中在所述至少两个电极之间的电势在约100v至约10000v的范围内。编号实施方式86包括编号实施方式1-85中的任一项，其中在所述至少两个电极之间的电势在约500v至约2000v的范围内。编号实施方式87包括编号实施方式1-86中的任一项，其中所述电场具有在约10khz至约100khz的范围内的交流电。编号实施方式88包括编号实施方式1-87中的任一项，其中所述外部源为压力源和机械源中的至少一个。编号实施方式89包括编号实施方式1-88中的任一项，其中所述压力源由泵提供。编号实施方式90包括编号实施方式1-89中的任一项，其中所述控制器控制聚结的时机。编号实施方式91包括编号实施方式1-90中的任一项，其中所述分散相的至少一个体积包括靶分子。编号实施方式92包括编号实施方式1-91中的任一项，其中所述分散相的至少一定体积包括酶。编号实施方式93包括编号实施方式1-92中的任一项，其中所述分散相的至少一个体积包括引物、探针、共混物、缓冲剂和dntp中的任一种。编号实施方式94包括用于在乳液的连续相中聚结至少一定体积的分散相的系统，所述系统包括：(a)第一流动通道，包括连接至乳液的第一分散相和第一连续相的第一源的第一入口；(b)第二流动通道，包括连接至乳液的第二分散相和第二连续相的第二源的第二入口；(c))第三流动通道，包括连接至流动路径的第一入口，其中第一轴线垂直于所述通道的横截面，并且其中所述第一轴线与对齐于增加的重力场方向的第二轴线形成小于45°的角度；(d)可移除的限制物；(e)第四流动通道，包括连接至连续相出口的第二出口，并且其中对于所述第四流动通道的长度的至少一部分，第三轴线与第四轴线成小于45°的角度；(f)所述第一流动通道、所述第二流动通道、所述第三流动通道和所述第四流动通道的接口；(g)外部源；(h)控制器，用于自动进行聚结；其中所述第一流动通道、所述第二流动通道、所述第三流动通道和所述第四流动通道中的至少一个的表面对所述第一连续相和第二连续相具有增大的亲和力，并且其中所述第一分散相和所述第二分散相中的至少一个涂覆有表面活性剂。编号实施方式95包括用于在乳液的连续相中聚结至少一定体积的分散相的系统，所述系统包括：(a)流动通道，其连接至乳液中的分散相和连续相的多个源的输入；(b)可移除的限制物；(c)外部源；以及(d)控制器，用于自动进行聚结。编号实施方式96包括编号实施方式1-95中的任一项，其中流动通道的表面对所述连续相具有增大的亲和力，并且其中所述分散相涂覆有表面活性剂。编号实施方式97包括一种用于将已知量的至少一个体积的分散相自动混合的系统，所述系统包括：(a)第一零死体积注射器，其中所述注射器提供第一分散相；(b)第二零死体积注射器，其中所述注射器提供第二分散相；以及(c)聚结器。编号实施方式98包括编号实施方式1-97中的任一项，还包括连续相的源和第二聚结器。编号实施方式99包括编号实施方式1-98中的任一项，还包括液滴发生器。编号实施方式100包括编号实施方式1-99中的任一项，其中所述聚结器连接至多个注射器，所述多个注射器向所述聚结器提供试剂。编号实施方式101包括编号实施方式1-100中的任一项，其中所述多个注射器中的至少一个注射器提供水。编号实施方式102包括一种聚结至少一定体积的分散相的方法，所述方法包括：(a)注射已知体积的第一分散相；(b)注射已知体积的第二分散相；(c)将所述第一分散相和所述第二分散相诱捕在聚结器中；(d)施加外部源；以及(e)打开可移除限制物至下游流动路径。编号实施方式103包括编号实施方式1-102中的任一项，其中所述可移除的限制物为闸阀、针阀、球阀、旋转销和滑动销中的至少一个。编号实施方式104包括编号实施方式1-103中的任一项，其中所述外部源为在至少两个电极之间的电场。