水凝胶的紧密度且因此其是基本参数。G'（弹性模量）在0. 07至90.0 rad/s以Pa测 定，力值为10%。从使用低功率UV灯辐照后胶凝的样品获得的数值与交联百分比（通过 HPLC-MS分析计算）直接相关，假设在t 0的光聚合百分比是零。
[0163] 从图（图9)中将会看出，弹性模量G'（表示为Pa，在0,628rad/s)的趋势与交联 程度的趋势成比例；因此辐照更长时间的溶液交联更高，所以显示更佳的弹性性质，具有更 高的G'值。
[0164] 实施例22:对在由（9)制备的水凝胶的存在下的人成纤维细胞培养物细胞增殖的 评价。
[0165] 评价细胞增殖的标准方案涉及MTT试验的应用。简言之，所述试验定量测定培养 的细胞中琥珀酸脱氢酶活性的存在；仅存在于存活细胞的线粒体中的所述活性通常用作检 查培养的细胞的代谢活性、生存力和由此的生长的标志。该试验基于琥珀酸脱氢酶使唑鑰 染料MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基）2,5二苯基四氮唑溴化物）从黄至蓝的转化。分光 光度计测量的蓝色染料（甲If )的量与细胞培养物中存在的琥珀酸脱氢酶成比例，因此与 存活细胞的数量成比例。
[0166] 在以浓度20mg/mL或30mg/mL在溶液中的（9)的存在下（以增加的浓度（20、50、 100 y L))，或者在对照情况中仅为培养基，将混悬于适合的培养基中的人成纤维细胞（HF) 接种于24-孔多孔板中。将细胞（HF)用0. 5mg/mL MTT溶液在37°C孵育3小时。在孵育 的末尾，使用提取溶液（90%异丙醇、10% DMS0)从HF中提取染料，并在570nm的波长读取 (0D、光密度）。
[0167] 24h 后在 570nm 检测 0D 值（图 10)。
[0168] 图10显示由此制备的HA衍生物的溶液是无毒的，甚至在逐渐增加的量的情况下 如此，并且保持了细胞生存力。
[0169] 实施例23:评价在如实施例19所述制备的海绵上的人成纤维细胞增殖。
[0170] 将人成纤维细胞（HF)混悬物接种于如实施例19所述制备的海绵上，并转移至 24-孔板。接种后1小时，加入lmL培养基；在培养3和7天后进行MTT试验（图11)。
[0171] 对照由接种于24孔多空板的并仅用培养基处理的相同量的HF组成。
[0172] 从图（图11)中可以看出，接种于海绵的人成纤维细胞在3和7天培养后是活的、 能生存的和增殖的。它们的生存力是这样的以致诱导比对照更高的增殖；在3天后增殖的 百分比更佳，而且在7天后也是相当大的。这些结果清楚地证明了如本发明描述制备的海 绵不仅对细朐不具有仵何毒件，而目.实际h还促讲细朐增葙。应当知晓的是，在接种于海绵 上并且随后转移至孔中的过程中，许多细胞损失了，所以在图11中显示的增殖数值甚至是 更令人惊讶的。
[0173] 实施例24:以1:1的w/w比例添加胶原蛋白的源自（9)的溶液的水凝胶的制备。
[0174] 将600mg如实施例9中所述得到HA酯衍生物溶于20mL盐水中，得到30mg/mL的 浓度。溶液化完成后，在冰浴中通过逐渐加入〇. 05M HC1将pH调节至弱酸性值（pH ~ 4)。 然后加入预先制备的浓度60mg/ml的10mL来自马腱的胶原蛋白的酸溶液。在完全混合后， 将该溶液经〇. 2 y m过滤器微孔过滤，置于容器中，并在室温用波长300-380nm的光束辐照 3至15分钟。
[0175] 得到了在切割或操作后能保持其形状的紧密的水凝胶。
