本发明涉及医用材料技术领域，具体涉及一种注射用乳化交联透明质酸钠凝胶微球及制备方法。
背景技术：
透明质酸钠(sh)是一种酸性粘多糖。早在1930～1940年间，meyer就从动物的滑液、皮肤、雄鸡冠及人脐带等组织中提取得到透明质酸钠，kendell等于1937年从细菌体内提取得到sh。由不同来源、不同精制方法获得的sh虽然分子量不同，但无种属差异性。透明质酸制剂在医学上使用有较长的历史，通常使用在眼科和骨科方面，1962年，透明质酸钠制剂(healon喜朗)被fda批准应用于眼科手术中房水和玻璃体的替代品和眼科外用药物的基质。此后，还被应用于关节腔注射治疗关节炎，以及用于声带的注射，用于声口闭合不全。近年来还有报道使用透明质酸钠作为外用药物用于皮肤创面的治疗，以达到吸收渗液、抗炎和促进伤口愈合的作用。这些产品大都没有进行交联，因此他们在体内的存留时间一般只有几天。由于透明质酸钠的快速降解，眼科和关节内注射的透明质酸钠无法应用于皮肤充填，为了延长存留时间，必须通过交联法用化学键将这些小分子透明质酸钠颗粒交联成大分子量的团块，以延缓其降解。透明质酸钠的交联技术从1980年开始使用，交联之后的透明质酸钠形成三维的凝胶状结构，但其理化特性和组织相容性保持不变。目前常用的透明质酸钠制剂，其浓度达到5.5～20mg/ml，颗粒直径可以根据需要达到125～1000μm，注射到组织后，其降解时间可以达到6个月以上。透明质酸钠具有无抗免疫原型、无需皮试、无需冷藏、可以是非动物源性(提取自链球菌)，可吸收但是疗效长、无毒等诸多优点。透明质酸钠以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能，如润滑关节，调节血管壁的通透性，调节蛋白质，水电解质扩散及运转，促进创伤愈合等。
由于透明质酸钠直链轴上单糖之间氢键的作用，透明质酸钠分子在空间上呈刚性的螺旋柱状结构，柱的内侧由于存在大量的羟基而产生强亲水性，而且透明质酸分子将其结合的水分子锁定在其双螺旋柱状结构中，使水分子不易流失，因此具有特殊的保水作用，保水能力理论上可高达500ml/mg，被誉为理想的天然保湿因子。随着年龄增长，体内透明质酸的减少，口服含有透明质酸的保健品可补充体内透明质酸，具有延缓衰老和润泽皮肤等功效，在日本、美国等国家已被广泛使用。目前国内外制备交联透明质酸的方法较多，通常是将透明质酸与交联剂在水溶液中搅拌混合，通过加入交联剂使透明质酸高分子链间化学键合成来制备，得到的块状凝胶一般经机械粉碎或施压通过筛网来获得不同粒径规格，但制备出来的交联透明质酸凝胶都存在交联程度不均一，颗粒形态不规范及粒径不均一等问题。公开号为ep2225281的专利描述了一种乳液中交联透明质酸微珠的制备方法，该方法获得的微球形态均一，粒径分布在1nm～1μm之间，但最后获得的交联透明质酸微珠未进行有效的油相残留和交联剂残留控制措施，而且生物相容性以及保水性能仍不理想，存在产品不稳定等问题，不能很好地满足市场需求。公开号为cn103333351a的专利提供了一种以透明质酸钠为原料制备可用栓塞剂的交联透明质酸钠微球的工艺。其乳化速度是500rpm～2000rpm，交联反应的过程是室温下搅拌4～6h，得到的微球粒径为80～2000μm之间。
技术实现要素：
本发明针对现有技术中的不足之处，提供一种注射用乳化交联透明质酸钠凝胶微球的制备方法，该方法具有反应条件温和，制备步骤简单，操作便利，无有害物质产生等优点，并具有良好的生物相容性及耐酸碱性能。为此，本发明采用以下技术方案：