编号实施方式105包括编号实施方式1-104中的任一项，其中在所述至少两个电极之间的电势在约100v至约10000v的范围内。编号实施方式106包括编号实施方式1-105中的任一项，其中在所述至少两个电极之间的电势在约500v至约2000v的范围内。编号实施方式107包括编号实施方式1-106中的任一项，其中所述电场具有在约10khz至约100khz的范围内的电流。编号实施方式108包括编号实施方式1-107中的任一项，其中所述外部源为压力源或机械源中的至少一个。编号实施方式109包括编号实施方式1-108中的任一项，其中所述压力源由泵提供。编号实施方式110包括一种用于将样品中的分析物定量的系统，包括预测量的试剂盒、连续试剂流道、样品输入端口、注射器、聚结器、至少一个温度控制体，以及探测器，其中所述系统在无需将所述样品计量递送至所述样品输入端口的情况下定量所述分析物。编号实施方式111包括编号实施方式1-110中的任一项，还包括液滴发生器。编号实施方式112包括编号实施方式1-111中的任一项，其中操作所述系统的所有步骤都不需要由系统操作者进行样品或试剂的计量等分。编号实施方式113包括编号实施方式1-112中的任一项，其中所述样品中的所述分析物在所述样品被引入所述系统中之后不超过1小时定量。编号实施方式114包括编号实施方式1-113中的任一项，其中所述样品中的所述分析物在所述样品被引入所述系统中之后不超过30分钟定量。编号实施方式115包括编号实施方式1-114中的任一项，其中所述样品中的所述分析物在所述样品被引入所述系统中之后不超过20分钟定量。编号实施方式116包括编号实施方式1-115中的任一项，其中所述系统测量乳液的个体液滴中的分析物存在。编号实施方式117包括编号实施方式1-116中的任一项，其中所述系统将乳液的个体液滴中分析物存在的测量值与乳液的个体液滴中分析物存在的频率的阈值相比较。编号实施方式118包括编号实施方式1-117中的任一项，其中当乳液的个体液滴中分析物存在的所述测量值高于所述阈值时，所述系统稀释所述样品的剩余等分试样。编号实施方式119包括编号实施方式1-118中的任一项，其中所述系统测量从所述样品的经稀释的剩余等分试样生成的乳液的个体液滴中的分析物存在。编号实施方式120包括编号实施方式1-119中的任一项，其中当乳液的个体液滴中分析物存在的所述测量值低于所述阈值时，所述系统浓缩所述样品的剩余等分试样。编号实施方式121包括编号实施方式1-120中的任一项，其中所述系统测量从所述样品的经浓缩的剩余等分试样生成的乳液的个体液滴中的分析物存在。编号实施方式122包括编号实施方式1-121中的任一项，其中所述系统的操作不需要在测量样品中的分析物期间计量递送任何试剂。编号实施方式123包括编号实施方式1-122中的任一项，其中所述系统的操作不需要在测量样品中的多个分析物期间计量递送任何试剂。编号实施方式124包括编号实施方式1-123中的任一项，其中所述系统的操作不需要在测量多个样品中的多个分析物期间计量递送任何试剂。编号实施方式125包括编号实施方式1-124中的任一项，其中所述分析物是第一分析物，并且其中所述系统在单次样品运行中定量所述样品中的第二分析物。编号实施方式126包括编号实施方式1-125中的任一项，其中所述系统在不超过20分钟内定量第一样品。编号实施方式127包括编号实施方式1-126中的任一项，其中所述系统在所述第一样品定量后的不超过5分钟内定量第二样品。编号实施方式128包括编号实施方式1-127中的任一项，其中所述系统在所述第一样品定量后的不超过5分钟内定量第二样品。编号实施方式129包括编号实施方式1-128中的任一项，其中所述样品定量至少20个样品。