。
[0274] 本发明的药物组合物亦可包含医药上可接受的抗氧化剂。医药上可接受的抗氧化 剂的实例包含：（1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、偏亚硫酸 氢钠、亚硫酸钠及诸如此类；（2)油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基苯 甲醚（BHA)、丁基化羟基甲苯（BHT)、卵磷脂、没食子酸丙醋、a-生育酚及诸如此类；及（3) 金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸（EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸及诸如此类。
[0275] 组合物可包含温度保护剂。可将液体温度保护剂添加至组合物中以降低其冰点， 例如使冰点降低至〇°C以下。因此，该组合物可储存在0°C以下但在其冰点以上，以抑制热 崩解。温度保护剂亦容许冷冻组合物同时保护矿物盐辅剂免于冷冻及解冻后的聚结或沉 降，且亦可在高温（例如40°C以上）下保护组合物。适宜温度保护剂应对人类施用安全、容 易与水混溶/可溶于水且不应破坏组合物中的其他组份。实例包含甘油、丙二醇和/或聚 乙二醇（PEG)。适宜PEG可具有介于200-20, OOODa范围内的平均分子量。在优选实施方案 中，聚乙二醇可具有约300Da的平均分子量（'PEG-300'）。
[0276] 通过灭菌程序及通过包含各种抗细菌及抗真菌剂（例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁 醇、苯酚、山梨酸及诸如此类）二者可确保防止微生物存在。亦可期望这些组合物中包含等 渗剂，例如糖、氯化钠及诸如此类。
[0277] 可使用例如以下不同种类赋形剂的组合使多肽及偶联物于制剂中稳定：（1)二糖 (例如蔗糖、海藻糖）或多元醇（例如山梨醇、甘露醇）通过优先排除起稳定剂作用且亦能 够起冻干期间的低温保护剂作用，（2)表面活性剂（例如聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20) 通过最小化界面（如液体/冰、液体/材料表面和/或液体/空气界面）上蛋白的相互作 用起作用，及（3)缓冲液（例如磷酸盐、柠檬酸盐、组氨酸）有助于控制并维持制剂pH。因 此，除本发明的方法外，可使用这些二糖多元醇、表面活性剂及缓冲液来进一步稳定本发明 的多肽及偶联物并防止例如其聚集。
[0278] 无菌可注射溶液可通过以下步骤来制备：将所需量的活性化合物纳入具有上文所 列示的一种成份或成份的组合（视需要）的适宜溶剂中，然后进行无菌微滤。通常，通过将 活性化合物纳入含有基本分散介质及来自那些上文所列举者的所需其他成份的无菌载体 中来制备分散液。在使用无菌粉末来制备无菌可注射溶液的情形下，优选制备方法是真空 干燥及冷冻干燥（冻干），其可自其先前经无菌过滤的溶液产生由活性成份加任一期望额 外成份构成的粉末。
[0279] 可偶联至本发明多肽以产生单一剂型的试剂的量将根据所治疗个体及具体施用 模式而变化。通常，该量将是产生治疗效应的量。通常，以100%计，此量将介于约0.01% 至约99 %活性成份范围内，优选约0. 1 %至约70 %、最优选约1 %至约30 %的多肽或偶联物 与药学上可接受的载体的组合。
[0280] 医学用途及治疗方法
[0281] 本发明的多肽及偶联物可用于疗法中。具体而言，其可用于将治疗剂递送至脑。欲 治疗的疾病将根据本发明多肽所运输的治疗剂而定，但脑疾病优选。因此，可治疗的疾病包 含神经疾病，任选地脑瘤、脑转移、精神分裂症、癫痫、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、 卒中和/或与BBB的功能障碍相关的疾病。
[0282] 剂量及施用
