相关申请本申请，根据u.s.c.§119(e)的规定，要求下述在先申请的优先权：2017年4月24日提交的美国临时专利申请62/488,892，其在此通过引用纳入本文。政府资助本发明获得了由nationalinstitutesofhealth提供的项目编号为r01gm096767的政府资助。美国政府对于本发明拥有一定的权益。
背景技术：
：：毛细管区带电泳(capillaryzoneelectrophoresis,cze)，由于其灵敏度高以及与反相色谱法正交且成本低廉，越来越受到基于质谱的蛋白质组学的关注。虽然分离是基于cze中分析物的电荷/尺寸比，但毛细管的特性在电泳性能中起着重要作用。分析物非特异性吸附到毛细管内表面的硅烷醇基上会导致样品损失，以及峰拖尾和重现性差等问题。硅烷醇基团产生的高电渗流(eof)导致相对较短的分离窗口，这限制了在蛋白质组学分析过程中可以产生的串联质谱的数量，从而限制了肽鉴定的数量。针对这些问题，已经开发有不同的毛细管涂层。目前被最广泛使用的涂覆方法是基于自由基聚合反应。在该方法中，通过使用双功能化合物(例如γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷)对熔融毛细管的内壁进行预处理，其中一个基团与毛细管内壁上的硅烷醇基团发生特异性反应，而另一个基团与参与聚合过程的单体发生反应。然后，将经过预处理的毛细管充满经过脱气的聚合混合物，该混合物通常由丙烯酰胺、n,n,n’,n’-四甲基乙二胺和过硫酸钾组成。该过程形成非交联聚丙烯酰胺层，通常称为线性聚丙烯酰胺(linearpolyacrylamide，lpa)。这种方法有几个缺点。自由基清除剂可能以痕量水平存在，从而导致涂层特性无法再现。此外，丙烯酰胺单体不仅会与毛细管内壁上的官能团反应，还会与溶液中的其他丙烯酰胺单体反应，而溶液中形成的聚合物会堵塞毛细管，导致涂覆工艺失败。而且，膜厚度不可预测。为了克服这些问题，huang及其同事(anal.chem.,1998,70,4023)开发了一种表面受限的原子转移自由基聚合(surface-confinedatomtransferradicalpolymerization,scatrp)方法，将线性和交联的聚合物薄膜共价键合到二氧化硅上。红外光谱显示膜的生长是可控的，原子力显微镜显示制备了光滑的膜。使用scatrp涂层毛细管对强碱性蛋白质进行cze可以提供聚丙烯酰胺所期望的高效率。然而，atrp受过渡金属催化的活化和失活平衡的支配，传统的atrp系统需要高催化剂浓度才能在整个聚合过程中保持活性。聚合反应后难以除去过渡金属离子。聚合物中金属催化剂残留量的存在经常引起生物医学应用的关注，atrp吸附联吡啶会在低ph的cze过程中导致阳极eof。相反，可逆的加成-断裂链转移(raft)聚合可避免使用金属催化剂，并且可耐受多种反应条件和功能。ali和cheong(j.sep.sci.,2015,38,1763)报告了一种通过raft聚合将n-苯基丙烯酰胺-苯乙烯共聚物固定在毛细管内表面上的方法，用于毛细管电色谱(capillaryelectrochromatograpy,cec)。在二氯化二丁基锡作为催化剂存在下，通过异氰酸酯-羟基反应，将具有末端卤素(4-氯甲基苯基异氰酸酯)或4-(三氟甲氧基)苯基异氰酸酯的配体结合至预处理的二氧化硅毛细管的内表面。将引发剂(二乙基二硫代氨基甲酸钠)与结合的配体进行连接，然后进行原位聚合。所得毛细管在紫外检测下对cec中的衍生化糖异构体和细胞色素c的胰蛋白酶消化具有良好的分离性能。制备的嵌段共聚物的结构不清楚，因为所有单体都在raft聚合反应之前加入到聚合混合物中。另外，没有证明所得聚合物的活性特性。此外，该反应在对环境不利的有机溶剂(甲苯或对二甲苯)中进行。最后，没有对raft聚合的涂层色谱柱在cze中的蛋白质组学应用进行评估。存在的问题是聚合物涂覆的毛细管通过cze分离蛋白质或蛋白质消化物的操作性能有待改进。因此，需要有能够满足蛋白质组学分析中分离物质需求的低eof的涂层，以及带电(高eof)涂层，以使极端碱性和酸性分析物的非特异性吸附最小化并且提高产率。发明概述本文中，我们描述了一种基于表面受限的水性可逆加成-分裂链转移(scaraft)聚合反应的环保涂覆方法，用于将聚合物共价键合到毛细管内表面。为了说明scaraft方法适用于各种乙烯基单体，制备了中性和带正电的涂料。此外，通过制备嵌段共聚物涂料来确认通过scaraft法制备的涂料的活性特性，其中依次制备中性涂料和带正电涂料。通过测量eof并通过分析胰蛋白酶消化物和带有cze的蛋白质混合物来评估带涂层的毛细管。因此，本公开提供了一种聚合物涂覆的分离毛细管，其包括：a)熔融石英毛细管；b)涂层，其包含共价键合到所述熔融石英毛细管内表面的链转移部分；以及c)与所述链转移部分共价键合的取代聚乙烯聚合物，其中所述聚合物的聚乙烯单元被–c(＝o)g取代，其中g为nr2或or；r为h,(c1-c6)烷基或(c1-c6)烷基-n(ra)3x；每个ra独立地为h,(c1-c6)烷基或芳基；并且x是反离子；其中，所述聚合物涂覆的分离毛细管用于毛细管区电泳的电渗流为约0.1x10-6cm2v-1s-1至约10x10-4cm2v-1s-1，并且涂层不受金属和自由基清除剂的污染。本公开提供了一种涂覆的分离毛细管，其中涂层包括式i或式ii的聚合物：其中j为甲氧基，乙氧基或卤素；x为卤素；e为h，芳基，烷基，氰基；n为0至10,000；以及m为0到10,000，其中n和m不能都为0。另外，本公开提供了一种制造权利要求1所述的聚合物涂覆的分离毛细管的方法，包括：a)使所述熔融石英毛细管的内表面与链转移剂接触，以提供所述熔融石英毛细管的共价改性的内表面；b)使所述改性的内表面与自由基引发剂、取代的乙烯基单体和任选的第二单体的水性混合物接触；以及c)通过加热或照射混合物来引发活性自由基聚合；从而制造所述聚合物涂覆的分离毛细管。本发明提供了式i和ia以及式ii和iia的新型聚合物涂料，用于合成式i和ia以及式ii和iia的聚合物涂料的中间体，以及制备式i和ia以及式ii和iia的聚合物涂料的方法。本发明还提供了能够用来合成其他有用聚合物涂层的中间体的式i和ia以及式ii和iia的聚合物涂料。附图简要说明下文所述的附图属于说明书的一部分并且是用来对本发明的一些实施方式或不同方面作进一步的描述。在一些实例中，本发明的实施方式可以通过参照附图并结合本文提供的详细描述得到更好地理解。这些描述和附图可以突出某些具体的实施例或本发明的某些方面。