编号实施方式130包括编号实施方式1-129中的任一项，其中所述样品定量至少50个样品。编号实施方式131包括编号实施方式1-130中的任一项，其中所述预测量的试剂盒包含足以分析至少10个样品的试剂。编号实施方式132包括编号实施方式1-131中的任一项，其中所述预测量的试剂盒包含足以分析至少20个样品的试剂。编号实施方式133包括编号实施方式1-132中的任一项，其中所述预测量的试剂盒包含足以分析至少50个样品的试剂。编号实施方式134包括编号实施方式1-133中的任一项，其中所述预测量的试剂盒包含足以分析至少100个样品的试剂。编号实施方式135包括编号实施方式1-134中的任一项，其中所述预测量的试剂盒包含足以分析至少1000个样品的试剂。编号实施方式136包括编号实施方式1-135中的任一项，其中所述预测量的试剂盒包含热灭活试剂。编号实施方式137包括编号实施方式1-136中的任一项，其中所述预测量的试剂盒包含逆转录试剂。编号实施方式138包括编号实施方式1-137中的任一项，其中所述预测量的试剂盒包含核酸扩增试剂。编号实施方式139包括编号实施方式1-138中的任一项，其中所述预测量的试剂盒包含热稳定核酸。编号实施方式140包括一种用于在连续流动中进行测定的系统，所述系统包括：(a)用于连续相的流动路径，包括第一入口和第一出口；(b)第一零死体积注射器，配置用于提供第一分散相；(c)第二零死体积注射器，配置用于提供第二分散相；(d)聚结器；(e)反应器；(f)探测器；以及(g)控制器。编号实施方式141包括编号实施方式1-140中的任一项，其中所述连续相包括疏水试剂。编号实施方式142包括编号实施方式1-141中的任一项，其中所述连续相包括油。编号实施方式143包括编号实施方式1-142中的任一项，其中所述连续相包括疏水氟化油。编号实施方式144包括编号实施方式1-143中的任一项，其中所述疏水氟化油包括选自以下的试剂：fc-3283、fc-40、fc-43、fc-70、3-乙氧基-1,1,1,2,3,4,4,5,5,6,6,6-十二氟-2-三氟甲基-己烷、2,2,3,3,4,4,4-七氟-1-丁醇、cf3cf2cf2ch2oh、全氟辛烷、全氟己烷、1,1,1-三氟辛烷和1,1,1,2,2-五氟癸烷。编号实施方式145包括编号实施方式1-144中的任一项，其中所述第一分散相和所述第二分散相中的至少一个包括亲水试剂。编号实施方式146包括编号实施方式1-145中的任一项，其中所述第一分散相和所述第二分散相中的至少一个包括水性试剂。编号实施方式147包括编号实施方式1-146中的任一项，其中所述第一分散相和所述第二分散相中的至少一个包括水。编号实施方式148包括编号实施方式1-147中的任一项，其中所述流动路径的表面包括聚合物涂层。编号实施方式149包括编号实施方式1-148中的任一项，其中所述流动路径的表面包括亲氟涂层。编号实施方式150包括编号实施方式1-149中的任一项，其中所述流动路径的表面包括氟聚合物涂层。编号实施方式151包括编号实施方式1-150中的任一项，其中所述氟聚合物包括选自以下的试剂：聚氟乙烯(pvf)、聚偏二氟乙烯(pvdf)、聚四氟乙烯(ptfe)、聚三氟氯乙烯(pctfe)、全氟烷氧基聚合物、氟化乙丙烯(fep)、聚乙烯四氟乙烯(etfe)、聚乙烯三氟氯乙烯(ectfe)、全氟弹性体、碳氟化合物、含氟弹性体、全氟聚醚(pfpe)、全氟磺酸(pfsa)和全氟聚氧杂环丁烷。编号实施方式152包括编号实施方式1-151中的任一项，包括表面活性剂。编号实施方式153包括编号实施方式1-152中的任一项，其中所述表面活性剂包括选自以下的试剂：碳氟化合物、碳氢化合物和硅氧烷。