[0283] 调节剂量方案以提供最佳期望反应（例如治疗反应）。举例而言，可施用单一浓 注剂，可经一段时间施用若干分开剂量或可如治疗状况紧急程度所指示按比例减少或增加 剂量。以剂量单元形式来调配肠胃外组合物尤其有利于方便施用及剂量一致性。如本文所 使用的剂量单元形式是指适于作为单一剂量用于欲治疗个体的物理离散单位；各单位含有 产生期望治疗效应的预定量的多肽或偶联物以及所需医药载体。本发明剂量单位形式的 规格取决于且直接依赖于下列因素：(a)多肽或偶联物的独特特征及欲达成的具体治疗效 应，及（b)复合该多肽或偶联物以治疗个体敏感性的技术中的固有限制条件。
[0284] 另一选择为，本发明的多肽或偶联物可以持续释放制剂形式来施用，在该情形下 需要较不频繁的施用。剂量及频率根据施用患者的多肽或偶联物的半衰期而变化。施用的 剂量及频率可根据治疗为预防性抑或治疗性而变化。在预防应用中，以相对较不频繁的间 隔经长时间段施用相对较低的剂量。一些患者在其余生中持续接受治疗。在治疗应用中， 有时需要在相对较短的间隔下相对较高的剂量直至减缓或终止疾病进展，且优选直至患者 显示疾病症状的部分或完全改善。此后，可向患者施用预防方案。
[0285] 本发明药物组合物中多肽或偶联物的实际剂量值可变化以便获得可有效达成对 具体患者有期望治疗反应的量的活性成份、组合物及施用模式，而对患者无毒。所选剂量值 将根据多种药物代谢动力学因素而定，包含所采用的本发明具体组合物的活性、施用途径、 施用时间、所采用多肽或偶联物（或试剂）的排泄速率、治疗的持续时间、与所采用的多肽 或偶联物组合使用的其他药物、化合物和/或材料、所治疗患者的年龄、性别、体重、病况、 一般健康情况及先前病史以及已为医疗业内所熟知的类似因素。
[0286] 本发明多肽或偶联物的"治疗有效量"优选可降低疾病症状的严重程度，增加无疾 病症状期的频率及持续时间或预防因感病性所致的损伤或残疾。
[0287] 本发明的组合物可使用业内已知多种方法中之一或多个经由一或多个施用途径 来施用。如本领域技术人员应了解，给药途径和/或模式应根据期望结果而变化。优选施 用途径包含颅内、鼻内、眼内、静脉内、肌内、真皮内、腹膜内、皮下、脊柱或其他肠胃外施用 途径，例如通过注射或输注。如本文所使用的词组"肠胃外施用"意指除经肠及局部施用外 的施用模式，通常通过注射，且包含（但不限于）静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心 内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外及胸骨 内注射及输注。
[0288] 另一选择为，本发明的多肽或偶联物可经由非注射用途径施用，例如局部、表皮或 黏膜施用途径，例如经鼻内、经口、经阴道、经直肠、舌下或局部。
[0289] 本发明的多肽及偶联物能够穿过血脑屏障。因此，这些多肽及偶联物通常是经由 需要穿过BBB的通道的途径施用，即外周施用。需要穿过BBB的通道的常用施用途径是静 脉内、肌内、动脉内及腹膜内。
[0290] 多肽或偶联物可利用保护化合物免于快速释放的载体来制备，例如控制释放制 剂，包含植入物、经皮贴片及微囊封递送系统。可使用生物可降解的生物兼容聚合物，例 如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯及聚乳酸。许多用于制备这些制剂 的方法已获得专利权或通常已为那些本领域技术人员所知。例如，参见Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson 编辑，Marcel Dekker 公司， New York, 19了8。
[0291] 本发明的多肽、偶联物或药物组合物可利用业内已知的医学装置来施用。
[0292] 诊断用途及诊断方法
