光交联的透明质酸衍生物及其制备方法和应用
【专利说明】光交联的透明质酸衍生物及其制备方法和应用
[0001] 发明概沐
[0002] 本发明公开了光交联的透明质酸（HA)衍生物，其由HA、作为三甘醇的双功能聚乙 二醇（PEG)间隔基以及选自香豆素衍生物和苯基乙基酮的光反应性化合物构成。 技术背景
[0003] 水凝胶和海绵是特征为三维结构的聚合物网络，对水凝胶而言其是紧密的，对海 绵而言其具有相互连接的孔。海绵通常吸收大量的水，而在水凝胶中该特性（"膨胀"）可 能较不显著，其取决于水凝胶的紧密度；非常紧密的凝胶比不非常紧密的凝胶吸附的水少。
[0004] 已经对这些类型的材料进行了一段时间的研宄；例如，水凝胶用于以下领域：药 物递送、软组织填充和关节障碍，所述关节障碍受益于向关节插入吸收张力和振动的"支 承（bearings)"。海绵特别用于组织工程学领域，尤其是它们被细胞建群的能力。这 些应用明显完全取决于所使用的起始聚合物的性质。具体而言，在本发明的情况中，选 择的聚合物是多糖、即透明质酸（HA)，一种由交替的D-葡糖醛酸和N-乙酰基-D-葡 糖胺残基构成的杂多糖。其是分子量至多13x 106Da的直链聚合物，这取决于其获得 的来源和所使用的制备方法。其普遍存在，且在生物有机体中起重要作用，尤其作为 许多组织、诸如皮肤、腱、肌肉和软骨的细胞的机械支撑。其还调节许多涉及细胞生理 学和生物学的不同的过程、诸如细胞增殖、迀移和分化和血管发生（Weigel P.等人，J Theoretical Biol，1986:219_234;Abatangelo G.等人，J Surg Res, 1983, 35:410-416; Goa K.等人，Drugs, 1994, 47:536-566)，且还履行其它功能、诸如组织水合和关节 润滑。在关节中，关节液中包含的透明质酸在缓慢移动期间用作粘性润滑剂，在快 速移动期间，由于其弹性特性，其吸收任何影响关节的损伤或微伤（Balazs EA.等 人，J Rheumatol Suppl, 1993, 12:75-82 ;Belcher C.等人，Annals of the Rheumatic Diseases, 1997, 56:299-307)。这些受到广泛认可的性质的组合在各种来源的伤口、溃疡和 皮肤损害的治疗所用的敷料的制备中和在设计用于骨关节炎、软骨退化等的治疗中的关节 内应用的医疗装置中已经使用了一段时间。
[0005] 使用众多方法从多种多糖来获得具有特定特性的水凝胶；对透明质酸成功使用的 最重要的方法包括化学交联（使用与给定官能团特异性反应的分子（二乙烯基砜，BDDE))， 或游离基聚合。这些方法，其先决条件为对HA化学修饰以使它们适合之后的交联或聚合 (衍生）反应，得到具有良好特性（紧密度、化学和机械耐力和水合能力）的水凝胶；然而， 由于衍生和交联同时发生，所以在凝胶的形成过程中，能将试剂残余物保留在它们的结构 中，且试剂残余物特别经常是有毒的，因为它们难以除去。
