14、15、16或17个氨基酸），同时保留穿过888的能 力，且其中该片段包括SEQ ID N0:4的20个或更多个连续氨基酸。
[0090] 本发明的RAP多肽亦包含SEQ ID N0:5的变体。RH_构建体2的变体通常是由与 SEQ ID N0:5具有以下同一性的氨基酸序列组成：85%或更大，例如85%、86%、87%、88%、 89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%〇
[0091]RH_ 构建体 3
[0092]DKELEAFREELKHFEAKIEKHNHYQKQLEIAHEKLRHAESV⑶GERVSRSREKHALLEGRTKELGYTVK KHLQDLSGRISRARH(SEQIDN0:6) :RH_ 构建体 3
[0093] 本发明的另一优选RAP多肽是RH_构建体3。RH_构建体3(SEQIDNO: 6)是RAP 的84个氨基酸的片段，其包括SEQIDNO: 5 (且因此亦包括SEQIDNO: 4)。RH_构建体3 包含包括2个a-螺旋的RAPD3结构域的大部分。除RH_构建体2多肽的a-螺旋（包 含与LDLR相互作用所必需的残基）外，RH_构建体3包括与LDLR相互作用且稳定复合物 的含有Arg296的第二a-螺旋。
[0094] 本发明的RH_构建体3多肽包括SEQIDN0:4的20个或更多个连续氨基酸，通常 为 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、 45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、 70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80 或 81 个氨基酸残基。
[0095] 其他优选片段缺少一或多个来自SEQIDN0:6C端的氨基酸（例如1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13或14个氨基酸）和/或一或多个来自SEQIDN0:6N端的氨基酸（例 如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、 29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、 54、55、56、57、58、59或60个氨基酸），同时保留穿过BBB的能力，且其中该片段包括SEQID NO:4的20个或更多个连续氨基酸。
[0096] 本发明的RAP多肽亦包含SEQIDN0:6的变体。RH_构建体3的变体通常是由与 SEQIDN0:6具有以下同一性的氨基酸序列组成：85%或更大，例如85%、86%、87%、88%、 89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%〇
[0097] 挠性多肽
[0098]"挠性多肽"包括挠性环。发明人在"AP2双结合剂模型"中鉴别出与LDLR的LA结 构域相互作用的特征（参见下文实例）。本发明的挠性多肽含有这些特征且与LDLR的LA 模块相互作用。
[0099] 发明人将"RGKRX7X8X9KDE"基序鉴别为对与LDLR的LA结构域的相互作用至关重 要，且因此本发明的挠性多肽包括氨基酸序列：
[0100]XiX2EX3X4X5X6RGKRX7X8X9KDEX10Xn(SEQIDN0:23);或
[0101]RGKRX7X8X9KDE(SEQIDNO:24)
[0102] 其中：
[0103] ?Xi优选与位置14处的氨基酸形成疏水性分子内相互作用以促进双倍Kunitz型 折叠。
[0104] ?x2优选具有形成挠性环的高倾向。
[0105] ?E促进与LA模块R103的H-键合的分子间相互作用。
[0106] ?x3优选是具有形成挠性环的高倾向的极性残基。
[0107] ?x4优选是具有形成挠性环的高倾向的极性残基。
[0108] ?X5优选促进与LA模块V106的疏水性分子间相互作用。
[0109]?X6优选促进与LA模块T126的疏水性分子间相互作用。
[0110] ? R G K R视为与LA模块相互作用所必需。
[0111] ? X7优选具有形成挠性环的高倾向。
[0112] ? X8优选是具有形成挠性环的高倾向的极性残基。
[0113] ? X9优选促进与氨基酸疏水性分子内相互作用以促进双倍Kunitz型折叠。
[0114] ? K是视为与LA模块相互作用所必需的AP2残基。
[0115] ? D促进与LA模块Q104的H-键合的分子间相互作用。
[0116] ? E是视为与N端分子内相互作用并促进双倍Kunitz型折叠所必需的AP2残基。
[0117] ? X1(l优选是具有形成挠性环的高倾向的极性残基。
[0118] ? 选是与LA模块的D110形成H-键合的分子间相互作用的极性残基。
[0119] 优选地，Xf A、F、S 或 T
[0120] X2=G、K、R 或 S
[0121] X3=S或T
[0122] X4=N 或 S
[0123] X5=A、I 或 T
[0124] X6=I、T 或 V
[0125] X7=D、E 或 G
[0126] X8=S、T 或 Y
[0127] X9=F、T 或 Y
[0128] X1(I=G 或 N
[0129] Xn=K 或 R
[0130] 本发明的挠性多肽可包括3￡〇10勵:24以及（5￡〇10勵:23的）乂 1\￡乂3乂4父5 x6 X1(l和/或X n中之一或多个。本发明的挠性多肽可包括：