然而，本领域技术人员应当理解这些部分的实施例或方面也可用于结合本发明的其他实施例或方面。图1：通过scaraft制备涂层毛细管的示意图。图2：大肠杆菌胰蛋白酶消化物的cze和uplc分析之间的肽段(a)和蛋白质组(b)重叠。图3：hela消化液的cze-esi-ms/ms分析的代表性电泳图。实验条件：qexactivehf质谱仪；50μm内径×150μm外径×100cm长的lpa涂层毛细管；25nghela消化液；1mhac分离缓冲液；21.6kv分离电压；以及1.6kv喷雾电压。图4：从hela消化物中鉴定出的肽的pi分布。实验条件与图3相同。图5：使用带有直接正电荷涂层(a)和嵌段共聚物涂层(b)的毛细管分离完整蛋白。峰：(1)碳酸酐酶，(2)肌红蛋白，(3)核糖核酸酶a，(4)溶菌酶。实验条件：50μm内径×150μm外径×62cm长；1mhac背景电解质；1.6kv喷雾电压，-19.6kv分离电压。图6：大肠杆菌消化物的uplc-esi-ms/ms分析的代表性色谱图。实验条件：ltqorbitrapvelos质谱仪，商用c18反相柱(waters,100μm×100mm,1.7μm颗粒，beh130c18)，50ng大肠杆菌消化液，缓冲液a(水中0.1％fa)和缓冲液b(acn中0.1％fa)用作流动相进行梯度分离：0-10min,2％b；10-11min,2-8％b；11-71min,8-30％b；71-72min,30-80％b；72-77min,80％b；77-78min,80-2％b；78-90min,2％b。图7：用于检测μeof的检测器迹线。(a)第一涂覆的毛细管。(b)第二涂覆的毛细管。(c)第三涂覆的毛细管。实验条件：bge，1mhac，毛细管：50μm内径×150μm外径，l＝100cm,tinj＝2s,ttr＝40s,tmigr＝50min。峰是苯甲醇。1.6kv喷雾电压。26.6kv分离电压。图8：代表性电泳图，用于测试lpa涂层毛细管的长期稳定性和残留。实验条件：ltqxl质谱仪；50μm内径×150μm外径×100cm长的lpa涂层毛细管；在30mmnh4hco3中消化25nl2mg/mlxenopuslaevis消化液；为了进行空白分析，注入了25nl的1mhac；1mhac分离缓冲液；26.6kv分离电压；以及1.6kv喷雾电压。图9：从hela消化物中鉴定出的肽的迁移时间的累积分布。实验条件：qexactivehf质谱仪；50μm内径×150μm外径×100cm长的lpa涂层毛细管；25nghela消化液；1mhac分离缓冲液；21.6kv分离电压；以及1.6kv喷雾电压。图10：具有各种pi的肽的迁移时间。实验条件与图8相同。图11：鉴定出的磷酸肽的迁移时间分布。实验条件与图8相同。图12：磷酸肽的pi分布。实验条件与图8相同。详细说明开发了一种表面受限的水性可逆加成-分裂链转移(scaraft)聚合方法，以涂覆用于毛细管区带电泳(cze)的毛细管。scaraft聚合主要发生在毛细管的内表面而不是溶液中，这大大提高了涂层的均匀性。用该涂层处理的毛细管产生的电渗迁移率为2.8±0.2×10-6cm2·v-1·s-1(n＝3)，比商业线性聚丙烯酰胺(lpa)涂覆的毛细管的迁移率大约低一个数量级。使用cze对涂覆的毛细管进行了自下而上的蛋白质组学分析。极低的电渗迁移率导致200min的分离并改善了单次分析。使用与qexactivehf质谱仪结合的scaraft-丙烯酰胺毛细管进行单次分析，从50ng的大肠杆菌消化物中平均鉴定出977个蛋白质组和5605个独特的肽，从25ng的hela消化物中鉴定出2158个蛋白质组和10005个肽。涂层是稳定的。使用单个毛细管进行超过200h(8.4天)的连续操作。对于六种离子产生的选定离子电泳图(sie)，迁移时间的rsd在2和3％之间。这些sie的理论塔板数中位数在240000至600000之间。通过简单地改变聚合混合物中的官能乙烯基单体来制备各种类型的涂料。制备了使用直接附着和形成嵌段共聚物的带正电荷的涂层，并证明了其可用于完整蛋白混合物的分离。定义下面的定义是用来对说明书和权利要求书提供清晰和一致的理解。本文所采用的术语具有下述的含义。本说明书中所采用的其他术语和短语具有本领域技术人员所能理解的普通含义。这种普通含义可通过参考技术辞典获得，例如hawley’scondensedchemicaldictionary14thedition,byr.j.lewis,johnwiley&sons,newyork,n.y.,2001。本说明书中提及的“一种实施方式”("oneembodiment")、“实施方式”("anembodiment")等表明所描述的实施方式可包含特定的方面、特征、结构、部分或特点，但并不是每个实施方式都必须包含这些特定的方面、特征、结构、部分或特点。此外，这些短语可能，但并不一定，适用于在本说明书其它部分提及的相同的实施方式。此外，当特定的方面、特征、结构、部分或特点是结合某种实施方式进行描述的，本领域技术人员应当能够知道将这些特定的方面、特征、结构、部分或特点应用到或关联到其它的实施方式，无论是否明确地表述出来。单数形式的冠词"a,""an"和"the"包括复数含义，除非上下文存在明确的不同阐述。因此，例如，“化合物”可以是指包括多个这样的化合物，从而化合物x包括多个的化合物x。进一步值得注意的是，权利要求书可能被撰写为排除任何可选元素。因此，本声明旨在作为排除性术语使用的前置基础，例如"单独(solely)"、"仅仅(only)"等术语，与本文所描述的任何元素相关联和/或作为对权利要求所述要素的限定或者用作“负面”限制。术语“和/或”("and/or")是指相关项目的任何一项、任何组合，或它们的全部。短语“一个或多个”("oneormore")和“至少一个”("atleastone")是本领域技术人员都能容易理解的，尤其是根据上下文理解。例如，这些短语可以是指一、二、三、四、五、六、十、一百，或大约比已经列举的下限高出10、100或1000倍的任何上限值。例如，苯环上的一个或多个取代基是指1至5个或1至4个，如果苯环被取代的话。本领域技术人员应当能够理解，包括表示成分含量、诸如分子量的性质、反应条件等等的任何数目都可以是近似的，并且在各种情下都能够采用术语“大约”进行修饰。取决与本领据技术人员通过本文所述方法所期望获得的性质，这些值是可以有变化的。还应当理解，这些值，由于测试中出现的标准偏差必然会导致其内在的可变化性。