一种注射用乳化交联透明质酸钠凝胶微球的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)制备透明质酸钠微球颗粒的乳状液；
(2)将交联剂按照和透明质酸钠的一定质量比加入到所述乳状液中，先冰浴搅拌混匀，然后在室温搅拌下进行初步反应，最后在35～42℃水浴搅拌下反应，反应结束后得到微球乳液，先降温，然后调节ph到4～6；
(3)先用正己烷将ph调到4～6的微球乳液搅拌清洗数次，静置分层，弃去上层油相，完成后，再用乙酸乙酯搅拌清洗数次，静置分层，弃去上层油相；完成后，再用无水乙醇搅拌清洗数次，静置分层，弃去上层油相；
(4)将步骤(3)中有机溶剂清洗好的微球放入缓冲液中静置溶胀过夜后倾倒上清液；
(5)将步骤(4)的制品过筛，筛除去不在范围内的凝胶微球，得到注射用乳化交联透明质酸钠凝胶微球。
在一种优选实施方式中，步骤(1)中的乳状液，油相为液体石蜡、植物油、矿物油、硅油或合成油中的一种，优选为液体石蜡；所述油相中乳化剂质量百分比为2～8％。
在一种优选实施方式中，采用微生物发酵法制备透明质酸钠，将透明质酸钠配制成浓度为8～20％g/ml的透明质酸钠碱液凝胶，碱性溶液为naoh溶液或koh溶液，强力搅拌得到透明质酸钠碱液凝胶，然后将其加入到含有乳化剂的油相里用剪切机高速乳化，形成透明质酸钠微球颗粒的乳状液，所述的透明质酸钠碱液凝胶与油相的重量比为1:2～1:12。进一步地，透明质酸钠凝胶分子量为90万～150万道尔顿，优选110万～130万道尔顿。
在一种优选实施方式中，步骤(1)制备所述乳状液时，剪切机转速为4000～5000rpm，时间为30～60min。
在一种优选实施方式中，步骤(2)中所述的交联剂选自二乙烯基砜(dvs)、1，4-丁二醇二缩水甘油醚(bdde)，优选为二乙烯基砜(dvs)；交联剂按照和透明质酸钠10～30％的质量比加入到乳状液中。
在一种优选实施方式中，步骤(2)中冰浴搅拌50min至70min，然后室温搅拌下反应80min至100min左右，最后35-42℃水浴搅拌先反应50min至70min。
在一种优选实施方式中，在步骤(3)中，用正己烷将上述乳液搅拌清洗两次，静置分层，弃去上层油相，清洗时间每次5～10min；完成后，用无水乙醇搅拌清洗两次，静置分层，弃去上层油相，清洗时间每次5～10min；完成后，用乙酸乙酯搅拌清洗两次，静置分层，弃去上层油相，清洗时间每次5～10min；再用无水乙醇搅拌清洗两次，静置分层，弃去上层油相，清洗时间每次5～10min。
在一种优选实施方式中，步骤(4)的缓冲液为pbs缓冲液，磷酸氢二钠质量比0.035％，磷酸二氢钠质量比0.014％，氯化钠质量比0.7％，缓冲液ph值在6.0～8.0之间。
在一种优选实施方式中，通过控制步骤(1)的乳化速度、乳化时间、水相中透明质酸钠碱液浓度、水相/油相重量比、交联剂用量，制备凝胶微球的粒径范围在60～330μm之间的不同粒径和不同吸水倍数及溶胀比的凝胶微球。
在一种优选实施方式中，所制得的凝胶微球经湿热灭菌后贮存于注射器中密封保存。
本发明还涉及一种注射用乳化交联透明质酸钠凝胶微球，该注射用乳化交联透明质酸钠凝胶微球由上述任一所述的制备方法制作而成。
本发明的上述注射用乳化交联透明质酸钠凝胶微球的制备方法区别与常规交联方法，将透明质酸钠碱性凝胶加入到含乳化剂的油相中，在乳化剪切机高速剪切获得w/o型乳状液，在乳化剂的作用下，降低了两相表面张力，从而使透明质酸钠胶体呈微球形态均匀分布在乳状液中，加入的交联剂通过三步法与这些胶体颗粒进行交联反应，确保单个透明质酸钠胶体颗粒内部进行均匀和有序的交联反应，获得合适的粘性模量、弹性模量和推挤力，且不会在颗粒之间进行交联反应，提高合格凝胶微球的获得率，适用于注射使用，具有广泛的应用前景。