[0131] X2 E X3 X4 X5 X6 R G K R X7 X8 X9 K D E X10 Xn (SEQ ID NO: 25)
[0132] E X3 X4 X5 X6 R G K R X7 X8 X9 K D E X10 Xn(SEQ ID NO:26)
[0133] X3 X4 X 5 X6 R G K R X7 X 8 X9 K D E X10 Xn(SEQ ID NO:27)
[0134] X4 X5 X 6 R G K R X7 X8 X 9 K D E X10 Xn (SEQ ID NO: 28)
[0135] X5 X6 R G K R X7 X8 X9 K D E X10 Xn(SEQ ID NO:29)
[0136] X6 R G K R X7 X 8 X9 K D E X10 Xn (SEQ ID NO: 30)
[0137] R G K R X7 X8 X 9 K D E X10 Xn (SEQ ID NO: 31)
[0138] X: X2 E X 3 X4 X 5 X6 R G K R X7 X 8 X9 K D E X10(SEQ ID NO:32)
[0139] X2 E X 3 X4 X 5 X6 R G K R X7 X8 X 9 K D E X10(SEQ ID NO:33)
[0140] E X3 X4 X5 X6 R G K R X7 X8 X9 K D E X10(SEQ ID NO:34)
[0141] X3 X4 X 5 X6 R G K R X7 X 8 X9 K D E X10(SEQ ID NO:35)
[0142] X4 X5 X 6 R G K R X7 X8 X 9 K D E X10(SEQ ID NO:36)
[0143] X5 X6 R G K R X7 X 8 X9 K D E X10(SEQ ID NO:37)
[0144] X6 R G K R X7 X 8 X9 K D E X10(SEQ ID NO:38)
[0145] R G K R X7 X8 X 9 K D E X10(SEQ ID NO:39)
[0146] X: X2 E X 3 X4 X 5 X6 R G K R X7 X 8 X9 K D E(SEQ ID NO:40)
[0147] X2 E X 3 X4 X 5 X6 R G K R X7 X8 X 9 K D E(SEQ ID NO:41)
[0148] E X3 X4 X5 X6 R G K R X7 X8 X9 K D E(SEQ ID NO:42)
[0149] X3 X4 X5 X6 R G K R X7 X8 X9 K D E(SEQ ID NO:43)
[0150] X4 X5 X6 R G K R X7 X 8 X9 K D E(SEQ ID NO:44)
[0151] X5 X6 R G K R X7 X8 X9 K D E(SEQ ID NO:45)
[0152] X6 R G K R X7 X8 X9 K D E(SEQ ID NO:46)
[0153] R G K R X7 X8 X9 K D E(SEQ ID N0:47)。
[0154] 较短多肽产生廉价且容易。而且，使用较短多肽来达成穿过BBB的相同或较佳通 过允许向患者施用更小重量的多肽。
[0155] 本发明挠性多肽的长度小于100个氨基酸，其长度通常为99、98、97、96、95、90、 89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、 64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、 39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、 14、13、12、11或10个氨基酸。优选地，本发明挠性多肽的长度为15-24(即15、16、17、18、 19、20、21、22、23或24)个氨基酸，更优选为18-21个氨基酸（即18、19、20或21个氨基 酸）。
[0156] 最优选地，本发明挠性多肽的长度为19个氨基酸。
[0157] 本发明的挠性多肽亦包含上文所列示的挠性多肽的变体。本发明的挠性多肽通 常是由与上文所列示挠性多肽中之一或多个具有以下同一性的氨基酸序列组成：85%或更 大，例如 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、 99%〇
[0158] 优选地，本发明的挠性多肽包括以下各项或由其组成：SEQ ID N0:7、8、9、10或11 及其片段或变体。
[0159] 本发明的优选刚性多肽是SEQ ID N0:7( "挠性_1"）、SEQ ID N0:8( "挠性_2"）、 SEQ ID N0:9( "挠性 _3"）、SEQ ID N0:10( "挠性 _4"）或 SEQ ID N0:11( "挠性 _5"）及 其片段和/或变体。
[0160] "挠性 _1"
[0161] TGESNTVRGKRGSYKDEN R(SEQ ID N0:7):挠性 _1
[0162] 在一些实施方案中，本发明的挠性多肽（i)由SEQ ID N0:7组成；（ii)包括氨基 酸序列 SEQ ID N0:7 ;(iii)与 SEQ ID N0:7 具有至少 85%的同一性，即 85%、86%、87%、 88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%;和/或（^)含有5￡0 ID N0:7的10个或更多个连续氨基酸，g卩10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个连续氨基 酸。本发明挠性_1多肽的长度小于100个氨基酸。
