用于血脑屏障运输的多肽的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明是关于试剂至脑的递送。更具体而言，本发明是关于可穿过血脑屏障（BBB) 的多肽及其在穿过BBB运输试剂中、通常在治疗和/或诊断神经疾病中的用途。
【背景技术】
[0002] BBB通过限制诸如细菌及大分子或亲水性分子等微观物体进入大脑组织中来起极 有效保护脑的作用。此在研发靶向中枢神经系统的药物时是所需考虑的主要问题。为到达 大脑组织中的靶细胞，经外周施用的药物必须能够藉助自身或通过使用载体作为运输系统 穿过BBB。BBB阻碍许多潜在的重要诊断及治疗剂递送至脑，且因此呈现诊断和/或治疗脑 病症的主要障碍。
[0003] 已采用众多种不同策略来帮助克服BBB所施加的限制，且这些策略大致分为三 类：1)侵入性程序（例如藉助手术直接心室内施用药物）；2)药理学方式（例如通过提高 多肽的脂溶性）；及3)基于载体的方式（即通过利用或改变穿过BBB运输药物的已知载体 机制来提供高特异性且有效的药物递送）。
[0004] 2007年，Demeule及同事设计出一系列能够穿过BBB的19聚体多肽[1]。显示这 些多肽中的最佳者（称为"血管肽（angiop印)-2"）经由涉及LDL受体相关蛋白（LRP1)的 结合机制[2]在脑细胞中展现转胞吞作用（分子穿过细胞内部进行运输），该LDL受体相关 蛋白是低密度脂蛋白受体（"LDLR"）家族的成员。
[0005] LDLR主要负责经由胞吞作用将携载胆固醇的粒子摄取至细胞中[3]。其一级配体 是5个能够运输包含胆固醇在内的不同脂肪分子的主要脂蛋白群中之一者的低密度脂蛋 白（LDL)。在人类中约65% -70%的血浆胆固醇是以LDL形式进行循环。每一 LDL粒子皆 含有单一载脂蛋白B100分子（ap〇B-100)，这些分子负责脂肪酸的循环，从而保持其在水性 血流环境中可溶。LDLR亦紧密结合至极低密度脂蛋白的含有多拷贝载脂蛋白E(apoE)的 0 _迀移形式（b-VLDL)。
[0006] LDLR是具有约840个氨基酸的模块化跨膜蛋白，其代表一整类通常表示为LDLR家 族的受体。每一 LDLR家族成员皆含有一或若干个以相似模式排列的以下结构域:A型LDL 受体（亦表示为"LA"、"CR"或"配体结合重复序列"）；表皮生长因子样（EGF样）及YWTD(或 0 _螺旋桨）模块（图1，[4])。LDLR的胞外结构域（图2, [4])在功能上分为2个区域： 由位于N末端的7个邻接LDL-A模块（LA1-LA7)组成的配体结合区域及与EGF前体同源的 随后区域。模块LA3至LA7为结合LDL所必需[5]。包含2个EGF样模块、一个0 -螺旋桨 结构域及第三EGF样模块的EGF区域负责LDL粒子在较低胞内pH下的释放及受体至细胞 表面的再循环二者。
[0007] 迄今为止，尽管已知此知识，但在寻找穿过BBB的运输剂时选择仍有限。业内仍需 要穿过BBB递送治疗及诊断剂的其他经改良试剂及方法。
【发明内容】
[0008] 本发明提供穿过BBB的多肽。因此，这些多肽是BBB运输剂。这些多肽在单独或 与治疗剂或诊断剂偶合时通常能够以治疗或诊断上有用或生理上显著的有效量穿过BBB。
[0009] 尽管本发明不受限于理论，但本发明多肽已经设计以结合LDLR中使本发明多肽 通过胞吞作用纳入脑中的LA结构域。鉴于能够穿过BBB，故本发明多肽尤其可用作穿过BBB 运输其他试剂并将试剂（通常为药物或诊断剂）递送至脑的载体。
[0010] 本发明提供穿过血脑屏障（BBB)的多肽，其中该多肽为以下各项、包括其、基本上 由其组成或由其组成：
[0011] (a)长度小于59个氨基酸的调节子多肽，其包括SEQ ID N0:2的7个或更多个连 续氨基酸，且包括K48及R49(相对于SEQ ID N0:1编号），任选地包括：（i)T43、V44、I45、 H46、G47 和 / 或（ii)E50、V51、T52、L53 及 H54(相对于 SEQ ID N0:1 编号）；任选地包括 P43及L55(相对于SEQ ID N0:1编号）；且任选地包括⑴？37、]\〇8、八39、1?40、￡41和/或
[11] H56、P57、D58 及 H59(相对于 SEQ ID N0:1 编号）；
[0012] (b)长度小于100个氨基酸的RAP多肽，其包括来自SEQ ID NO:4的至少20个连 续氨基酸；