具体实施方式
以下给出本发明的实施例，进一步对本发明进行详细说明，但本发明并不限于此。
实施例1
(1)称取分子量为110万～130万道尔顿的透明质酸钠6.39g，与1％naoh溶液配置成质量百分比浓度为8％g/ml的透明质酸钠碱液凝胶；
(2)取液体石蜡300.05g和司盘8018.03g混匀获得油相，将步骤(1)得到的透明质酸钠凝胶缓慢加入到油相中，经搅拌机高速乳化，乳化转速为4000rpm，时间为30min；
(3)待步骤(2)乳化完成后加入交联剂二乙烯基砜1.06g，冰浴搅拌1h，室温搅拌1.5h，40℃水浴搅拌1h，降温后用冰醋酸调节ph值为5.0；
(4)倾倒上层油相，加入正己烷搅拌清洗第一次8min，静置分层后倒掉上层油相，加入正己烷搅拌清洗第二次6min，静置分层后倒掉上层油相，加入无水乙醇搅拌清洗第一次8min，静置分层后倒掉上层油相，加入无水乙醇搅拌清洗第二次6min，静置分层后倒掉上层油相，加入乙酸乙酯搅拌清洗第一次8min，静置分层后倒掉上层油相，加入乙酸乙酯搅拌清洗第二次6min，加入无水乙醇搅拌清洗第三次6min，静置分层后倒掉上层油相，加入无水乙醇搅拌清洗第四次5min，静置分层后倒掉上层油相；
(5)配置pbs缓冲液，磷酸氢二钠质量比0.035％，磷酸二氢钠质量比0.014％，氯化钠质量比0.7％，将上一步有机溶剂清洗好的微球放入上述缓冲液中静置溶胀过夜后倾倒上清液；
(6)将上述制品过筛，筛除去不在范围内的凝胶微球。
(7)将所制得的凝胶经湿热灭菌后贮存于注射器中密封保存。
将制备所得的凝胶微球在粒度分析仪下观察，微球呈规则的球形，粒径在80～280μm之间。
精密称取一定量w1的微球颗粒浸入生理盐水中，至微球达到吸水饱和状态后再次称量w2，计算得出微球的吸水倍数w2/w1＝33.85倍。
取部分微球测量其粒径平均值d1，再将微球浸入生理盐水中，至微球达到吸水饱和状态后再次测量其粒径平均值d2，计算出微球的溶胀比d2-d1/d1*100％＝23.37％。
取微球适量，用流变仪测得微球的粘性模量为296pa，弹性模量为875pa。取微球适量，安装27g针头，以20mm/min的速度推动，记录注射器柄的平均推挤力为14n，适用于注射使用。
实施例2
(1)称取分子量为110万～130万道尔顿的透明质酸钠6.45g，与1％naoh溶液配置成质量百分比浓度为8％g/ml的透明质酸钠碱液凝胶；
(2)取液体石蜡300.05g和司盘8018.03g混匀获得油相，将步骤(1)得到的透明质酸钠凝胶缓慢加入到油相中，经搅拌机高速乳化，乳化转速为4500rpm，时间为30min；
(3)待步骤(2)乳化完成后加入交联剂二乙烯基砜1.07g，冰浴搅拌1h，室温搅拌1.5h，40℃水浴搅拌1h，降温后用冰醋酸调节ph值为5.0；
(4)倾倒上层油相，加入正己烷搅拌清洗第一次8min，静置分层后倒掉上层油相，加入正己烷搅拌清洗第二次6min，静置分层后倒掉上层油相，加入无水乙醇搅拌清洗第一次8min，静置分层后倒掉上层油相，加入无水乙醇搅拌清洗第二次6min，静置分层后倒掉上层油相，加入乙酸乙酯搅拌清洗第一次8min，静置分层后倒掉上层油相，加入乙酸乙酯搅拌清洗第二次6min，加入无水乙醇搅拌清洗第三次6min，静置分层后倒掉上层油相，加入无水乙醇搅拌清洗第四次5min，静置分层后倒掉上层油相；