[0163] "挠性 _2"
[0164] FRESNTIRGKRETTKDEN R(SEQ ID N0:8):挠性 _2
[0165] 在一些实施方案中，本发明的挠性多肽（i)由SEQ ID N0:8组成；（ii)包括氨基 酸序列SEQ ID N0:8;(iii)通常与SEQ ID N0:8具有至少85%的同一性，优选与SEQ ID 勵:8具有至少91%的同一性，即91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%;和/ 或（iv)含有SEQ ID N0:8的9个或更多个连续氨基酸，即9、10、11、12、13、14、15、16、17、18 或19个连续氨基酸。本发明挠性_2多肽的长度小于100个氨基酸。
[0166] "挠性 _3"
[0167] TKETSATRGKRETTKDEG K(SEQ ID N0:9):挠性 _3
[0168] 在一些实施方案中，本发明的挠性多肽（i)由SEQ ID N0:9组成；（ii)包括氨基 酸序列SEQ ID N0:9;(iii)通常与SEQ ID N0:9具有至少85%的同一性，优选与SEQ ID 勵:9具有至少91%的同一性，即91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%;和/ 或（iv)含有SEQ ID N0:9的9个或更多个连续氨基酸，即9、10、11、12、13、14、15、16、17、18 或19个连续氨基酸。本发明挠性_3多肽的长度小于100个氨基酸。
[0169] "挠性 _4"
[0170] ARETSIVRGKRDYFKDEG K(SEQ ID N0:10):挠性 _4
[0171] 在一些实施方案中，本发明的挠性多肽（i)由SEQ ID N0:10组成；（ii)包括氨基 酸序列 SEQ ID N0:10 ;(iii)与 SEQ ID 勵:7具有至少85%的同一性，即85%、86%、87%、 88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%;和/或（^)含有5￡0 ID N0:10的9个或更多个连续氨基酸，即9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个连续氨 基酸。本发明挠性_4多肽的长度小于100个氨基酸。
[0172] "挠性 _5"
[0173] SSESNITRGKREYTKDEG R(SEQ ID N0:11):挠性 _5
[0174] 在一些实施方案中，本发明的挠性多肽（i)由SEQ ID N0:11组成；（ii)包括氨 基酸序列SEQ ID NO: 11 通常与SEQ ID NO: 11具有至少85%的同一性，优选与SEQ ID N0:11 具有至少 90%的同一性，即 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、 99% ;和/或（iv)含有SEQ ID N0:11的10个或更多个连续氨基酸，g卩10、11、12、13、14、 15、16、17、18或19个连续氨基酸。本发明挠性_5多肽的长度小于100个氨基酸。
[0175] 刚性多肽
[0176] 发明人所鉴别的适用于BBB运输的又一组多肽称为"刚性多肽"。本发明的"刚性 多肽"如此命名的原因在于，其二级结构包括a -螺旋且其设计是基于RAP-LA复合物的共 结晶。鉴于已鉴别出RAP的主要相互作用基序（论述于下文实例中），发明人进而分析了此 基序以提供能够穿过BBB的其他多肽。本发明的刚性多肽代表优于全长RAP的改良，此乃 因其更短且因此产生廉价且容易。而且，使用较短多肽来达成穿过BBB的相同或优选通道 允许向患者施用更小重量的多肽。
[0177] 本发明的刚性多肽包括具有以下共有序列的氨基酸序列或由其组成：
[0178] (K/R)A(A/E/Q)K A (A/E/Q) A (K/R)
[0179] 优选地，本发明的刚性多肽包括具有以下共有序列的氨基酸或由其组成：
[0180] G D(A/E)a (K/R)A(A/E/Q)K A (A/E/Q) A (K/R) A XPG Y
[0181] 其中优选地，。为1-10,且p为1-25
[0182] 本发明刚性多肽的长度小于100个氨基酸，其长度通常为99、98、97、96、95、90、 89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、 64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、 39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、 14、13、12、11或10个氨基酸。本发明刚性多肽的长度优选为10-45个氨基酸，即10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、 38、39、40、41、42、43、44 或 45 个氨基酸。
[0183] 本发明的刚性多肽亦包含上文所列示的刚性多肽的变体。本发明的刚性多肽优选 由以下氨基酸序列组成：与上文所列示刚性多肽之一或多个具有95%或更大的同一性，例 如至少95%、96%、97%、98%、98.5%或99%的同一性。
