一种苯硼酸功能化壳聚糖修饰的氧化石墨烯纳米材料的制备方法与流程

本发明属于分析化学领域，具体而言，涉及一种苯硼酸功能化壳聚糖修饰的氧化石墨烯纳米材料的制备方法。

背景技术

糖基化是蛋白质最重要、最普遍的翻译后修饰之一。糖蛋白在细胞生长、分子识别、免疫反应、疾病发生发展等生物转化过程中都发挥着重要作用。因此，糖蛋白质的鉴定和发现在生物学研究和临床治疗领域具有重大意义。目前用于糖蛋白的富集方法主要有凝集素亲合法、肼化学法、亲水相互作用法、硼酸亲和法、体积排阻法等。

硼酸基团可与具有1、2-邻二羟基的化合物形成可逆的五元或六元环状酯。该方法操作简单，保持了糖链的完整性，与质谱兼容性好，因此硼酸功能化材料作为一种新型糖蛋白/肽段富集材料备受关注。但仅依靠单一硼酸亲和作用力的富集材料对糖蛋白的富集选择性较差。且以纳米颗粒和聚合物材料为基质制备的硼酸亲和材料，其比表面积较小，对糖蛋白的富集容量有限。

氧化石墨烯（grapheneoxide，go）是一种具有超大比表面积的碳材料，具有无残留硅醇基、生物相容性好、易于修饰改性，ph耐受范围宽等优点，在分析检测、高分子材料修饰和生物医药等领域都得到了广泛的关注。壳聚糖(chitosan,cs)又称脱乙酰甲壳素，具有生物兼容性好、毒性低、化学稳定性好、价格低廉等优点被广泛应用于材料的修饰和制备。

因此以氧化石墨烯为基质，比表面积大，可显著提高材料对糖蛋白的富集容量。对氧化石墨烯表面进行壳聚糖修饰和苯硼酸功能化，可在糖蛋白富集中同时提供硼酸亲和作用力、亲水相互作用力、氢键相互作用力、静电相互作用力等，是一种多作用力混合模式的富集材料，可显著提高材料对糖蛋白的富集选择性。

技术实现要素：

本发明的一个目的在于提供一种亲水性的苯硼酸功能化壳聚糖修饰的氧化石墨烯纳米材料的制备方法，具体步骤如下：

(1)将氧化石墨烯溶于水中，涡旋、超声混合均匀；(2)将壳寡糖溶于酸性有机溶剂中，涡旋、超声混合均匀；（3）氧化石墨烯水溶液和壳寡糖酸溶液混合均匀后，加入戊二醛溶液，得氧化石墨烯/壳寡糖混悬液；（4）将苯硼酸溶于有机溶剂中，再加入氧化石墨烯/壳寡糖混悬液，反应一定时间后，洗涤，即得苯硼酸功能化壳聚糖修饰的氧化石墨烯纳米材料。

在本发明的一个实施方案中，步骤1中氧化石墨烯水溶液的浓度为5-50mg/ml，优选为15mg/ml。

在本发明的另一个实施方案中，步骤2中壳聚糖在溶液中的浓度为5-100mg/ml，优选为20mg/ml。

在本发明的又一个实施方案中，步骤3中氧化石墨烯水溶液和壳聚糖的酸溶液按体积比0.5:1～1.5:1混合，优选为1：1。

在本发明的再一个实施方案中，步骤3中加入戊二醛溶液后，戊二醛在溶液中的最终质量百分比浓度为0.5%～5%，优选为1%。

在本发明的一个实施方案中，步骤3中反应温度优选为50℃，反应时间为2小时。

在本发明的一个实施方案中，步骤4中苯硼酸有机溶液与氧化石墨烯/壳寡糖混悬液混合后，苯硼酸在溶液中的终浓度为1～100mg/ml，优选为10mg/ml。

在本发明的一个实施方案中，步骤4中反应时间为12-48小时，优选为24小时。

发明的有益效果：以氧化石墨烯为基质，对其表面进行壳聚糖改性后，进一步增强了其亲水性和水溶性，可作为硼酸功能化的理想基质。本发明所制备的苯硼酸功能化壳聚糖修饰的氧化石墨烯纳米材料用于糖蛋白特异性富集可提供硼酸亲和作用力、亲水相互作用力、氢键相互作用力、静电相互作用力等作用力，是一种多作用力混合模式，与仅依靠单一作用力的硼酸功能化材料及亲水色谱材料相比，本发明所述的苯硼酸功能化壳聚糖修饰的氧化石墨烯纳米材料可显著提高对糖蛋白的富集选择性。此外，由于氧化石墨烯具有非常大的比表面积，与常规的微纳米材料相比，以其为材料基质，可显著提高本发明所述的苯硼酸功能化壳聚糖修饰的氧化石墨烯纳米材料对糖蛋白的富集容量。