(5)配置pbs缓冲液，磷酸氢二钠质量比0.035％，磷酸二氢钠质量比0.014％，氯化钠质量比0.7％，将上一步有机溶剂清洗好的微球放入上述缓冲液中静置溶胀过夜后倾倒上清液；
(6)将上述制品过筛，筛除去不在范围内的凝胶微球。
(7)将所制得的凝胶经湿热灭菌后贮存于注射器中密封保存。
按照与实施例1同样的方法观察微球的形态，本实施例所得的微球的粒径在70～250μm之间。
按照与实施例1同样的方法测得微球的吸水倍数为34.26倍。
按照与实施例1同样的方法测得微球的溶胀比为25.61％。
按照与实施例1同样的方法测得微球的粘性模量为263pa，弹性模量为847pa。按照与实施例1同样的方法测得注射器柄推挤力为13n，适用于注射使用。
由实施例1和实施例2实验结果对比中的出，通过控制乳化速度可制得不同粒径分布的微球颗粒。当乳化速度较大时，水相受到的作用力加大，微球的分散性也变大，粒径就越小，反之亦然。
实施例3
(1)称取分子量为110万～130万道尔顿的透明质酸钠6.40g，与1％naoh溶液配置成质量百分比浓度为16％g/ml的透明质酸钠碱液凝胶；
(2)取液体石蜡300.07g和司盘8018.02g混匀获得油相，将步骤(1)得到的透明质酸钠凝胶缓慢加入到油相中，经搅拌机高速乳化，乳化转速为4000rpm，时间为30min；
(3)待步骤(2)乳化完成后加入交联剂二乙烯基砜1.06g，冰浴搅拌1h，室温搅拌1.5h，40℃水浴搅拌1h，降温后用冰醋酸调节ph值为5.0；
(4)倾倒上层油相，加入正己烷搅拌清洗第一次8min，静置分层后倒掉上层油相，加入正己烷搅拌清洗第二次6min，静置分层后倒掉上层油相，加入无水乙醇搅拌清洗第一次8min，静置分层后倒掉上层油相，加入无水乙醇搅拌清洗第二次6min，静置分层后倒掉上层油相，加入乙酸乙酯搅拌清洗第一次8min，静置分层后倒掉上层油相，加入乙酸乙酯搅拌清洗第二次6min，加入无水乙醇搅拌清洗第三次6min，静置分层后倒掉上层油相，加入无水乙醇搅拌清洗第四次5min，静置分层后倒掉上层油相；
(5)配置pbs缓冲液，磷酸氢二钠质量比0.035％，磷酸二氢钠质量比0.014％，氯化钠质量比0.7％，将上一步有机溶剂清洗好的微球放入上述缓冲液中静置溶胀过夜后倾倒上清液；
(6)将上述制品过筛，筛除去不在范围内的凝胶微球。
(7)将所制得的凝胶经湿热灭菌后贮存于注射器中密封保存。
按照与实施例1同样的方法观察微球的形态，本实施例所得的微球的粒径在100～310μm之间。
按照与实施例1同样的方法测量微球的吸水倍数为30.74倍。
按照与实施例1同样的方法测量微球的溶胀比为21.55％。
按照与实施例1同样的方法测得微球的粘性模量为313pa，弹性模量为891pa。按照与实施例1同样的方法测得注射器柄推挤力为15n，适用于注射使用。
由实施例1和实施例3实验结果对比中得出，通过控制透明质酸钠碱液凝胶的浓度可制得出不同粒径分布的凝胶微球。透明质酸钠在溶液中的低浓度，使透明质酸钠微球含水量偏高，加大了在乳液中的分散性，使获得的微球粒径变小。
实施例4
(1)称取分子量为110万～130万道尔顿的透明质酸钠6.38g，与1％naoh溶液配置成质量百分比浓度为8％g/ml的透明质酸钠碱液凝胶；
(2)取液体石蜡300.03g和司盘8018.04g混匀获得油相，将步骤(1)得到的透明质酸钠凝胶缓慢加入到油相中，经搅拌机高速乳化，乳化转速为4000rpm，时间为30min；