[0176] 实施例25:从已知浓度的（9)的溶液以1:1的w/w比例加入胶原蛋白来制备海绵。
[0177] 将400.0 mg如实施例9中所述得到的HA酯衍生物溶于20mL Milli-Q水中，得到 浓度20mg/mL的溶液。在完全溶液化后，在冰浴中通过逐渐加入0. 05M HC1将pH调节至弱 酸性值（pH ~ 4)。然后加入预先制备的浓度40mg/ml的10mL来自马腱的胶原蛋白的酸溶 液。在完全混合后，将该溶液经〇. 2 y m过滤器微孔过滤，并倾入直径5. Ocm的圆形玻璃盘 中。
[0178] 将该溶液冷冻干燥，并如实施例10中所述进行辐照。将得到的海绵浸入30mL盐水 溶液中不发生溶解或碎裂，甚至在与该含水溶液长时间接触（72-96h)后也不溶解或碎裂， 且具有与实施例20中描述的海绵类似的形状记忆性质。
[0179] 实施例26:从已知浓度的（9)的溶液以1:4的w/w比例加入胶原蛋白来制备海绵。
[0180] 将400.0 mg如实施例9中所述得到的HA酯衍生物溶于20mL Milli-Q水中，得到 浓度20mg/mL的溶液。在完全溶液化后，在冰浴中通过逐渐加入0. 05M HC1将pH调节至弱 酸性值（pH ~ 4)。然后加入预先制备的浓度160mg/ml的10mL来自马腱的胶原蛋白的酸溶 液。在完全混合后，将该溶液经〇. 2 y m过滤器微孔过滤，并倾入直径5. Ocm的圆形玻璃盘 中。
[0181] 将该溶液冷冻干燥，并如实施例10中所述进行辐照。将得到的海绵浸入30mL盐水 溶液中不发生溶解或碎裂，甚至在与该含水溶液长时间接触（72-96h)后也不溶解或碎裂。
[0182] 所述海绵保持与实施例20中描述的海绵的形状记忆性质，甚至在机械应力后保 持其结构和弹性。由于本文描述并证实的因素，本申请人旨在要求均具有形状记忆特性的 水凝胶和海绵，其由以下构成：通过醚键键合于PEG的伞形酮或苯基乙基酮，以及得到的产 物，所述产物还通过酯或酰胺键键合于透明质酸；其还旨在要求所述水凝胶的制备方法，其 包括将所述化合物溶液化，随后辐照获得的溶液，及海绵制备方法，其包括将所述起始化合 物溶液化，将得到的溶液冷冻干燥，随后进行辐照。水凝胶和海绵均适合用于医学、化妆品 和医学护肤品领域，单独使用或与药理学和/或生物学活性物质组合使用，或与细胞组合 使用。特别地，均适合用于以下特定的应用：
[0183] -骨关节炎和软骨损伤的关节内治疗，
[0184] -活性成分的释放，
[0185] -用于医药应用的对象的包衣，
[0186] -软组织的填充，
[0187] _防止术后粘连，和填充术后的深的形成腔洞的损害。
【主权项】
1. 透明质酸（HA)的光交联的衍生物，其由HA、作为三甘醇的聚乙二醇（PEG)双功能间 隔基和选自香豆素衍生物和苯基乙基酮的光反应性的化合物构成。2. 根据权利要求1的衍生物，其中所述香豆素衍生物选自伞形酮、七叶亭、东莨菪亭、 补骨脂素类、呋喃并香豆素类化合物和双香豆素，且优选是伞形酮。3. 根据前述权利要求中任意一项的衍生物，其中光反应性的化合物与双功能间隔基之 间的键是醚键。4. 根据前述权利要求中任意一项的衍生物，其中双功能间隔基与HA之间的键是酯或 酰胺键。5. 根据前述权利要求中任意一项的衍生物，其中HA具有40kDa至700kDa、优选160至 220kDa的重量-平均MW。6. 形状记忆水凝胶或形状记忆海绵形式的根据前述权利要求中任意一项的衍生物。7. 