[0293] 本发明的多肽及偶联物可用于诊断中。具体而言，其可用于将诊断剂递送至脑。欲 诊断或监测的疾病将根据本发明多肽所运输的诊断剂而定，但脑疾病优选。因此，可诊断或 监测的疾病包含神经疾病，任选地脑瘤、脑转移、精神分裂症、癫痫、阿尔茨海默病、帕金森 病、亨廷顿病、卒中、和/或与BBB的功能障碍相关的疾病。
[0294] 核酸
[0295] 本发明亦提供包括编码本发明多肽的核酸（例如核酸组合、载体或载体组合）的 组合物。本发明亦提供包括编码本发明偶联物（尤其其中试剂为多肽）的核酸（例如核酸 组合、载体或载体组合）的组合物。
[0296] 核酸可经优化以改良表达。
[0297] 编码本发明多肽或偶联物的核苷酸序列可根据遗传密码来设计。因此，在本发明 的上下文中，该核苷酸序列可编码一或多条本文所揭示的多肽序列。
[0298] 本发明亦提供可与这些核酸杂交的核酸。杂交反应可在具有不同"严谨性"条件 下实施。增加杂交反应严谨性的条件为业内众所周知并公开（例如[13]的第7. 52页）。 相关条件的实例包含（按严谨性递增的顺序）：培育温度为25°〇、371：、501：、551：及68°〇； 缓冲液浓度为 10XSSC、6XSSC、1XSSC、0. 1XSSC(其中 SSC 为 0? 15M NaCl 及 15mM 柠檬酸 盐缓冲液）及其使用其他缓冲液系统的等效物；甲酰胺浓度为〇%、25%、50%及75% ;培 育时间为5分钟至24小时；1、2或更多个洗涤步骤；洗涤培育时间为1、2、或15分钟；及洗 涤溶液为6XSSC、1XSSC、0. 1XSSC或去离子水。杂交技术及其优化为业内所熟知[7、8、9 等]。
[0299] 核酸可在低严谨性条件下与靶标杂交；在其他实施方案中，其在中等严谨性条件 下杂交；在优选实施方案中，其在高严谨性条件下杂交。低严谨性杂交条件的实例性设定为 50°C及10XSSC。中等严谨性杂交条件的实例性设定为55°C及1XSSC。高严谨性杂交条件 的实例性设定为68°C及0. 1 X SSC。
[0300] 本发明包含包括编码本发明多肽或偶联物的核酸序列的互补序列的核酸（例如 用于反义或探测或用作引物）。
[0301] 本发明核酸可采用多种形式（例如单链、双链、载体、引物、探针、标记等）。本发明 核酸可为环形或具有支链，但通常将为直链。除非另外指明或需要，否则本发明中利用核酸 的任何实施方案既可利用双链形式亦可利用构成该双链形式的两条互补单链形式中的每 一个。引物及探针与反义核酸一样通常为单链。
[0302] 优选提供呈以下形式的编码本发明多肽或偶联物的核酸：呈纯化或实质上纯化形 式，即实质上不含其他核酸（例如不含天然核酸），尤其不含宿主细胞核酸，通常为至少约 50%纯（以重量计），且通常至少约90%纯。
[0303] 编码本发明多肽或偶联物的核酸可以许多方式整体或部分地制备，例如通过化学 合成（例如DNA的亚磷酰胺合成），通过使用核酸酶（例如限制酶）消化较长核酸，通过连 接来自基因组或cDNA文库等的较短核酸或核苷酸（例如使用连接酶或聚合酶）。
[0304] 术语"核酸"在一般意义上包含任何长度核苷酸的聚合形式，这些核酸含有脱氧核 糖核苷酸、核糖核苷酸和/或其类似物。其包含DNA、RNA、DNA/RNA杂合体。其亦包含DNA 或RNA类似物，例如那些含有经修饰骨架（例如多肽核酸（PNA)或硫代磷酸酯）或经修饰 碱基者。因此，本发明包含mRNA、tRNA、rRNA、核糖酶、DNA、cDNA、重组核酸、具有支链的核 酸、质体、载体、探针、引物等。在本发明核酸采用RNA形式时，其可具有或可不具有5'帽。
[0305] 编码本文所阐述的多肽或偶联物的核酸可是载体的一部分。
[0306] 术语"补体"或"互补"当对于核酸使用时是指Watson-Crick碱基配对。因此，C的 补体是G，G的补体是C，A的补体是T (或U)，且T (或U)的补体是A。亦可使用诸如I (肌 苷嘌呤）等碱基来互补例如嘧啶（C或T)。