[0006] 获得聚合物交联形成的另一个系统是对之前用适合的官能团衍生过的多糖使用 UV辐照以赋予它们光反应性。衍生涉及：键合于多糖物质，当所述多糖物质通过UV辐照被 活化时它们键合在一起，使不同的聚合物链交联，并由此生成网络。所述方法特别有利，因 为在衍生步骤期间其能容易有效地去除不期望的反应残留或中间体，并因此有助于更安全 地制备终产物。可以使用多种光反应性的物质；例如，已知的是从用肉桂酸或胸腺嘧啶衍生 化的HA获得的水凝胶（EP0554898 ;US6602859)和海绵类（EP1666503)。在这些情况中，将 透明质酸键合于肉桂酸或胸腺嘧啶残基，然后进行辐照以获得水凝胶；对于海绵，将水凝胶 冷冻干燥或冷冻，然后进行第二次辐照周期。可以使用的另外的光反应性的物质是苯基乙 基酮；经由酯键与苯基乙基酮键合、然后进行辐照而从透明质酸或其衍生物获得的凝胶是 已知的（EP1519962)。现有领域中已知的其它光反应性物质是蒽、核黄素、香豆素和尿嘧啶， 对其进行适当衍生化和取代以促进与多糖的键合，所述是多糖通常是酯或酰胺类型的，且 因此包括多糖中常出现的-OH、-C00H和-NH 2基团。多糖经常在反应前被衍生化，例如以保 护一些官能团或以促进所需键的形成。水凝胶的特性、诸如紧密度、水合能力、机械强度等， 可以通过调节各种参数来改变（多糖类型、光反应性、两个整体之间的键、与多糖相比光反 应性物质的百分比、辐照的强度和持续时间）。
[0007] 在本发明的范围内，申请人令人惊讶地发现经由特定的间隔基与特定的光反应性 物质键合的透明质酸在适合的UV辐照之后生成具有卓越的紧密度的水凝胶，其是生物可 降解的、生物相容的、无毒的，且具有形状记忆特性；换言之所述水凝胶保持它们在其中被 制备的容器的形状，且可以在切割的同时保持它们的结构，或者非常容易操作。本文所要求 的海绵也具有这些相同的特性，具有创新性的是其不是如迄今为止的现有技术所述那样从 水凝胶获得，而是从与间隔基和光反应性物质键合的透明质酸的溶液开始、随后经冷冻干 燥、最后进行UV辐照来获得；不同于已知的海绵，由此仅需要单一辐照步骤，这代表了相当 巨大的工业优势。海绵还具有形状记忆特性，且因此可以被重复浸湿和挤压，而仍然保持相 同的形状和结构特性以及需要单一 UV辐照。本申请人已经证实该套特性与特定间隔基的 使用相关，其使得与现有技术相比本发明具有新颖性和创造性。
[0008] 具体而言，实施例8和图8阐述了根据所述现有专利EP1519962(其为本申请人所 拥有）的实施例2制备的水凝胶和根据本申请的实施例15制备的水凝胶的膨胀度的比较 数据。由于后一类水凝胶吸收的水更少，它们是更加紧密的，因而交联是更加有效的。
[0009] 发明详沐
[0010] 本发明公开和要求了透明质酸（HA)的光交联的衍生物、它们的基于适当制备的 可光交联的中间体的UV辐照的通过交联的制备方法、以及所述光交联的衍生物在医药领 域的应用。本文所述的光交联的衍生物采用不同紧密程度的水凝胶形式或者采用海绵形 式，即具有相互连接的孔的三维结构。它们是生物相容的、生物可降解的、无毒的，且尤其是 可以调节它们的紧密程度或孔隙率。这些发明的另外的特性为形状记忆，即保持它们形状 的能力、甚至在制备它们的容器之外以及对海绵而言在重复浸湿和挤压之后保持它们形状 的能力。本发明的产品可以应用于众多医学和生物医学领域。水凝胶例如可以用于：
[0011] ?包囊于它们中的或化学键合于它们的活性成分的释放；各种活性成分包括药理 学和/或生物学活性物质、诸如营养因子、抗生素、留体和非留体抗炎药、蛋白质、肽、激素 和血小板提取物；
[0012] ?用于医药应用的对象的包衣；
[0013] ?将固体材料、诸如骨粉、珊瑚颗粒、生物陶瓷和羟基磷灰石包囊，使用其可以将用 于整形外科、口腔医学等领域的糊剂进行模型塑造；
[0014] ?填充在软组织、诸如皱纹、凹陷瘢痕中的各种尺寸的缺损和源自外科手术的洞；