[0013] (C)长度小于100个氨基酸的挠性多肽，其包括挠性环且其中该多肽包括以下序 列X 2 E X3 X4 X5 X6 R G K R X7 X8 X9 K D E X1(l 父^或尺 G K R X7 X8 X9 K D E，其中 Xi =A、F、S 或 T ;X2= G、K、R 或 S ;X 3= S 或 T ;X 4= N 或 S ;X 5= A、I 或 T ;X 6= I、T 或 V ;X 7 =D、E 或 G ;X8= S、T 或 Y ;X 9= F、T 或 Y ;X 1(l= G 或 N ;X n= K 或 R ;或
[0014] (d)长度小于100个氨基酸的刚性多肽，其包括a螺旋且包括以下共有序列：(K/ R) A (A/E/Q) K A (A/E/Q) A (K/R)，任选地包括 G D (A/E) a (K/R) A (A/E/Q) K A (A/E/Q) A (K/R) A XPG Y，其中任选地，。为1-10,且^为1-25。
[0015] 优选地，调节子多肽包括以下序列或由其组成：SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3。
[0016] 优选地，RAP多肽包括以下序列或由其组成：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO: 5或SEQ ID N0:6〇
[0017] 优选地，挠性多肽包括以下序列或由其组成：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO:10 或 SEQ ID NO:11。
[0018] 优选地，刚性多肽包括以下序列或由其组成：SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15 或 SEQ ID NO:16。
[0019] 亦提供包括与SEQ ID No. 2至16中的每一个具有至少85%、90 %或95 %序列同 一性的序列或由其组成的多肽。
[0020] 在一些实施方案中，多肽是以重组方式产生。在其他实施方案中，多肽是以化学方 式合成。
[0021] 本发明亦提供用于穿过血脑屏障（BBB)运输试剂的偶联物，其包括：(a)如上文所 阐述的多肽；及（b)试剂；其中该偶联物能够穿过BBB。
[0022] 在一些实施方案中，试剂为诊断剂或治疗剂。在一些实施方案中，多肽是经由连接 体偶联至试剂。在一些实施方案中，多肽直接偶联至试剂。在一些实施方案中，偶联物包括 纳米颗粒。在一些实施方案中，试剂可在运输穿过BBB后自多肽释放。
[0023] 本发明亦提供包括如前述实施方案中任一个的多肽或偶联物及药学上可接受的 载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。
[0024] 本发明亦提供如上文所定义的多肽、偶联物或药物组合物，其用于疗法中。在 一个实施方案中，治疗用途在于治疗神经疾病，任选地脑瘤、脑转移、精神分裂症、癫痫、 阿尔茨海默病（Alzheimer' s disease)、帕金森病（Parkinson' s disease)、亨廷顿病 (Huntington' s disease)、卒中和/或与BBB的功能障碍相关的疾病。
[0025] 本发明亦提供如上文所阐述的多肽、偶联物或药物组合物，其用于诊断方法中。在 一个实施方案中，诊断用途在于诊断神经疾病。
[0026] 本发明亦提供编码如上文所阐述的多肽的经分离的多核苷酸。
[0027] 附图简述
[0028] 参照下列图式来阐述本发明。
[0029] 图1:LDLR家族成员。
[0030] 图2 :LDLR的胞外结构域，其由7个配体结合重复序列（LA/CR)、3个EGF样模块及 一个螺旋桨单元构成。
[0031] 图3 :LDLR中的LA结构域折叠（PDB: 2FCW)
[0032] 图4 : LA-RAP (D3)界面（A-D)与其他LA模块界面的比较。
[0033] 图5 :血管肽的阶层式分群，其是基于一组针对每一构成AA定义的113种物理化 学性质。
[0034] 图6 :经由同源建模获得的血管肽-2的一般折叠。
[0035] 图7 :AP2结构的从头预测。
[0036] 图8 :AP2 (作为单一结构域结合剂）与LA模块之间可能的相互作用。
[0037] 图9 :AP2 (作为双结构域结合剂）与LA模块之间可能的相互作用。
[0038] 图10 :调节子根据其同源模型（PDB代码：3N40)的一般折叠。圆圈突出显示折叠 的结构化部分。
[0039] 图11 :调节子（作为单一结构域结合剂）与LA模块之间可能的相互作用。
[0040] 图12 :调节子（作为双结构域结合剂）与LA模块之间可能的相互作用。仅显示 第二结合区域。