[0307] 编码本发明多肽或偶联物的核酸可用于例如：产生多肽；作为杂交探针用于检测 生物样品中的核酸；产生核酸的额外拷贝；产生核糖酶或反义寡核苷酸；作为单链DNA引物 或探针；或作为三链形成寡核苷酸。
[0308] 本发明提供用于产生编码本发明多肽或偶联物的核酸的方法，其中核酸是使用化 学方式部分或整体地合成。
[0309] 本发明提供包括编码本发明多肽或偶联物的核苷酸序列的载体（例如克隆或表 达载体）及经这些载体转化的宿主细胞。
[0310] 如本文所使用，术语"优化"意指核苷酸序列已经改变以使用密码子编码氨基酸 序列，这些密码子优选用于产生细胞或有机体，通常为真核细胞，例如毕赤酵母属（Pichia) 细胞、中国仓鼠卵巢细胞（CH0)或人类细胞。优化核苷酸序列经改造以完全或尽可能多地 保留最初由起始核苷酸序列（亦称为"亲代"序列）编码的氨基酸序列。本文亦设想这些 序列在其他真核细胞中的优化表达。由优化核苷酸序列编码的氨基酸序列亦视为优化。
[0311] 序列同一性
[0312] 就序列比较而言，一个序列通常将用作参考序列与测试序列进行比较。当使用序 列比较算法时，将测试序列及参考序列输入计算机中，必要时指定子序列坐标，并指定序列 算法程序参数。可使用默认程序参数，或可指定其他参数。然后，序列比较算法将基于程序 参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分数。在比较两条序列的同一性时，这 些序列不必邻接，但任何空位将产生罚分，此会降低整体同一性百分数。对于blastn，预设 参数为空位开放罚分=5及空位延伸罚分=2。对于blastp，预设参数为空位开放罚分= 11及空位延伸罚分=1。
[0313] 本文中所指的序列同一性百分数是分别根据以下文献中所阐述的BLAST算法 来测定：Altschul 等人，Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977 ;及 Altschul 等人，J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990。用于实施BLAST分析的软件可经由国家生物技术信息中心 (National Center for Biotechnology Information)公开获得。BLASTN 程序（对于核 苷酸序列）使用以下各值作为默认值：字长（W) 11、预期值（E) 10、M = 5、N = -4及两条 链的比较值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用以下各值作为默认值：字长3及预期值 (E) 10 以及 BL0SUM62 分值矩阵（参见 Henikoff 及 Henikoff，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989)比对⑶50、预期值（E) 10、M = 5、N =-4及两条链的比较值。
[0314] 概述
[0315] 如在本文件中所使用的术语"氨基酸序列"应包含对本文所揭示的每一序列及其 片段、同源物、衍生物及变体的提及。
[0316] 术语"包括"涵盖"包含"以及"由……组成"，例如"包括"X的组合物可唯一地由 X组成或可包含额外物项，例如X+Y。
[0317] 术语"由……组成"意指"包含且限于"。
[0318] 术语"基本上由……组成"意指组合物、方法或结构可包含额外成份、步骤和/或 部分，但仅在这些额外成份、步骤和/或部分在材料上不变更所主张组合物、方法或结构的 基本及新颖特征时如此。
[0319] 术语"约"关于数值x意指x± 10%。
[0320] 除非另有说明，否则本发明实践将采用本领域技术人员已知的常规化学、生物化 学、分子生物学、免疫学及药理学方法。这些技术于文献中充分解释。参见[10-17]。
[0321] 现将参照以下非限制性实例来进一步阐述本发明。 实施例