编号实施方式154包括编号实施方式1-153中的任一项，其中所述第一分散相和所述第二分散相中的至少一个的体积在约1皮升至约1毫升的范围内。编号实施方式155包括编号实施方式1-154中的任一项，其中所述流动路径包括在约0.001”至约0.5”的范围内的内部水力直径。编号实施方式156包括编号实施方式1-155中的任一项，其中所述系统包括核酸区段的多个拷贝。编号实施方式157包括编号实施方式1-156中的任一项，其中所述第一分散相包括至少一种底物，并且其中所述第二分散相包括至少一种试剂。编号实施方式158包括编号实施方式1-157中的任一项，其中所述第一分散相包括生物样品或第一药物前体。编号实施方式159包括编号实施方式1-158中的任一项，其中所述第二分散相包括裂解试剂或第二药物前体。编号实施方式160包括编号实施方式1-159中的任一项，其中所述第一分散相包括至少一种核酸分子，并且其中所述第二分散相包括核酸扩增试剂。编号实施方式161包括编号实施方式1-160中的任一项，其中所述核酸扩增试剂包括选自以下的试剂：引物、探针、共混物、dntp、缓冲剂和酶。编号实施方式162包括编号实施方式1-161中的任一项，其中所述探测器被配置用于测量荧光信号。编号实施方式163包括编号实施方式1-162中的任一项，其中所述聚结器包括外部能量源。编号实施方式164包括编号实施方式1-163中的任一项，其中所述外部能量源包括在至少两个电极之间的电场。编号实施方式165包括编号实施方式1-164中的任一项，其中在所述至少两个电极之间的电势在约100v至约25000v的范围内。编号实施方式166包括编号实施方式1-165中的任一项，其中所述外部能量源包括压力源和机械源中的至少一种。编号实施方式167包括编号实施方式1-166中的任一项，其中所述压力源为泵。编号实施方式168包括编号实施方式1-167中的任一项，其中所述反应器被配置用于引发化学反应。编号实施方式169包括编号实施方式1-168中的任一项，其中所述反应器与外部能量源连通。编号实施方式170包括编号实施方式1-169中的任一项，其中所述反应器包括至少一个热源。编号实施方式171包括编号实施方式1-170中的任一项，其中所述反应器包括多个热源。编号实施方式172包括编号实施方式1-171中的任一项，其中所述反应器包括第一热源和第二热源。编号实施方式173包括编号实施方式1-172中的任一项，其中所述第一热源保持在85℃至95℃的温度下。编号实施方式174包括编号实施方式1-173中的任一项，其中所述第一热源保持在约90℃的温度下。编号实施方式175包括编号实施方式1-174中的任一项，其中所述第二热源保持在55℃至70℃的温度下。编号实施方式176包括编号实施方式1-175中的任一项，其中所述流动路径与所述第一热源和所述第二热源中的至少一个热连通。编号实施方式177包括编号实施方式1-176中的任一项，其中所述流动路径的试剂反复穿过，与所述第一热源和所述第二热源连通。编号实施方式178包括编号实施方式1-177中的任一项，其中所述试剂经受多次反复。编号实施方式179包括编号实施方式1-178中的任一项，其中所述多次反复是至少30次反复。编号实施方式180包括编号实施方式1-179中的任一项，其中所述多次反复是至少60次反复。编号实施方式181包括编号实施方式1-180中的任一项，其中所述流动路径以8字形穿过所述第一热源和所述第二热源。编号实施方式182包括编号实施方式1-181中的任一项，其中所述反应器是热循环仪。编号实施方式183包括编号实施方式1-182中的任一项，其中所述控制器被配置用于指定将第一分散相与第二分散相混合的时长和时机中的至少一个。编号实施方式184包括编号实施方式1-183中的任一项，其中其中所述系统自动操作。