[0015] ?用作细胞生长和组织、诸如骨、脂肪组织、皮肤、软骨、腱、韧带、肌肉、神经组织、 内皮组织、结缔组织等再生的支架。可以在植入前将细胞（无论分化的或未分化的）插入 支架中，并适当地培养；或者，可以将支架插入待治疗的损害（lesion)处，并放置以使其被 损害位置生理性存在的细胞建群。对于该类型应用，其尤其可以用于将透明质酸在辐照前 与胶原蛋白混合，所述胶原蛋白保持被物理捕获在形成的水凝胶网中，所述胶原蛋白赋予 所述水凝胶更大的弹性，并改善其结构能力（structural capacity)和对其将被放置的位 置的适应；
[0016] ?用作手术后防止粘连的机械屏障和保护组织免受炎性损害；
[0017] ?通过关节内注射治疗骨关节炎和/或软骨损伤。再次，如上文所述，水凝胶可以 包含分化的或未分化的细胞和/或药理学或生物学活性物质。
[0018] 由于海绵在它们的孔中收藏细胞的能力，其尤其可用于组织工程学领域（例如用 于皮肤、骨、软骨、脂肪组织、腱、韧带、肌肉、神经、内皮和结缔组织）；如在水凝胶类的情况 中，可以在植入前将细胞（分化的或未分化的）插入支架中，并适当地培养；或者，可以将支 架插入待治疗的损害处，并放置以使其被损害位置生理性存在的细胞建群。由于它们的结 构，海绵特别适用于在形成腔洞的和深的损害（诸如大切除手术（乳腺、黑素瘤或深痣的全 部和部分切除）后形成的那些）中的组织重建。
[0019] 海绵也可以用作（如同水凝胶）骨或牙科损害的填充材料（任选地与药理学和/ 或生物学活性物质组合），以及最后用于骨关节炎和软骨损伤的关节内治疗。在冷冻干燥 (其在辐照之前）前将胶原蛋白加入海绵，这又赋予它们更好的稳定性和弹性的结构特性， 且使得它们特别适用于其将被使用的位置的形状和尺寸。
[0020] 本发明涉及的衍生物由以下构成：
[0021] ?透明质酸；
[0022] ?特定的双功能PEG间隔基；
[0023] ?光反应性物质，其选自苯基乙基酮和香豆素衍生物
[0024] 其（如下文所述那样键合）形成可光交联中间体，后者从而在UV辐照后，生成本 文描述和要求的水凝胶和海绵形式的光交联的衍生物。如所述，所述衍生物可以任选地包 含胶原蛋白，用于以上述及的目的。
[0025] 更具体地，本发明的第一个目的是透明质酸（HA)的光交联的衍生物，其由HA、作 为三甘醇的双功能聚乙二醇（PEG)间隔基和选自香豆素衍生物和苯基乙基酮的光反应性 的化合物构成。
[0026] 如所述，使用的多糖为透明质酸，已经描述了其主要特性。具体而言，本文使 用的HA可以源自任何来源、诸如来自公鸡鸡冠提取（EP 138572)，发酵（从马链球菌 (Streptococcus equi)或兽疫链球菌（Streptococcus zooepidemicus))或生物合成（来 自Bacillus)，且具有10kDa至1000kDa的范围的平均分子量、优选40k Da至700kDa、且 甚至更优选160kDa至220kDa的范围的平均分子量；最后这个部分在下文被简称"具有 200kDa平均MW的HA"。需要强调的是在本说明书中，"平均分子量"意指通过"特性粘度 (intrinsic viscosity) "方法计算得到的重量平均分子量（Terbojevich等人，Carbohydr Res, 1986, 363-377)。
[0027] 对于间隔基，聚乙二醇（PEG)适用于本发明的目的。PEG通过环氧乙烷的聚合获 得；其由直链构成，且由于多能性其广泛用于化学和制药工业，尤其是其没有毒性。其还是 双功能间隔基，可以在其链的两个末端键合于不同的分子。取决于聚合程度，其可以具有极 其不同的M