[0322] LA-相互作用多肽数据库的编译
[0323] 为编译LA-相互作用多肽数据库，发明人收集了已知能够与LDLR家族成员的LA 结构域相互作用的所有多肽的结构信息。
[0324] 这些结构数据允许发明人推导出化学实体与LA结构域相互作用必须具有的重要 特征。考虑下列LDLR家族成员（参见图1):
[0325] 1.LDLR(低密度脂蛋白受体）是所有家族成员的原型；
[0326] 2. VLDLR (极低密度脂蛋白受体）；
[0327] 3. Ap〇ER2 (载脂蛋白E-受体2,亦称为LRP8);
[0328] 4. MEGF7 (表皮生长因子样蛋白7,亦称为LRP4);
[0329] 5. LRP1 (LDL受体相关蛋白1，亦称为LRP);
[0330] 6.LRP1B(LDL 受体相关蛋白 1B);
[0331] 7.LRP2(LDL受体相关蛋白2,亦称为巨蛋白（Megalin))。
[0332]
[0333]
[0335] 表1 :LDLR-家族LA结构域的相互作
用伴侣[参考文献18、19、20、21、22、23、24、 25、26、27、28、29、30及31]。*单一或双结合剂代表同时与配体相互作用的LA模块的数目。
[0336] 在表1中我们报告每一 LDLR家族成员的所有结合伴侣（配体），此可参见文献。 与LDLR成员的LA模块相互作用的配体的群在本文中称为"LA-相互作用多肽数据库"。
[0337] 重要相互作用模式的合理化
[0338] 对于LDLR家族的相互作用伴侣LA结构域发现的信息可分为2部分：一部分是关 于活性数据且另一部分是关于结构信息。
[0339] 在文献中，极少数活性数据集是使用相当实验条件获得，且因此通常不推荐使用 这些数据来建立预测模型。然而，发明人能够提取并利用来自这些结构数据的某些重要信 息。
[0340] 发明人发现这些结构数据非常不均一：
[0341] ?一些配体仅结合至单一 LA结构域，而一些其他配体与2个模块建立相互作用 (利用亲合力效应）。
[0342] ?一些配体（例如小血管肽多肽）与初级结构彼此靠近定位的残基相互作用，而其 他配体与彼此距离极远且构成氨基酸序列的不同部分的残基相互作用。
[0343] ?一些配体与挠性结构区域（例如环）相互作用，而其他配体与刚性结构区域（例 如a -螺旋）相互作用。
[0344] 尽管发现LA-相互作用多肽数据库中的配体非常不均一，但发明人令人惊奇地发 现，所有LDLR家族成员的所有LA模块的折叠高度保守。举例而言，发明人发现，复合物中 介于LDLR的2个LA结构域之间的LA4模块与受体相关蛋白（RAP)共结晶，如Fisher及同 事所阐述[21](参见图3)。每一 LA模块具有位于N末端附近的短0 -发夹、3个二硫键及 高度保守的钙结合位点。钙离子藉助4个高度保守的酸性残基（D147、D151、D157、E158)侧 链及2个骨架羰基（W144及D149)配位于八面体几何结构中[32]。所有这些酸性基团与 芳香族残基（LA4上的W144及LA3上的F105) -起普遍存在于以高亲和力结合至RAP的所 有LRP1LA模块对中[33]。在所研宄复合物的所有结构中，主要结合要素在于强静电相互作 用，其中在带正电荷的赖氨酸（配体）与保守酸性基团之间形成多个H-键，从而在钙离子 周围形成带负电荷的冠（受体）。此外，受体中的保守芳香族残基利用疏水性相互作用稳 定于赖氨酸链的非极性区域中，如Blacklow综述[34]中对若干相互作用蛋白伴侣所显示 (参见图4)。
[0345] 与LA结构域形成H-键或疏水性相互作用的所有配体残基的完整列表显示于表2 中。具有表2条目的结构具有2个相互作用结构域。（例如：2FCW代表RAP与LDLR的LA4 结构域之间的相互作用，而2FCW2代表RAP与同一受体的LA3结构域之间的相互作用）。
[0346]