当数值通过使用先行词“about”被表示为近似时，应当理解，没有所述先行词“about”修饰的特定值也构成定义一部分。术语“大约”和“近似”可交互使用。这两个术语都可以指定值的±5％,±10％,±20％,或±25％的变化。例如，“大约50％”在一些实施方式中可以具有45至55％的变化，或者由特定声明限定。对于整数范围，术语“大约”可以包括在所涉及范围的每个端点大于和/或小于所列数的一个或两个整数。除非在本文中另外指出，术语“大约”和“大致”是用来包括接近所指范围的值(例如重量百分数),其就个别成分、组合或实施方式的功能而言是等同的。术语“大约”和“近似”也可以用来修饰如本段中所讨论的所指范围的端点。本领域技术人员应当能够理解，出于任何各种目的，尤其是就提供文字描述来说，本文提供的任何范围还包括所有可能的子范围和这些子范围的组合，以及构成所述范围的单独值，尤其是整数值。因此应当理解，两个特定单位之间的每一个单位也都被披露。例如，如果10到15被披露，那么11、12、13和14也分别被单独或作为范围的一部分而披露。所引述范围(例如重量百分比或碳基团)包括各个特定的数值、整数、小数或所述范围内的特性。应当易于理解，所列举的任何范围能够充分描述并能够使的相同的范围被分解为相等的二等份、三等分、四等分、五等分或十等分。作为非限制性例子，本文所述的每个范围都可容易地分解为下三分之一，中三分之一和上三分之一等等。本领域技术人员也应当能够理解，诸于“高达”、“至少”、“高于”、“低于”、“多于”、“或以上”或类似的术语包含所列举的数字，并且这种术语还指所述范围可随后分成上文述及的子范围。同样地，本文所列的任何比率也包含落在较宽比率之内的子比率。因此，自由基、取代基和范围的具体数值只是用来进行说明；其不排除自由基和取代基的其它指定数值或其它指定范围的数值。另外还应当理解，每个范围的端点与其他端点之间既有关联意义又是相互独立的。本领域技术人员还应当能够容易理解，当单元被按照通常的方式例如在马库什群组中被组合起来时，本发明不仅包括所列单元组合构成的整体，还包括所述群组单独的每个单元以及所述基本群组的任何可能的亚群组。另外，对于所有的目的，本发明不仅包括基本群组，还包括基本群组去掉一个或多个单元的群组。可见，本发明可以包括明确排除所引述群组的任何一个或多个单元。因此，有关约束条件可以附加于任何公开的范畴或实施方式，其中任何一个或多个单元、种类或实施方式，可从所述范畴或实施方式中排除出来，例如，用于明示负面限定的场合。术语“接触”("contacting")是指触及、接触，或者邻接或紧密地靠近。例如，在溶液中，在反应混合物中，引起化学反应或物理变化。本文使用的术语“基本上”是一个宽泛的术语，并且以其通常的含义使用，包括但不限于，大体上但不一定完全是指定的。例如，该术语可以指可能并非所指完全数值100％的值。所述完全数值可以小于约1％，约2％，约3％，约4％，约5％，约6％，约7％，约8％，约9％，约10％，约15％，或约20％。如本文所用，术语“取代的(substituted)”或“取代基(substituent)”用来表示，在用“取代的”(或“取代基”)表示的基团上的一个或多个(例如，在一些实施方式中为1-20，在其他实施方式中为1-10，在一些实施方式中为1、2、3、4或5，在一些实施方式中为1、2或3，以及在其他实施方式中为1或2)氢被选自指定的基团或本领域技术人员已知的合适基团所取代，条件是不超出所示原子的正常价，并且取代产生稳定的化合物。合适的所述指定的基团包括例如烷基，烯基，炔基，烷氧基，卤素，卤代烷基，羟基，羟烷基，芳基，杂芳基，杂环，环烷基，烷酰基，烷氧基羰基，氨基，烷基氨基，二烷基氨基，三氟甲硫基，二氟甲基，酰基氨基，硝基，三氟甲基，三氟甲氧基，羧基，羧基烷基，酮基，硫代，烷硫基，烷基亚磺酰基，烷基磺酰基和氰基。另外，可与取代的碳(或其他)原子键合的取代基的非限制性例子包括f,cl,br,i,or',oc(o)n(r')2,cn,cf3,ocf3,r',o,s,c(o),s(o),亚甲二氧基，乙二氧基，n(r')2,sr',sor',so2r',so2n(r')2,so3r',c(o)r',c(o)c(o)r',c(o)ch2c(o)r',c(s)r',c(o)or',oc(o)r',c(o)n(r')2,oc(o)n(r')2,c(s)n(r')2,(ch2)0-2nhc(o)r',n(r')n(r')c(o)r',n(r')n(r')c(o)or',n(r')n(r')con(r')2,n(r')so2r',n(r')so2n(r')2,n(r')c(o)or',n(r')c(o)r',n(r')c(s)r',n(r')c(o)n(r')2,n(r')c(s)n(r')2,n(cor')cor',n(or')r',c(＝nh)n(r')2,c(o)n(or')r',或c(＝nor')r'，其中r'可以是氢或碳基部分，并且其中碳基部分本身可以被进一步取代。当取代基是单价的之情形，例如f或cl，它与被单键取代的原子键合。当取代基是大于一价的，如二价取的o时，它可以通过一个以上的键与它所取代的原子键合，即二价的取代基通过双键键合。例如，被o取代的c形成羰基，c＝o，其中c和o是双键的。或者，二价取代基如o,s,c(o),s(o)或s(o)2可以通过两个单键连接至两个不同的碳原子。例如，o，为二价取代基，可以与两个相邻的碳原子中的每一个键合以提供一个环氧基，或者o可以在相邻或不相邻的碳原子之间形成一个桥接醚基，例如，将1,4桥接-环己基的碳原子形成[2.2.1]-氧杂双环系统。此外，任何取代基都可以通过链接，例如(ch2)n或(cr'2)n(其中n为1、2、3或更大，并且每个r'独立地选择)与碳或其他原子键合。术语“烷基”是指直链或支链烷基，例如具有1-20个碳原子而通常为1-12,1-10,1-8,1-6或1-4个碳原子。如本文所用，术语“烷基”还涵盖如下定义的“环烷基”。具体实例包括但不限于甲基，乙基，1-丙基，2-丙基(异丙基)，1-丁基，2-甲基-1-丙基(异丁基)，2-丁基(仲丁基)，2-甲基-2-丙基(叔丁基)，1-戊基，2-戊基，3-戊基，2-甲基-2-丁基，3-甲基-2-丁基，3-甲基-1-丁基，2-甲基-1-丁基，1-己基，2-己基，3-己基，2-甲基-2-戊基，3-甲基-2-戊基，4-甲基-2-戊基，3-甲基-3-戊基，2-甲基-3-戊基，2，3-二甲基-2-丁基，3，3-二甲基-2-丁基，己基，辛基，癸基，十二烷基等。所述烷基可以是未取代或可选择被取代的，例如由下述取代基所取代。