附图说明

图1为亲水性苯硼酸功能化壳聚糖修饰的氧化石墨烯纳米材料的红外表征图，其中（a）为氧化石墨烯；（b）为氧化石墨烯/壳聚糖；（c）亲水性苯硼酸功能化壳聚糖修饰的氧化石墨烯纳米材料。

图2为多种糖蛋白与非糖蛋白混合物经亲水性苯硼酸功能化壳聚糖修饰的氧化石墨烯纳米材料富集前后的sds-page凝胶电泳图。其中1为marker；2为hrp:igg:rnaseb:bsa按照1:1:1:1比例混合后的样品富集前；3为hrp:igg:rnaseb:bsa按照1:1:1:1比例混合后的样品经亲水性苯硼酸功能化壳聚糖修饰的氧化石墨烯纳米材料富集后。

图3为人血清样品经亲水性苯硼酸功能化壳聚糖修饰的氧化石墨烯纳米材料富集前后的sds-page凝胶电泳图。其中1为marker；2为人血清样品富集前；3为人血清样品经亲水性苯硼酸功能化壳聚糖修饰的氧化石墨烯纳米材料富集后。

具体实施方式

下面将进一步的来举例说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。

实施例1

称取0.3g氧化石墨烯加入20ml去离子水，涡旋、超声混合均匀。称取0.4g壳聚糖加入20ml的乙酸溶液（2%,v/v）中，涡旋、超声混合均匀。将氧化石墨烯水溶液在机械搅拌的情况下与壳聚糖溶液按照体积比1:1混合。然后再加入4ml5%戊二醛溶液交联壳聚糖。在50℃水浴持续搅拌反应2小时。反应体系冷却至室温后，将得到的黑色产物依次用乙醇和去离子水洗涤，即得氧化石墨烯/壳寡糖混悬液。称取200mg苯硼酸，溶于10ml无水甲醇，涡旋、混合均匀，与10ml10mg/ml的氧化石墨烯/壳寡糖混悬液混合，室温下磁力搅拌持续反应24小时，将得到反应产物依次用乙醇和去离子水洗涤，即得亲水性苯硼酸功能化壳聚糖修饰的氧化石墨烯纳米材料。

实施例2

多种糖蛋白与非糖蛋白混合物中糖蛋白的富集

取1mg亲水性苯硼酸功能化壳聚糖修饰的氧化石墨烯纳米材料，加入200μl80%acn/20%h2o溶液，使其成为均匀的混悬液（5mg/ml）。分别取10μl1pmol/μl的hrp、igg、rnaseb、bsa蛋白溶液，涡旋混合，配制为样品溶液。取50μl5mg/ml的亲水性苯硼酸功能化壳聚糖修饰的氧化石墨烯纳米材料悬浮液，加入200μl80%acn/nh3h2o溶液（ph11），加入样品溶液，涡旋混合，室温下涡旋孵化1小时，10000r/min离心5分钟后，去除上清液；重复加液洗涤一次。再加入200μl的50%acn/1%fa溶液洗脱，室温下涡旋孵化1小时，10000r/min离心5分钟后，将所得的洗脱液冷冻干燥，然后用12%sds-page凝胶电泳进行分析。结果如图2所示。

图2结果表明，经亲水性苯硼酸功能化壳聚糖修饰的氧化石墨烯纳米材料富集后，非糖蛋白bsa的干扰得以有效去除，hrp、igg和rnaseb三种糖蛋白均得到有效保留，表明本发明所述的苯硼酸功能化壳聚糖修饰的氧化石墨烯纳米材料对糖蛋白具有较强的选择性。

实施例3

人血清样品中糖蛋白的富集

取1mg亲水性苯硼酸功能化壳聚糖修饰的氧化石墨烯纳米材料，加入200μl80%acn/20%h2o溶液，使其成为均匀的混悬液（5mg/ml）。取50μl5mg/ml的亲水性苯硼酸功能化壳聚糖修饰的氧化石墨烯纳米材料悬浮液与2μl的正常人血清混合，加入200μl80%acn/nh3h2o溶液（ph11），室温下涡旋孵化1小时，10000r/min离心5分钟后，去除上清液；重复加液洗涤一次。再加入200μl的50%acn/1%fa溶液洗脱，室温下涡旋孵化1小时，10000r/min离心5分钟后，将所得的洗脱液冷冻干燥，然后用12%sds-page凝胶电泳进行分析。结果如图3所示。

图3结果表明，本发明所述的苯硼酸功能化壳聚糖修饰的氧化石墨烯纳米材料可从痕量生物样品（2μl血清）中富集出糖蛋白（如trf和igg），表明本发明所述材料对糖蛋白具有较大的富集容量；且在富集痕量糖蛋白的同时，本发明所述材料可去除大量的非糖蛋白（如hsa），表明本发明所述材料对糖蛋白具有较高的富集选择性。