根据权利要求6的衍生物，其还包含药理学和/或生物学活性物质、诸如营养因子、 抗生素、留体和非留体抗炎药、蛋白质、肽、激素、血小板提取物或者分化的和/或未分化的 细胞。8. 如权利要求6中所要求的衍生物，其还包含胶原蛋白、优选天然胶原蛋白和/或水解 胶原蛋白。9. 包含透明质酸（HA)、作为三甘醇的聚乙二醇（PEG)双功能间隔基和选自香豆素衍生 物和苯基乙基酮的光反应性的化合物的可交联的等渗溶液，其中双功能间隔基与HA之间 的键是酯或酰胺键，且其中光反应性的化合物与双功能间隔基之间的键是醚键。10. 形状记忆水凝胶形式的根据权利要求1-8中任意一项的衍生物的制备方法，其包 括以下步骤： a. 形成三甘醇与香豆素衍生物或苯基乙基酮之间的醚键； b. 形成步骤a)中得到的产物和HA之间的酯或酰胺键，在酯键的情况中HA的最终衍生 程度为5至80mol%，在酰胺键的情况中HA的最终衍生程度为1至50mol% ; c. 将步骤b)中得到的产物溶液化，并通过波长300至450nm、优选320至380nm的UV 光将得到的等渗含水溶液辐照1分钟至24小时。11. 形状记忆海绵形式的根据权利要求1-8中任意一项的衍生物的制备方法，其包括 以下步骤： a. 形成三甘醇与香豆素衍生物或苯基乙基酮之间的醚键； b. 形成步骤a)中得到的产物和HA之间的酯或酰胺键，在酯键的情况中HA的最终衍生 程度为5至80mol%，在酰胺键的情况中HA的最终衍生程度为1至50mol% ; b'）将步骤b)中得到的产物在等渗含水溶液中溶液化，并将由此得到的等渗含水溶液 冷冻干燥； c?通过波长300至450nm、优选320至380nm的UV光将步骤b'）中得到的冻干产物辐 照1分钟至24小时。12. 如权利要求10-11中任意一项所要求的衍生物的制备方法，其还包括在HA辐照步 骤之前添加胶原蛋白的步骤。13. 用于骨关节炎和软骨损伤的关节内治疗的根据权利要求1-8的形状记忆水凝胶形 式的透明质酸的光交联的衍生物。14. 用于活性成分的释放、用于医药应用的对象的包衣、软组织的填充和防止术后粘连 的根据权利要求1-8的形状记忆水凝胶形式的透明质酸的光交联的衍生物。15. 用于填充术后的深的形成腔洞的损害的如权利要求1-8中所要求的形状记忆水凝 胶形式的透明质酸的光交联的衍生物。16. 用于骨关节炎和软骨损伤的关节内治疗的根据权利要求1-8形状记忆海绵形式的 透明质酸的光交联的衍生物。17. 用于活性成分的释放、用于医药应用的对象的包衣、软组织的填充和防止术后粘连 的根据权利要求1-8的形状记忆海绵形式的透明质酸的光交联的衍生物。18. 用于填充术后的深的形成腔洞的损害的如权利要求1-8中所要求的形状记忆海绵 形式的透明质酸的光交联的衍生物。19. 医学装置，其包含至少一种根据权利要求1-8中任意一项的光交联的衍生物。
【专利摘要】本发明公开了光交联透明质酸(HA)衍生物，其由HA、作为三甘醇的双功能聚乙二醇(PEG)间隔基和选自香豆素衍生物和苯基乙基酮的光反应性的化合物构成。
【IPC分类】C08B37/08, A61L27/38, A61L27/20, A61K31/728, A61L27/36
【公开号】CN104968375
【申请号】CN201480007375
【发明人】M·坎皮西, 鲁齐 O·德, R·本尼纳托, G·博尔萨托
【申请人】菲迪亚制药股份公司
【公开日】2015年10月7日
【申请日】2014年2月4日
【公告号】CA2900155A1, EP2953656A1, WO2014122580A1