所述烷基也可以是可选择地部分或完全不饱和的。因此，在某些实施方式中，烷基可选择地含有烯基或炔基。所述烷基可以是如上列举的单价烃基，或者可以是二价烃基(即亚烷基)，取决于其用途的上下文描述。术语“芳基”是指从母体芳环体系的单个碳原子去除至少一个氢原子而得到的芳烃基。基团连接位点可以是在芳环母体的饱和或不饱和碳原子上。所述芳基可具有6至30个碳原子，例如约6-10个碳原子。在其他实施方式中，所述芳基可具有6至60个碳原子，6至120个碳原子或6至240个碳原子。所述芳基可以具有单环(例如苯基)或多个缩合(稠合)环，其中至少一个环是芳环(例如萘基、二氢菲基、芴基或蒽基)。典型的芳基包括但不限于，衍生于苯、萘、蒽、联苯等的基团。所述芳基可以是未取代的或者可选择性被取代的，如针对烷基所所描述的。本文所述化合物或聚合物中所选择的取代基能够以递归的方式出现。由此，“递归取代基”是指一个取代基可以引用另一个的自己本身。由于这些取代基的递归性质，理论上讲，在任何给定的权利要求中会有大量情况出现。药物化学和有机化学领域技术人员应该理解，这样取代基的总数是合理地受限于预期化合物的所需特性。此类性质包括，例如但不限于，物理性质，例如分子量、溶解度或logp，应用性质，例如对预期目标的活性，以及实用性质，例如合成容易程度。递归取代基是本发明的一个预期方面。有机化学领域的普通技术人员应该理解这种取代基的多功能性。就本发明的权利要求中存在递归取代基的程度而言，聚合物实例的重复单元中的总数可以为例如约1-50，约1-40，约1-30，约1-20，大约1-10或大约1-5。本文所用的术语“重复单元(repeatunit)”，“重复的单元(repeatingunit)”或“嵌段(block)”是指重复的聚合物部分。所述重复单元可以包括一个或多个重复单元，标记为例如重复单元a，重复单元b，重复单元c等。例如，重复单元a-c可以共价结合在一起以形成组合的重复单元。单体或一种或多种不同单体的组合可以组合形成聚合物或共聚物的(组合)重复单元。本文公开的共聚物的术语“分子量(molecularweight)”是指平均分子量(mn)。相应的重均分子量(mw)可以通过本领域技术人员已知的方法(例如，通过计算)从其他公开的参数中确定。本文公开的共聚物可包含无规“r”或嵌段“b”共聚物。在各种实施方式中，聚合物或共聚物的端部(即起端或末端)是低分子量部分(例如低于500da)，例如h,oh,ooh,ch2oh,cn,nh2；或烃，例如烷基(例如，在起端或末端的丁基或2-氰基丙-2-基部分)，烯烃或炔烃，或在共聚物中的第一和/或最后重复单元进行消除反应后形成的部分，除非另有说明。发明的实施方式本公开提供了聚合物涂覆的分离毛细管的各种实施方式，所述聚合物涂覆的分离毛细管包括：a)熔融石英毛细管；b)涂层，其包含共价键合到所述熔融石英毛细管内表面的链转移部分；以及c)与所述链转移部分共价键合的取代聚乙烯聚合物，其中所述聚合物的聚乙烯单元被–c(＝o)g取代，其中g为nr2或or；r为h,(c1-c6)烷基或(c1-c6)烷基-n(ra)3x；每个ra独立地为h,(c1-c6)烷基或芳基；并且x是反离子；其中，所述聚合物涂覆的分离毛细管用于毛细管区电泳的电渗流为约0.1x10-6cm2v-1s-1至约10x10-4cm2v-1s-1，并且涂层不受金属和自由基清除剂的污染。在另外的实施方式中，权利要求1的分离毛细管，其中电渗流(eof)为约1x10-6cm2v-1s-1至约10x10-6cm2v-1s-1。在其他实施方式中，eof为0.1x10-7cm2v-1s-1至约10x10-7cm2v-1s-1，0.1x10-6cm2v-1s-1至约10x10-6cm2v-1s-1，0.1x10-5cm2v-1s-1至约10x10-5cm2v-1s-1，0.1x10-4cm2v-1s-1至约10x10-4cm2v-1s-1。在其他实施方式中，–c(＝o)g是–c(＝o)nh2。在其他实施方式中，–c(＝o)g是–c(＝o)och2n(ch3)3x。在其他实施方式中，所述聚合物包括–c(＝o)nh2取代的乙烯单元和–c(＝o)och2n(ch3)3取代的乙烯单元的无规聚合物或嵌段共聚物。在另外的实施方式中，所述分离毛细管包括约200,000至约800,000理论板。在其他实施方式中，理论板的数量是约200,000至约300,000，约300,000至约400,000，约400,000至约500,000，约500,000至约600,000，约700,000至约800,000，约800,000至约1,000,000。在各种实施方式中，所述链转移部分包含–sij2(ch2)3sc(＝s)s–，其中每个j独立地为h,g或卤素，或其他链转移剂，例如但不限于包含--sc(＝s)s–的链转移剂。在其他实施方式中，所述分离毛细管包含约200,000至约800,000理论板，电渗流为约1x10-6cm2v-1s-1至约10x10-6cm2v-1s-1，并且–c(＝o)g为–c(＝o)nr2。在其他实施方式中，r为h。本公开提供了聚合物涂覆的分离毛细管的各种实施方式，其中涂层包含式i或式ii的聚合物：其中j为甲氧基，乙氧基或卤素；x为卤素；e为h，芳基，烷基，氰基；n为0至10,000；以及m为0到10,000，其中n和m不能都为0。在各种实施方式中，式i或式ii的符号b表示当n和m各自大于1时，式i或式ii为嵌段共聚物。在其他实施方式中，n为0至1000，1至500，或500至2000。在另外的实施方式中，m为0至1000，1至500，或500至2000。本公开还提供了一种制造上述聚合物涂覆的分离毛细管的方法，该方法包括：a)使所述熔融石英毛细管的内表面与链转移剂接触，以提供所述熔融石英毛细管的共价改性的内表面；b)使所述改性的内表面与自由基引发剂、取代的乙烯基单体和任选的第二单体的水性混合物接触；以及c)通过加热或照射混合物来引发活性自由基聚合；从而制造所述聚合物涂覆的分离毛细管。在另外的实施方式中，水性混合物包含缓冲剂。在其他实施方式中，自由基引发剂的浓度为约10-5摩尔至约10-4摩尔。在其他实施方式中，自由基引发剂的浓度为约10-6摩尔至约10-5摩尔，约10-5摩尔至约10-3摩尔，或约10-4摩尔至约10-3摩尔。在其他实施方式中，取代的乙烯基单体的浓度为约0.1摩尔至约2摩尔。在各种实施方式中，聚合物涂覆的分离毛细管具有中性电荷。在另外的实施方式中，聚合物涂覆的分离毛细管带正电。在其他实施方式中，聚合物涂覆的分离毛细管带负电。在一些实施方式中，分离毛细管包含取代的乙烯基单体和第二单体。