[0041] 图13 :如在调节子整体模型中所观察到的调节子_构建体1的预测结构。
[0042] 图14 :藉助从头方法计算的调节子_构建体1的预测结构。
[0043] 图15 :调节子_构建体4在基于同源性的调节子模型上的预测结构。
[0044] 图16 :调节子_构建体4在藉助从头方法计算的模型上的预测结构。
[0045] 图17 :RAP D3结构域与LDLR之间的相互作用。
[0046] 图18 :RH_构建体1基于RAP-LDLR复合物晶体结构（2FCW)的模型。
[0047] 图19 :藉助从头方法计算的RH_构建体1的预测结构。
[0048] 图20 :RH_构建体2基于RAP-LDLR复合物晶体结构（2FCW)的模型。
[0049] 图21 :RH_构建体3基于RAP-LDLR复合物晶体结构（2FCW)的模型。
[0050] 图22 :活体外BBB模型的示意图，该模型涉及牛脑内皮细胞与星状细胞的共培养。
[0051] 图23 :条形图，其显示未经修饰的纳米颗粒不会穿过BBB，而经调节子（SEQ ID No. 1)修饰的纳米颗粒确实穿过BBB (NP =纳米颗粒）。
[0052] 图24 :条形图，其显示根据荧光标记肽活体外BBB模型穿过测试的穿过百分比。
[0053] 发明详述
[0054] 本发明是基于可穿过BBB的多肽的令人惊奇的鉴别。在鉴别可穿过BBB的新多肽 的尝试中，发明人选择低密度脂蛋白受体（LDLR)作为靶标且编译已知与LDLR的配体结合 ("LA"）结构域相互作用的所有多肽的数据库。发明人评价了所有这些多肽的结构及活性。 许多多肽-LDLR相互作用是使用不同实验条件来鉴别，但发明人能够鉴别出对能够与LDLR 的LA结构域相互作用且因此能够穿过BBB的多肽至关重要的结构及药效特征。
[0055] 为研发并完善结构及药效模型，发明人研宄了若干已知穿过BBB的肽（即血管肽， Demeule等人，参见上文）及调节子。已知这些血管肽通过与LDLR相互作用穿过BBB，但尚 未获得这些多肽的结构信息且因此发明人对血管肽建模以进行结构比较。亦已知调节子穿 过BBB且已知其结构，但未知调节子穿过BBB的机制。鉴于已鉴别出通过BBB所需要的关键 结构及药效特征，发明人研发出含有这些关键特征且因此亦能够穿过BBB的本发明多肽。
[0056] 本发明多肽共享共同特征。其皆能够穿过BBB，其皆是通过相同方法鉴别，且其皆 经设计以结合至LDLR的LA结构域。本发明多肽可分为四个亚群："调节子多肽"、"RAP多 肽"、"挠性多肽"及"刚性多肽"。本发明多肽通常包括下文所阐述的序列或由其组成。
[0057] 调节子多肽
[0058] HKKWQFNSPFVPRADEPARKGKVHIPFPLDNITCRVPMAREPTVIHGKREVTLHLHPDH(SEQ ID N0:1):调节子
[0059] 调节子能够穿过BBB。至今未知其结构及作用机制。
[0060] 通过使用P62包膜糖蛋白（论述于下文实例中）同源建模调节子序列，发明人发 现，调节子包括刚性发夹结构及非结构化挠性长链。发明人鉴别出发夹结构与 LDLR相互作用且发现此相互作用需要2种关键残基，即位于0 -发夹结构的U-小弯处的 K48及R49(相对于SEQ ID N0:1编号）。因此，本发明的调节子多肽包括K48及R49(相对 于SEQ ID NO: 1编号）。本发明的调节子多肽能够穿过BBB。此通过例如图23来显示，该 图展示使用如图22中所绘示且如Cecchelli等人，Adv Drug Deliv Rev. 1999年4月5日； 36(2-3) : 165-178.(参考文献6)所阐述的BBEC/大鼠星状细胞共培养活体外模型，经调节 子（SEQ ID No. 1)修饰的纳米颗粒能够穿过BBB。图23亦证实未经修饰的纳米颗粒不会穿 过 BBB。
[0061] 全长调节子多肽长度为59个AA(SEQ ID N0:1)。本发明的调节子多肽是全长调 节子的片段，且因此其产生更容易且更廉价。而且，使用较短多肽来达成穿过BBB的相同或 较佳通过允许向患者施用更小重量的多肽。因此，本发明调节子多肽的长度小于59个氨基 酸，且因此可包括SEQ ID N0:1的以下数量的连续氨基酸：7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、 42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57 或 58 个。