(3)待步骤(2)乳化完成后加入交联剂二乙烯基砜1.59g，冰浴搅拌1h，室温搅拌1.5h，40℃水浴搅拌1h，降温后用冰醋酸调节ph值为5.0；
(4)倾倒上层油相，加入正己烷搅拌清洗第一次8min，静置分层后倒掉上层油相，加入正己烷搅拌清洗第二次6min，静置分层后倒掉上层油相，加入无水乙醇搅拌清洗第一次8min，静置分层后倒掉上层油相，加入无水乙醇搅拌清洗第二次6min，静置分层后倒掉上层油相，加入乙酸乙酯搅拌清洗第一次8min，静置分层后倒掉上层油相，加入乙酸乙酯搅拌清洗第二次6min，加入无水乙醇搅拌清洗第三次6min，静置分层后倒掉上层油相，加入无水乙醇搅拌清洗第四次5min，静置分层后倒掉上层油相；
(5)配置pbs缓冲液，磷酸氢二钠质量比0.035％，磷酸二氢钠质量比0.014％，氯化钠质量比0.7％，将上一步有机溶剂清洗好的微球放入上述缓冲液中静置溶胀过夜后倾倒上清液；
(6)将上述制品过筛，筛除去不在范围内的凝胶微球。
按照与实施例1同样的方法观察微球的形态，本实施例所得的微球的粒径在90～280μm之间。
按照与实施例1同样的方法测量微球的吸水倍数为26.48倍。
按照与实施例1同样的方法测量微球的溶胀比为18.60％。
按照与实施例1同样的方法测得微球的粘性模量为286pa，弹性模量为894pa。按照与实施例1同样的方法测得注射器柄推挤力为15n，适用于注射使用。
由实施例1和实施例4实验结果对比中得出，通过控制交联剂的用量可制得不同吸水倍数和溶胀比的凝胶微球。交联透明质酸钠的吸水倍数和溶胀比取决于本身的交联程度，溶剂分子进入聚合物交联成的网络时，将引起三维分子网的伸展而使聚合物交联体系的膨胀。当交联程度较小时，交联网中交联点间高分子链较长，溶剂分子进去的较多，体系膨胀越大；当交联程度较大时，交联网中交联点间高分子链较短且交联点密集，溶剂分子进去的较少，体系膨胀越小。
由实施例1～4可见，采用本发明的制备方法制备的注射用乳化交联透明质酸钠凝胶微球的吸水倍数在26～34倍之间，溶胀比在18～26％之间，粘性模量在263～313pa之间，弹性模量在847～894pa之间，推挤力在13～15n之间，具有良好的吸水性能和溶胀性能，粘性模量、弹性模量和推挤力都比较适中，适用于注射使用，具有广泛的应用前景。
对比实施例1(交联方法采用公开号为cn103333351a的专利方法)
(1)称取分子量为110万～130万道尔顿的透明质酸钠6.41g，与1％naoh溶液配置成质量百分比浓度为8％g/ml的透明质酸钠碱液凝胶；
(2)取液体石蜡300.04g和司盘8018.00g混匀获得油相，将步骤(1)得到的透明质酸钠凝胶缓慢加入到油相中，经搅拌机高速乳化，乳化转速为4000rpm，时间为30min；
(3)待步骤(2)乳化完成后加入交联剂二乙烯基砜1.06g，室温搅拌4h，降温后用冰醋酸调节ph值为5.0；
(4)倾倒上层油相，加入正己烷搅拌清洗第一次8min，静置分层后倒掉上层油相，加入正己烷搅拌清洗第二次6min，静置分层后倒掉上层油相，加入无水乙醇搅拌清洗第一次8min，静置分层后倒掉上层油相，加入无水乙醇搅拌清洗第二次6min，静置分层后倒掉上层油相，加入乙酸乙酯搅拌清洗第一次8min，静置分层后倒掉上层油相，加入乙酸乙酯搅拌清洗第二次6min，加入无水乙醇搅拌清洗第三次6min，静置分层后倒掉上层油相，加入无水乙醇搅拌清洗第四次5min，静置分层后倒掉上层油相；