在其他实施方式中，第二单体也是取代的乙烯基单体。在其他实施方式中，自由基引发剂包括卤素分子，偶氮化合物，有机过氧化物，或无机过氧化物。在各种另外的实施方式中，聚合物涂覆的分离毛细管在其内表面上涂覆有嵌段共聚物。在其他实施方式中，取代的乙烯基单体被–c(＝o)g取代，并且任选的第二单体被–c(＝o)g取代。在另外的实施方式中，取代的乙烯基单体或任选的第二单体被上述取代基取代并且可以具有一个以上的取代基。在上述方法的其他各种实施方式中，通过用第二单体重复步骤b)和c)，重新开始聚合物涂覆的分离毛细管中的活性自由基聚合。在另一些实施方式中，通过加热混合物引发活性自由基聚合在刚好高于室温的加热温度下进行。在其他实施方式中，加热温度为约0℃至约400℃，约20℃至约80℃，约50℃至约100℃，约50℃至约150℃，约80℃至约200℃，或约120℃至约300℃。在另一些实施方式中，通过辐射混合物引发活性自由基聚合是在电磁光谱的可见光区域的波长下进行的。本文还提供了聚合物涂覆的分离毛细管的不同实施方式，其包括式ia或式iia的聚合物涂覆的内表面：其中x为卤素；n为0至10,000；以及m为0到10,000，其中n和m不能都为0。在各种实施方式中，式ia或式iia的符号b表示当n和m均大于1时，式ia或式iia为嵌段共聚物。在其他各种实施方式中，聚合物涂覆的分离毛细管通过毛细管区带电泳(cze)对至少5,000种可鉴定的肽进行可再现的分离，持续至少100小时。在其他实施方式中，涂覆有聚合物的分离毛细管通过cze进行约5,000至约50,000，约7,500至约15,000，约10,000至约20,000，或约15,000至约30,000的可识别肽的可再现分离。在其他实施方式中，涂覆有聚合物的分离毛细管可再现地进行或稳定约100小时至约100,000小时的连续操作，或约200小时至约500小时，或约1000小时至约10,000小时的连续操作。本文提供了诸如体积、质量、百分比、比率等变量的范围、限度和偏差值。本领域普通技术人员应当理解，诸如“值1”至“2”是指连续的数值范围，包括整数和分数。例如，1到10表示1、2、3、4、5，…9、10。它还表示1.0、1.1、1.2、1.3，…9.8、9.9、10.0，也表示1.01、1.02、1.03，依此类推。如果所公开的变量是小于“值10”的数字，则这意味着包括小于值10的整数和分数的连续范围，如上所述。类似地，如果公开的变量是大于“值10”的数字，则表示包含大于值10的整数和分数的连续范围。这些范围可以由术语“约”修饰，其含义已在上面描述。结果和讨论采用表面受限的水性可逆加成-分裂转移(scarft)聚合法制备带涂层的毛细管采用scaraft方法制备lpa涂层毛细管的示意图如图1所示。熔融石英毛细管(50μm内径×150μm外径)通过用0.1mnaoh洗涤2h进行预处理，用水冲洗直至流出。达到ph～7.0，用0.1mhcl冲洗12h，然后再次用水冲洗直至流出液达到ph～7.0。毛细管最终在室温下用氮气流干燥过夜。然后，将毛细管充满meoh(v/v)中的50％氰基甲基[3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基]三硫代碳酸酯溶液，并在45℃的水浴中温育12小时。然后用meoh冲洗毛细管，以冲洗掉残留的试剂，并用氮气流干燥。此时，毛细管的内壁被氰基甲基[3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基]三硫代碳酸酯层改性，后者是链转移剂，用于随后在scaraft聚合反应中将聚合物附着到壁上。为了涂覆毛细管，使用了报告的改进方法(macromol.rapidcommun.2011,32,958)。通过将丙烯酰胺(0.56m)和4,4-偶氮双(4-氰基戊酸)(5.42×10-4m)在乙酸盐缓冲液(ph5.2、0.27m乙酸和0.73m乙酸钠)中混合来制备可预聚合的混合物，在室温下并且在氮气下搅拌约10分钟以形成均匀溶液。然后将混合物引入预处理的毛细管中，并在60℃下孵育不同的反应时间。涂覆的毛细管用meoh冲洗，以除去毛细管中的残留物，并在进行cze分析之前，用背景电解质进行调理。浓度的影响单体浓度、引发剂浓度、反应时间影响涂覆过程。通常，增加单体和引发剂的浓度会增加涂层厚度并减少所需的反应时间。为了进行优化实验，我们将引发剂浓度保持在2.17×10-5m，反应时间保持在21h，并制备了具有不同单体浓度的涂层毛细管。当单体浓度从0.39m增加到0.56m时，eof从2.4×10-5cm2·v-1·s-1降至8.62×10-6cm2·v-1·s-1(n＝2,rsd＝0.9％)。使用由0.39m单体制备的带涂层毛细管，从50ng大肠杆菌消化物中鉴定出390个蛋白质组和1,923个肽。不同的是，使用由0.56m单体制备的带涂层毛细管，从50ng大肠杆菌消化物中鉴定出525个蛋白质组和2,742个肽。鉴定的蛋白质基团和肽列于实施例中。单体浓度的增加导致单体之间自由基聚合的增加，这可能导致毛细管堵塞。因此，在后续研究中使用的单体浓度为0.56m。还研究了引发剂浓度对涂层的影响。制备具有各种引发剂浓度的毛细管，同时保持单体浓度(0.56m)不变。当引发剂浓度小于2.17×10-5m时，需要21h以上才能完成涂层。引发剂浓度远高于2.17×10-3m，导致溶液中单体之间发生自由基聚合反应，毛细管在21h后被堵塞。根据实验结果，我们工作中使用的引发剂浓度为5.42×10-4m。我们还研究了反应时间对涂覆过程的影响。毛细管涂覆有0.56m丙烯酰胺和5.42×10-4m引发剂。当聚合时间从3h(6.1×10-6cm2·v-1·s-1,n＝2,rsd＝7％)增加到7h(4.7×10-6cm2·v-1·s-1,n＝2,rsd＝13％)时，eof基本不变。使用3小时反应制备的带涂层毛细管，从50ng大肠杆菌消化物中鉴定出738个蛋白质组和4,086个肽。不同的是，使用经过7小时反应制备的带涂层毛细管，从50ng大肠杆菌消化物中鉴定出816个蛋白基团和4,084个肽。实施例中列出了鉴定的蛋白质基团和肽信息。使用orbitrapvelos质谱仪并使用scaraft涂层毛细管对50ng大肠杆菌消化物进行自下而上的蛋白质组学分析，结果要好于我们先前的报告，使用100ng样品上样量和相同质谱仪的商用lpa涂层毛细管。与uplc-esi-ms/ms方法比较使用带有大肠杆菌消化物的ltqorbitrapvelos质谱仪，将带有scarft涂层毛细管的cze-esi-ms/ms与uplc-esi-ms/ms进行比较。