[0062] 除K48及R49的外，本发明的调节子多肽优选包括（a)T43、V44、I45、H46及G47和 /或〇3)￡50、￥51、了52、153及册4(相对于3￡〇10勵 ：1编号），此乃因这些氨基酸残基参与 0 -发夹结构的形成。除K48及R49的外，本发明的调节子多肽优选包括（a)P42、T43、V44、 145、財6及647和/或〇3)￡50、￥51、了52、153、册4及1^55(相对于5￡〇10勵：1编号），此 乃因这些氨基酸残基帮助形成与LDLR的LA结构域相互作用的较大发夹结构基序。尽 管不受限于理论，但发明人认为此较大0 _发夹结构进一步改良与LDLR的相互作用。
[0063] 调节子_构建体1
[0064] PTVIHGKREVTLHL(SEQ ID N0:2):调节子 _ 构建体 1
[0065] 本发明的优选调节子多肽是"调节子_构建体1"（SEQ ID N0:2)。调节子_构建 体1是SEQ ID NO: 1中形成0 -发夹结构的14个氨基酸残基的片段。
[0066] 本发明亦提供调节子_构建体1的片段，其包括SEQ ID N0:2的7个或更多个连 续氨基酸，例如7、8、9、10、11、12或13个氨基酸残基，其中该片段包括K48及R49(相对于 SEQ ID N0:1编号），且保留穿过BBB的能力。
[0067] 其他优选片段缺少一或多个来自SEQ ID N0:2C端的氨基酸（例如1、2、3、4、5或 6个氨基酸）和/或一或多个来自SEQ ID N0:2N端的氨基酸（例如1、2、3、4、5或6个氨 基酸），同时保留穿过BBB的能力；且其中该片段包括SEQ ID N0:2的7个或更多个连续氨 基酸并包括K48及R49 (相对于SEQ ID NO: 1编号）。因此，调节子_构建体1的氨基酸片 段可包括具有SEQ ID N0:2以下数量的连续氨基酸残基的氨基酸序列：7、8、9、10、11、12或 13个。
[0068] 本发明的调节子多肽亦包含SEQ ID N0:2的变体。调节子_构建体1的变体通 常是由与SEQ ID N0:2具有以下同一性的氨基酸序列组成：85%或更大，例如85%、86%、 87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%〇
[0069] 调节子_构建体4
[0070] PMAREPTVIHGKREVTLHLHPDH(SEQ ID N0:3):调节子 _ 构建体 4
[0071] 本发明的另一优选调节子多肽是"调节子_构建体4"（SEQ ID N0:3)。调节子_ 构建体4是包括SEQ ID NO: 2的SEQ ID NO: 1的23个氨基酸残基的片段。由于额外残基 (相对于SEQ ID N0:2)形成平行链，且这些平行链形成可与LDLR相互作用的0 -折叠，故 确定SEQ ID N0:4尤其适宜。
[0072] 本发明亦提供调节子_构建体4的片段，其包括SEQ ID N0:3的7个或更多个连 续氨基酸，通常为7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个氨基酸残基，其 中该片段包括K48及R49(相对于SEQ ID N0:1编号），且保留穿过BBB的能力。
[0073] 优选地，除K48及R49的外，本发明的调节子_构建体4多肽包括（a)P37、M38、 A39、R40、E41、P42、T43、V44、I45、H46 及 G47 和 / 或（b)E50、V51、T52、L53、H54、L55、H56、 P57、D58 及 H59 (相对于 SEQ ID NO: 1 编号）。
[0074] 其他优选片段缺少一或多个来自SEQ ID N0:3C端的氨基酸（例如1、2、3、4、5、6、 7、 8、9、10或11个氨基酸）和/或一或多个来自SEQ ID N0:3N端的氨基酸（例如1、2、3、 4、5、6、7、8、9或10个氨基酸），同时保留穿过BBB的能力，且其中该片段包括SEQ ID N0:3 的7个或更多个连续氨基酸并包括K48及R49 (相对于SEQ ID NO: 1编号）。因此，调节子 _构建体4的片段可包括具有SEQ ID N0:3以下数量的连续氨基酸残基的氨基酸序列：7、 8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22 或 23 个。
[0075] 本发明的调节子多肽亦包含SEQ ID N0:3的变体。调节子_构建体4的变体通 常是由与SEQ ID N0:3具有以下同一性的氨基酸序列组成：85%或更大，例如85%、86%、 87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%〇