[0347] 表2 :与LA结构域形成H-键或疏水性相互作用的配体的残基。具有上标*的残 基为与LA模块的高度保守的酸性冠系统复合的必需赖氨酸。具有上标**的残基为长链 H-键供体残基。具有上标的残基与受体的W144形成疏水性相互作用。具有上标4勺残 基与L143形成疏水性相互作用。具有上标#的残基与P150形成疏水性相互作用。标记有 " (b) "的疏水性相互作用仅涉及骨架原子。
[0348] 在表3中将所观察到的最为保守的药效特征系统化。
[0349]
[0350] 表3 :最为保守的药效特征.*这些残基相对于参考2FCW中的那些略有移位。
[0351] 2. 3能够穿过BBB的已知多肽的建模
[0352] 除自相互作用多肽数据库收集的信息外，发明人亦分析了已知能够穿过BBB的多 肽。具体而言，发明人选择研宄血管肽及调节子。未获得这些多肽的结构信息，且因此发明 人建立模型来处理这些多肽。
[0353] 在2007年由Demeule及同事[1、2]介绍的血管肽是迄今为止唯一已知能够利用 涉及LDLR的机制穿过BBB的多肽。已知调节子多肽穿过BBB。
[0354] 血管肽
[0355] 抑肽酶是含有Kunitz型结构域的LRP及LRP2的6500-Da蛋白酶抑制剂配体。血 管肽是显示高于抑肽酶的转胞吞作用能力的源自Kunitz结构域的多肽家族。在表4中，发 明人报告不同血管肽的转胞吞作用及分布体积值。发明人将血管肽-2 (AP2)鉴别为最有希 望的多肽，此乃因其具有良好转胞吞作用水平及较高实质/总脑分布体积比率。
[0356] 对于这些多肽的每一构成AA，这些多肽的第一分析的实施考虑Cai及同事[35]所 报导的113种物理化学性质。然后使用聚合式阶层式分群方法以下列方式对多肽分群：
[0357] ?将每一 AA之间的相异性计算为113维空间中的正规化欧几里德距离（euclidean distance)〇
[0358] ?将每一多肽之间的距离计算为处在相同位置的AA之间的距离的和。
[0359] 分群结果显示于图5中。发明人发现，这些多肽可分为3个主群：(A)血管肽5及 8;?)血管肽76、78、79、4?2、4?1、4?5、4?7 ;及（〇血管肽90及91。仅使用44物理化学 性质获得的此分群反映转胞吞作用的显著变化：群（A)具有低转胞吞作用百分比；群（B) 具有中等值（但对于API。AP5及AP7的数据丢失）；群（C)具有最高转胞吞作用值。
[0360]
[0361] 表4:血管肽多肽的分布体积*这些值是根据原始公开案图来推断。
[0362] 对不同氨基酸对转胞吞作用的效应的其他理解在传统上自结构分析获得，但目前 尚未获得血管肽的结构信息。因此，发明人使用抑肽酶的结晶Kunitz结构域作为模板遵循 同源模型策略建立了血管肽的假设结构（PDB代码2ZJX)。与血管肽AP2的比对显示于下文 中，其仅因同源建模程序的功能而丢失最后一个氨基酸（Y):
[0363] AP2 1 TFFYGGSRGKRNNFKTEE 18
[0364] 2ZTX A32 TFVTGGARAKBNNFKSAE 49
[0365] 发明人出于以下原因选择抑肽酶作为模板：
[0366] ?获得72%的序列同一性，此远高于同源建模的常用临限值35%。
[0367] ?存在两个赖氨酸（其可能为与LDLR相互作用所必需）。
[0368] ?潜在地充分定向并暴露与LDLR结合所必需的残基。
[0369] 通过同源建模获得的AP2的一般折叠显示于图6中。
[0370] 使用用于折叠预测的从头方法[36、37、38]来确认AP2的同源模型。发明人发现， 此从头模型给出与同源模型相似的折叠（参见图7)。
[0371] 在使用同源建模时，除AP2外，其他血管肽亦显示Kunitz样折叠。基于这些结果， 发明人提出血管肽具有Kunitz样折叠。
[0372] 对AP2-LDLR相互作用建模
[0373] 然后发明人对AP2与LDLR之间的相互作用建模。考虑到两种主要假设：(A)AP2 作为LDLR的单一结构