将大肠杆菌消化物上样到反相c18分析柱上，然后进行90分钟的梯度uplc-esi-ms/ms分析，见图6。通过uplc和cze方法鉴定的肽和蛋白质组的维恩图显示在图2中。使用uplc-esi-ms/ms方法，用50ng大肠杆菌消化物鉴定了880个蛋白质组和4,727个独特的肽。如上所述，在相似的实验条件下，使用带有scarft涂层毛细管的cze-esi-ms/ms，从50ng大肠杆菌消化物中鉴定出816个蛋白质组和4084个肽。实施例中列出了鉴定的蛋白质基团和肽信息。在uplc方法中鉴定的76％的蛋白质基团和52％的肽也通过cze方法鉴定。然而，通过cze方法鉴定的蛋白质组的18％和肽的40％未被uplc方法鉴定。结果表明cze和uplc提供了互补的肽水平鉴定。可重复性scaraft方法用于制备两个lpa涂层的毛细管。这些毛细管的电渗迁移率的平均和标准偏差为2.8±0.3×10-6cm2·v-1·s-1(n＝2)，比商用lpa涂覆的毛细管(2.5×10-5cm2·v-1·s-1)低近一个数量级。用于测定μeof的检测器迹线如图7所示。通过将其中两个毛细管与qexactivehf质谱仪一起用于单次自下而上的蛋白质组学，评估了蛋白质组学分析的可重复性。用第一毛细管从50ng大肠杆菌消化物中鉴定出990个蛋白质组和5,514个肽，用第二毛细管鉴定了964个蛋白质组和5,703个肽。这些鉴定数量明显好于使用单次cze分析报告的结果，该分析使用商用lpa涂覆的毛细管和orbitrapfusion质谱仪(956个蛋白质组和4,741个肽段)来自约250ng大肠杆菌消化物。鉴定的蛋白质基团和肽列于实施例中。长期稳定性试验每100分钟通过压力注入爪蟾(xenopuslaevis)消化物，持续分离201.7小时(8.4天)，以产生爪蟾消化物的121个连续分离。代表性的峰峰电泳图如图8所示。选定的离子电泳图是在六个任意选择的m/z值(m/z＝542.3,566.1,577.6,652.6,703.6,和722.2)下生成的，平均迁移时间为27至89分钟。所选的离子电泳图使用非线性最小二乘程序与高斯函数拟合，以估计迁移时间和峰宽。迁移时间的相对标准偏差为2.0％至3.0％。这种变化很可能是由室内温度波动决定的。水的粘度以及因此的电泳迁移率和电渗迁移率每℃降低约2.5％。峰宽随迁移时间大致线性增加(r＝0.91,n＝744)，对于以六个m/z值生成的选定离子电泳图，理论塔板数的中值范围为240,000至600,000。为了检查分离过程中的残留，在注射爪蟾消化物第121次分离后，通过注入25nl的1mhac进行了空白分析。基本峰电泳图如图8所示。hela消化物的分析我们使用scaraft涂层毛细管和qexactivehf质谱仪分析hela消化物。用25ng的hela酶切物鉴定出2,158个蛋白质组和10,005个肽段。鉴定的蛋白质基团和肽列于实施例中。代表性的电泳图如图3所示。这些鉴定数量与使用orbitrapfusion质谱仪的该组以前的报告相似，但现在使用的样品量要低16倍。鉴定出的肽段的pi分布如图4所示。scaraft涂层毛细管的性能提高是由于eof非常低，与使用商业涂层lpa毛细管相比，分离窗口增加了一倍。此外，我们认为scaraft涂层毛细管更均一，并减少了样品损失，这有助于分析少量样品。我们在图9中显示了hela肽的累积迁移时间分布。尽管分析时间为200分钟，但大多数肽(>96％)在120分钟内迁移。另外，图10显示了肽相对于pi的迁移时间。大多数在100分钟后迁移的肽的pi<6，这是可以预期的，因为pi低的肽携带的电荷少且迁移缓慢。最后，我们使用proteomediscoverer软件1.4版中的phosphors3.0研究了hela肽的磷酸化。鉴定出153个磷酸化位点(磷酸rs位点概率高于95％)和163个磷酸肽。磷酸化位点和磷酸肽的数量适中是由于它们的丰度低，因此在富集后使用钛(iv)离子亲和色谱法或其他富集形式的分析结果无疑可以改善结果。磷酸肽的迁移时间分布如图11所示。正如预期的那样，超过60％的已鉴定磷酸肽在60分钟后由于其带负电荷的磷酸化位点迁移。磷酸肽的pi分布如图12所示，其中大多数(>80％)的pi低于7。用scaraft方法制备带正电荷的毛细管使用scaraft方法制备带正电荷的涂层毛细管。阳极的eof为5.63×10-4cm2·v-1·s-1(n＝3,rsd＝0.76％)。相反的方向和强劲的eof证实了成功的涂覆工艺。四种蛋白质的混合物在阳离子毛细管上分离，见图5(a)。高eof产生了一个较短的分离窗口。结果，通过分析50ng大肠杆菌消化物仅鉴定出390个蛋白质组和1604个肽。鉴定的蛋白质基团和肽在实施例中进一步讨论。嵌段共聚物涂料的制备为了证明使用scaraft方法制备的涂层的寿命特性，制备了嵌段聚合物涂层。第一涂覆(lpa涂覆)后，阴极的eof为2.42×10-6cm2·v-1·s-1。但是，eof反转为阳极eof的5.46×10-4cm2·v-1·s-1。在第二涂覆(带正电的涂覆)过程之后执行图1中的步骤。eof的相反方向证实了嵌段共聚物涂料的成功制备以及使用scaraft方法制备的涂料的活性。四种蛋白质混合物的分离如图5(b)所示。therdssofthemigrationtimesofmyoglobin,ribonucleasea,andlysozymearelistedintable1.thereproducibilityofthemigrationtimeproducedbytheblockcopolymercoatedcapillaryismorethantwo-timesbetterthanproducedbydirectpositivecoating.肌红蛋白，核糖核酸酶a和溶菌酶的迁移时间的rdss列于表1。由嵌段共聚物涂覆的毛细管产生的迁移时间的重现性比直接阳性包覆产生的迁移时间好两倍以上。使用嵌段聚合物包被毛细管，从50ng大肠杆菌消化物中鉴定出355个蛋白质组和1,483个肽，类似于直接带正电荷的涂覆。鉴定的蛋白质基团和肽信息在实施例中进一步讨论。表1：完整蛋白在两个带涂层的毛细管上的迁移时间。结论开发了一种基于表面受限的水性可逆加成-断裂链转移(scaraft)聚合反应的涂层毛细管通用方法。聚合反应在最佳条件下主要发生在毛细管的内表面上，而不是在溶液中，这避免了可能的堵塞，并大大提高了涂层的均匀性。