[0184] 本发明的优选刚性多肽是选自由以下组成的群：SEQ ID N0:12( "刚性_1"）、SEQ ID N0:13( " 刚性 _2"）、SEQ ID N0:14( " 刚性 _3"）、SEQ ID N0:15( " 刚性 _4"）或 SEQ ID N0:16 ( "刚性_5"）及其片段和/或变体。
[0185] "刚性 _1"
[0186] GDAAAAKAAKAAAKAAADGY(SEQ ID N0:12):刚性 _1
[0187] "刚性_1"多肽（SEQ ID NO: 12)鉴别为单一结构域结合剂（即可与LDLR的单一 LA模块相互作用）。在一些实施方案中，本发明的刚性多肽（i)由SEQ ID N0:12组成；（ii) 包括氨基酸序列SEQ ID NO: 12; (iii)通常与SEQ ID NO: 12具有至少85%的同一性，优选 与5￡〇10勵：12具有至少95%的同一性，即95%、96%、97%、98%、99%;和/或（^)含 有SEQ ID N0:12的16个或更多个连续氨基酸，即16、17、18、19或20个连续氨基酸。本发 明刚性_1多肽的长度小于100个氨基酸（如上文所论述）。
[0188] "刚性 _2"
[0189] GDAAAARAAKAAARAAADGY(SEQ ID N0:13):刚性 _2
[0190] "刚性_2"多肽（SEQ ID NO: 13)鉴别为单一结构域结合剂。在一些实施方案中， 本发明的刚性多肽⑴由SEQ ID N0:13组成；（ii)包括氨基酸序列SEQ ID N0:13 通常与SEQ ID NO: 13具有至少85%的同一性，优选与SEQ ID NO: 13具有至少95%的同一 性，即95%、96%、97%、98%、99%;和/或（^)含有5￡〇10勵：13的11个或更多个连续 氨基酸，g卩11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续氨基酸。本发明刚性_2多肽的长度 小于100个氨基酸（如上文所论述）。
[0191] "刚性 _3"
[0192] GDAAAAKAAKAAAKAAAAAAKAAKAAAKAAADGY(SEQ ID N0:14):刚性 _3
[0193] "刚性_3"多肽（SEQ ID NO: 14)鉴别为双结构域结合剂（即可同时与LDLR的两 个LA模块相互作用）。在一些实施方案中，本发明的刚性多肽（i)由SEQ ID N0:14组成； (ii)包括氨基酸序列SEQ ID NO: 14; (iii)与SEQ ID NO: 14具有至少85%的同一性，即 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% ;和 /或（iv)含有SEQ ID勵:14的7个或更多个连续氨基酸，即7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33 或 34 个连续氨基酸。本发明 刚性_3多肽的长度小于100个氨基酸（如上文所论述）。
[0194] "刚性 _4"
[0195] GDAAEAKAEKAEAKAEAAEAKAEKAEAKAAAEGY(SEQ ID N0:15):刚性 _4
[0196] "刚性_4"多肽（SEQ ID NO: 15)鉴别为双结构域结合剂。在一些实施方案中，本 发明的刚性多肽（丨）由3￡〇10勵:15组成；出）包括氨基酸序列5￡〇10勵:15;(也）与 SEQ ID N0:15 具有至少 85% 的同一性，即 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% ;和 / 或（iv)含有 SEQ ID N0:15 的 7 个或更多个 连续氨基酸，B卩 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、 29、30、31、32、33或34个连续氨基酸。本发明刚性_4多肽的长度小于100个氨基酸（如上 文所论述）。
[0197] "刚性 _5"
[0198] GDAAEAKAQKAQAKANAAKAKAQKAQAKAAANGY(SEQ ID N0:16):刚性 _5
[0199] "刚性_5"多肽（SEQ ID NO: 16)鉴别为推定的双结构域结合剂。在一些实施方 案中，本发明的刚性多肽（i)由SEQ ID N0:16组成；（ii)包括氨基酸序列SEQ ID N0:16 ; (iii)与 SEQ ID NO: 16 具有至少 85% 的同 一1性，g 卩 85 %、86 %、87 %、88 %、89 %、90 %、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%;和/或（^)含有5￡0 1〇吣：16的7 个或更多个连续氨基酸，即 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、 26、27、28、29、30、31、32、33或34个连续氨基酸。本发明刚性_5多肽的长度小于100个氨 基酸（如上文所论述）。
[0200] 用于穿过血脑屏障的分析
[0201] 本发明的多肽及偶联物可穿过BBB。BBB可是活体内或可是离体或活体外BBB模 型，如业内已知。测试多肽或偶联物是否可穿过BBB的分析亦为业内所熟知。
[0202] 本领域技术人员将了解，使用大脑源细胞的适宜活体外BBB模型包含：（i)经分 离脑微血