[0076] RAP 多肽
[0077] MAPRRVRSFLRGLPALLLLLLFLGPWPAASHGGKYSREKNQPKPSPKRESGEEFRMEKLNQLWEKAQRL HLPPVRLAELHADLKIQERDELAWKKLKLDGLDEDGEKEARLIRNLNVILAKYGLDGKKDARQVTSNSLSGTQEDGL DDPRLEKLWHKAKTSGKFSGEELDKLWREFLHHKEKVHEYNVLLETLSRTEEIHENVISPSDLSDIKGSVLHSRHTE LKEKLRSINQGLDRLRRVSHQGYSTEAEFEEPRVIDLWDLAQSANLTDKELEAFREELKHFEAKIEKHNHYQKQLEI AHEKLRHAESVGDGERVSRSREKHALLEGRTKELGYTVKKHLQDLSGRISRARHNEL(SEQ ID N0:48):受体 相关蛋白
[0078] 已知受体相关蛋白（在本文中称为RAP、SEQ ID NO:48)能够藉助其D3结构域结 合至LDLR且已对RAP蛋白实施一些结构研宄。已知RAP与LDLR之间的相互作用是经由与 2个A型LDL受体（LA)模块相互作用的2个RAP a -螺旋来发生。单一 a -螺旋含有相互 作用的必需残基（包含K256)，而认为另一螺旋稳定复合物。发明人研发出3种新RAP多 肽，其称为"冊_构建体1"（3￡〇10勵 :4)、"冊_构建体2"（3￡〇10勵:5)及"冊_构建体 3"（SEQ ID N0:6)。发明人将RH_构建体1鉴别为穿过BBB的核心片段。因此，"RH_构建 体2 "及"RH_构建体3 "包括"RH_构建体1"的序列。"RH_构建体3 "亦包括"RH_构建体 2"。
[0079] 本发明的RAP多肽是全长RAP的片段，且因此产生容易且廉价。而且，使用较短多 肽来达成穿过BBB的相同或较佳通过允许向患者施用更小重量的多肽。本发明RAP多肽 的长度小于 100 个氨基酸，其长度通常为 99、98、97、96、95、90、89、88、87、86、85、84、83、82、 81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、 56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、 31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16 或 15 个氨基酸。
[0080] 本发明的RAP多肽形成a -螺旋，且能够穿过BBB。
[0081] RH_ 构建体 1
[0082] ELKHFEAKIEKHNHYQKQLE(SEQ ID N0:4) :RH_ 构建体 1
[0083] RH_构建体1 (SEQ ID NO:4)是RAP的20个氨基酸残基的片段，其鉴别为RAP-D3 与LDLR相互作用的最小单元。
[0084] 本发明的RAP多肽亦包含SEQ ID N0:4的变体。SEQ ID N0:4的变体优选是由与 SEQ ID N0:4具有以下同一性的氨基酸序列组成：85%或更大，例如85%、86%、87%、88%、 89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%〇
[0085] RH_ 构建体 2
[0086] DKELEAFREELKHFEAKIEKHNHYQKQLEIAHEKLRHAESV(SEQ ID N0:5) :RH_ 构建体 2
[0087] 本发明的另一优选RAP多肽是RH_构建体2。RH_构建体2 (SEQ ID NO: 5)是RAP 的41个氨基酸残基的片段，其包括SEQ ID NO: 4且进一步利于形成a-螺旋。
[0088] 本发明的RH_构建体2多肽包括SEQ ID N0:4的20个或更多个连续氨基酸，通常 为 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39 或 40 个氨基酸残 基。
[0089] 其他优选片段缺少一或多个来自SEQ ID N0:5C端的氨基酸（例如1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13或14个氨基酸）和/或一或多个来自SEQ ID N0:5N端的氨基酸（例 如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、