涂层毛细管的eof大约比商业化lpa涂层毛细管的eof低一个数量级。极低的eof会导致较长的分离窗口，从而改善了自下而上的蛋白质组学分析的性能。通过简单地替换聚合混合物中的官能乙烯基单体，可以制备各种类型的涂料。通过利用通过scaraft聚合反应制备的涂料的活性特性，可以轻松制备基于嵌段共聚物的毛细管涂料。这些嵌段共聚物具有改善cze分离性能并扩大其应用范围的巨大潜力。以下实施例用于上述发明的说明，而不应解释为缩小其范围。本领域技术人员将容易地认识到，所述实施例建议了许多可以实施本发明的其他方式。应当理解，可以进行多种变化和修改而保持在本发明的范围。实施例实施例1、低电渗流聚合物涂层试剂和化学用品。甲酸(fa)，乙酸(hac)，丙烯酰胺，[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化铵溶液(80wt.％于h2o)，4,4-偶氮二(4-氰基戊酸)，氰基甲基[3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基]三硫代碳酸酯，乙酸铵，经tpck处理的牛胰胰蛋白酶，苯甲醇，二硫苏糖醇(dtt)和碘乙酰胺(iaa)购自sigma-aldrich(st.louis,usa)。piercetmhela蛋白消化标准品购自thermofisherscientific(hanoverpark,usa)。甲醇购自honeywellburdick&jackson(wicklow,ireland)。未涂覆的熔融石英毛细管(50μm内径x150μm外径)购自polymicrotechnologies(phoenix,az)。水的去离子过程采用thermoscientific(marietta,oh)的nanopure系统。通过scaraft方法制备带正电荷的毛细管。使用scaraft方法，通过用0.56m的[2-(甲基丙烯酰氧基氧基)乙基]三甲基氯化铵代替丙烯酰胺来制备带正电荷的带涂层毛细管。制备嵌段共聚物涂料。首先，通过使用如上所述的scaraft方法制备lpa涂层。然后，通过用0.56m的[2-(甲基丙烯酰氧基氧基)乙基]三甲基氯化铵代替丙烯酰胺，使用scaraft方法在lpa涂层上制备带正电荷的涂层。cze-esi-ms/ms分析。cze系统由两个高压电源(spellmancze1000r)和一个电动泵浦的纳米喷雾接口组成，该接口将cze分离毛细管连接到质谱仪上。电喷雾发射器由硼硅酸盐玻璃毛细管(外径1.0mm×内径0.75mm，长10cm)制成，用sutter仪器p-1000火焰/棕色微量移液器拉出。发射极开口的尺寸为15-20μm。电喷雾护套电解质是含0.5％fa的10％(v/v)甲醇。背景电解质在水中为1mhac。通过氮气压力注入样品。在毛细管的注入端施加分离电压。将1.6kv施加到鞘流储罐进行电喷雾。电压编程由labview软件控制。质谱仪的工作参数如下所述。eof的测定。用于测定eof的方法与williams和vign(anal.chem.1996,68,1174)报告的方法类似，有少量调整。制备大肠杆菌样品。用于制备大肠杆菌样品的方法如下描述。爪蟾(xenopuslaevis)样品的制备。用于制备爪蟾样品的方法如下描述。长期稳定性测试。50μmi.d.×150μmo.d.×100cm的lpa涂层毛细管的长期稳定性，通过使用溶于30mmnh4hco3的2mg/mlxenopuslaevis蛋白消化物进行评估。使用与ltqxl质谱仪(thermoscientific)相连的princenext840系列自动进样器(来自princetechnologies)来进行爪蟾消化物的121次连续分离，然后进行空白进样。在此分析中，每100分钟通过压力注入25nl样品，进行201.7h(8.4天)连续分离。两次注射之间不进行冲洗或再生步骤。uplc-esi-ms/ms分析。将具有uplcbeh130c18色谱柱(waters,100μm×100mm,1.7μm)的nanoacquityultraperformancelch(uplch)系统(waters,milford,ma,usa)与ltqorbitrapvelos质谱仪(thermofisherscientific)耦合用于肽的分离和鉴定。缓冲液a(水中0.1％fa)和缓冲液b(acn中0.1％fa)用作梯度分离的流动相。将肽自动上样到商用c18反相色谱柱(waters,100μm×100mm,1.7μm颗粒，beh130c18，色谱柱温度40℃)，并用2％缓冲液b冲洗10分钟，流速为1μl/min，然后是梯度：10-11min,2-8％b；11-71min,8-30％b；71-72min,30-80％b；72-77min,80％b；77-78min,80-2％b；78-90min,2％b。将c18色谱柱洗脱的肽泵入毛细管尖端进行电喷雾。ms参数与用于cze-esi-ms/ms分析的参数相同。质谱仪操作参数。使用ltq-orbitrapvelos质谱仪(thermofisherscientific)优化涂层条件并比较cze和uplc方法。电喷雾电压为1.6kv，离子转移管温度保持在300℃。s-lensrf水平为50.00。质谱仪以数据相关模式编程。使用orbitrap质量分析仪在m/z380-1800范围内以30,000(m/z400)的分辨率采集了完整的ms扫描，并将微扫描的数量设置为1。目标值为1.00e+06，最大值注射时间为500ms。对于ms/ms扫描，在一次完整的ms扫描后，依次分离出电荷状态≥2的20个最强峰，并在碰撞诱导的解离模式下进一步破碎。归一化的碰撞能量为35％。使用qexactivehf质谱仪(thermoscientific)评估涂层方法的重现性并分析hela消化液。质谱仪以数据相关模式编程。使用了前20种方法。s-lensrf水平设置为60，加热的毛细管温度为300℃。全扫描分辨率在m/z200时设置为60,000。全扫描目标为3.00e+06，最大填充时间为50ms。质量范围设置为m/z350-1,800。片段扫描的目标值设置为1.00e+05，强度阈值保持在1.00e+05。隔离宽度设置为1.4th。使用固定的第一质量100。归一化的碰撞能量设置为28。以完整模式分析蛋白质混合物。完整的ms扫描是在m/z600-2000范围在orbitrap中获得。以数据相关的方式选择了电荷状态≥5的三个最强峰进行破碎。ms1的agc目标值为1.00e+06，最大注入时间为100ms，而ms2扫描的agc目标值为5.00e+05，最大注入时间为200ms。