(5)配置pbs缓冲液，磷酸氢二钠质量比0.035％，磷酸二氢钠质量比0.014％，氯化钠质量比0.7％，将上一步有机溶剂清洗好的微球放入上述缓冲液中静置溶胀过夜后倾倒上清液；
(6)将上述制品过筛，筛除去不在范围内的凝胶微球。
(7)将所制得的凝胶经湿热灭菌后贮存于注射器中密封保存。
按照与实施例1同样的方法观察微球的形态，本实施例所得的微球的粒径在120～350μm之间。
按照与实施例1同样的方法测量微球的吸水倍数为26.92倍。
按照与实施例1同样的方法测量微球的溶胀比为20.13％。
按照与实施例1同样的方法测得微球的粘性模量为356pa，弹性模量为992pa。按照与实施例1同样的方法测得注射器柄推挤力为18n。
对比实施例2(交联方法采用公开号为cn103333351a的专利方法)
(1)称取分子量为110万～130万道尔顿的透明质酸钠6.40g，与1％naoh溶液配置成质量百分比浓度为8％g/ml的透明质酸钠碱液凝胶；
(2)取液体石蜡300.08g和司盘8018.02g混匀获得油相，将步骤(1)得到的透明质酸钠凝胶缓慢加入到油相中，经搅拌机高速乳化，乳化转速为4000rpm，时间为30min；
(3)待步骤(2)乳化完成后加入交联剂二乙烯基砜1.06g，室温搅拌6h，降温后用冰醋酸调节ph值为5.0；
(4)倾倒上层油相，加入正己烷搅拌清洗第一次8min，静置分层后倒掉上层油相，加入正己烷搅拌清洗第二次6min，静置分层后倒掉上层油相，加入无水乙醇搅拌清洗第一次8min，静置分层后倒掉上层油相，加入无水乙醇搅拌清洗第二次6min，静置分层后倒掉上层油相，加入乙酸乙酯搅拌清洗第一次8min，静置分层后倒掉上层油相，加入乙酸乙酯搅拌清洗第二次6min，加入无水乙醇搅拌清洗第三次6min，静置分层后倒掉上层油相，加入无水乙醇搅拌清洗第四次5min，静置分层后倒掉上层油相；
(5)配置pbs缓冲液，磷酸氢二钠质量比0.035％，磷酸二氢钠质量比0.014％，氯化钠质量比0.7％，将上一步有机溶剂清洗好的微球放入上述缓冲液中静置溶胀过夜后倾倒上清液；
(6)将上述制品过筛，筛除去不在范围内的凝胶微球。
(7)将所制得的凝胶经湿热灭菌后贮存于注射器中密封保存。
按照与实施例1同样的方法观察微球的形态，本实施例所得的微球的粒径在140～380μm之间。
按照与实施例1同样的方法测量微球的吸水倍数为25.50倍。
按照与实施例1同样的方法测量微球的溶胀比为19.81％。
按照与实施例1同样的方法测得微球的粘性模量为374pa，弹性模量为1028pa。按照与实施例1同样的方法测得注射器柄推挤力为19n。
通过实施例1和对比实施例1与对比实施例2的实验结果对比发现，采用公开号为cn103333351a的专利中的交联过程进行反应(即室温交联4～6h)，微球粒径较大，粘性模量和弹性模量较大，注射器柄推挤力也较大，不适用于注射使用。这是因为透明质酸钠和如二乙烯基砜等交联剂的交联是一个快速的过程，本发明采用分段法让二者反应，即先冰浴再室温再水浴。首先采用冰浴，在高速搅拌下，二乙烯基砜进入油包水的水相中优先于反应而先和透明质酸钠混合均匀，二乙烯基砜从较低的温度过渡到室温交联反应会比较缓慢，而如果直接室温交联的话，透明质酸钠和二乙烯基砜的反应会比较剧烈，分子链会变长，微球粒径会增大。微球粒径增大，粘性模量和弹性模量会增大，推挤力也会增大。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解；其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。