在ms1和ms2扫描中分别使用了七个和三个微扫描。在每个选定的前体的单同位素峰周围构建一个±10ppm的排除窗口，持续5s。其他参数与上述相同。使用ltqxl质谱仪(thermoscientific)评估lpa涂层毛细管的长期稳定性。在380-1800m/z范围内获得了完整的ms扫描。数据库搜索。在proteomediscoverer1.4和mascot2.5中执行了原始文件的数据库搜索。分类法为大肠杆菌和智人的swissprot数据库分别用作大肠杆菌细胞裂解物和hela细胞系蛋白质组消化的数据库。还执行了对反向数据库的数据库搜索，以评估错误发现率。数据库搜索参数包括完整的胰蛋白酶消化，允许进行两次错位切割，前体质量容差设置为10ppm，对于ltq-orbitrapvelos质谱仪获得的数据，碎片质量容限为0.5da，对于ltq-orbitrapvelos质谱仪获得的数据为0.05da。在qexactivehf仪器上获得的数据。碳酰氨基甲基化(c)被设置为固定修饰。氧化(m)和脱酰胺(nq)被设置为可变修饰。在肽水平上，使用高的肽置信度值过滤肽鉴定，相应的在肽水平上的错误发现率小于1％。在蛋白质水平上，启用了蛋白质分组。实施例2、样品制备制备大肠杆菌样品。使用固体溶菌性肉汤(lb)制作用于大肠杆菌培养的琼脂平板。通过将3gnacl，3g胰蛋白,1.5g酵母提取物和6g琼脂溶于300ml去离子水中来制备固体lb。还通过将10gnacl，10g胰蛋白p和5g酵母提取物在1l去离子水中混合来制备用于大肠杆菌培养的液体lb培养基(无琼脂)。使用前，将所有培养基，平板，其他器皿和烧瓶高压灭菌。将大肠杆菌(dh5-alpha)的冷冻培养物解冻，并铺在准备好的琼脂平板上。在37℃下孵育24小时后，分离出单个菌落，并在装有4ml液体lb培养基的试管中生长，并在37℃的振荡器中孵育过夜。当试管中的内容物变得不透明时，将液体培养基转移到新的烧瓶中，并在37℃的条件下振摇过夜。将具有大肠杆菌的液体lb培养基离心，并将得到的大肠杆菌沉淀用磷酸盐缓冲盐水洗涤3次。然后，将大肠杆菌沉淀物悬浮在8m尿素和100mmtris-hcl(ph8.0)缓冲液中，其中添加了蛋白酶抑制剂，并在冰上超声处理15分钟以裂解细胞。将裂解物以18000g离心15分钟，并收集上清液。通过bca方法测量蛋白质浓度。在-20℃下用丙酮冷过夜沉淀出等分的蛋白质(900μg)。离心后，将沉淀再次用冷丙酮洗涤。所得蛋白质沉淀在室温下干燥。将干燥的大肠杆菌蛋白质(120μg)溶解在100μl含8m尿素的100mmnh4hco3(ph8)中，并在37℃下变性1h。加入10μl的1mdtt后，将混合物在37℃孵育1小时以还原二硫键。随后，向混合物中添加20μl的2miaa，将其在黑暗中于室温温育30分钟。然后，添加900μl的100mmnh4hco3(ph8)以将尿素浓度降低至1m以下。最后，通过与胰蛋白酶一起以1/25(w/w)的胰蛋白酶/蛋白质温育消化处理过的蛋白质。在37℃下放置16小时。消化物用10％tfa(v/v)酸化以终止反应。用c18seppak色谱柱(waters,milford,ma)对胰蛋白酶消化物进行脱盐，然后用真空浓缩器(thermofisherscientific,marietta,oh)进行冻干。将干燥的蛋白质消化物溶解在50mmfa中。爪蟾(xenopuslaevis)样品的制备。根据universityofnotredameinstitutionalanimalcareandusecommittee批准的方案进行所有动物操作。将32细胞阶段的爪蟾卵(总共20个卵)收集到eppendorf管中。除去卵培养缓冲液后，立即将500μl哺乳动物cell-pelb缓冲液和完整的蛋白酶抑制剂添加到eppendorf管中，涡旋振荡1分钟以初步裂解卵。然后，将卵用powergen125型均质器(fisherscientific)在冰上均化2分钟，然后在冰上用bransonsonifier250(vwrscientific,batavia,il)超声处理20min(5min×4)完全裂解卵。然后，将裂解物以18000g离心20分钟，在eppendorf管中获得三层：顶层(脂质)，中层(蛋白质)和沉淀。最后，将蛋白质层转移到另一个eppendorf管中，并用二辛可宁酸法对一小部分蛋白质溶液进行蛋白质浓度测量。分装200μg蛋白质并使用丙酮沉淀纯化。将6倍体积的冷丙酮样品加入蛋白质溶液中，并将混合物在-20℃下保存过夜。在18000g离心20分钟后，除去上清液，再次用冷丙酮洗涤蛋白质沉淀，以完全除去裂解缓冲液中的去污剂。再次离心后，除去上清液，并将蛋白质沉淀物在室温下置于通风橱中约5分钟，以干燥样品。使用前将样品储存在-80℃。eof的测定。用于测定eof的方法与先前报道的方法类似，只是稍作调整(anal.chem.1996,68,1174)。首先，毛细管中充满了分离缓冲液(1mhac)。接下来，将中性标记物(用1mhac制备的苄醇)塞子注入毛细管中，持续时间tinj(带n1)。然后，将分离缓冲液塞在压力下加载到毛细管中，持续时间ttr。第二，再次注入另一带的中性标记溶液(带n2)，持续时间tinj。然后，将毛细管切换为背景电解质，并且在注入压力下将带n2在毛细管中转移ttr。第三，对时间tmigr施加分离电压vseparation。在这段时间内，带n1和n2向阴极移动(对于阴极eo流)，其迁移率等于μeof。然后，在vseparation恢复为零后，将第三个中性标记塞注入毛细管(带n3)中，持续时间tinj。最后，将注入压力再次施加到本底电解质小瓶上，并同时启动数据采集以记录所有三个波段的通过。然后，μeof可以计算为：其中tn1,tn2和tn3是n1，n2和n3波段的观察到的动员时间。l是分离毛细管的长度。文中描述了上述的一些实施方式和实施例，但这些描述都只是示意和说明性的，对本发明的范围不产生限制作用。根据本领域的普通技术可能进行一些改变和修饰，然而并不脱离本发明由下列权利要求所定义的较为宽泛的范围。所有的出版物、授权专利和专利申请文献均通过参考纳入文本，就如各自单独通过参考纳入本文那样。由这些公开物，应当不会引入与本文公开内容不一致的限制。本发明的描述引述了各种特定和优选的实施方式和技术方案。应当理解，还有许多变化和修饰可被采纳，仍然都应属于本发明的精神和范围。当前第1页1 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