丙氨酸数目越少，多肽具有a -螺旋结构的机会越低。
[0517] ?丙氨酸残基越多，多肽不溶的可能性越大。
[0518] 荧光标iP,的肽活体外BBB樽塑穿讨测试
[0519] 材料及设备
[0520] 材料
[0521] -Ringer-Hepes 缓冲液（RH 缓冲液）：
[0522] NaCl 150mM ;KCL 5. 2mM ;CaCl22. 2mM ;MgCl20. 2mM ;NaHC036mM ;Ifepes 5mM ;葡萄糖 2. 8mM。调节至pH 7. 2-7. 4且经由0. 22 ym过滤器孔径过滤。
[0523] -DMEM/F12
[0524] -荧光黄-CH，Sigma，参考编号 L0259
[0525] 设备
[0526] -细胞培养物培育器（37°C，加湿气氛，95%空气及5% C02)
[0527] -无菌细胞培养柜
[0528] -具有盖子的Millicell 24孔接收机托盘，Millipore参考编号PSMW010R5。
[0529] -Corning 96孔固体黑色平底聚苯乙稀TC处理的微量板。
[0530] -水浴，37°C
[0531] -抽吸系统
[0532] -自动微量移液器
[0533] _荧光剂
[0534] 活体外BBB模型的建立
[0535] 如图22中所阐释实施共培养方法。将混合神经胶细胞的小鼠初代培养物接种于 24孔板上且将牛脑内皮细胞培养于存于另一板中的胶原包覆的插入物上。3天后，将插入 物移动至含有星状细胞的板中且再培养3天。为评价活体外BBB的完整性，在实验当天测 量转内皮电阻（TEER)。高于200 D /cm2的TEER值视为可接受。
[0536] 过滤测试
[0537] 随后实施以下程序以测试膜是否可防止肽自上隔室穿过至下隔室。在20μg/ml 焚光团下在插入物的腔室侧施加肽且置于填充有Ringer-Hepes缓冲液（Ringer-Hepes缓 冲液的组成是如上文所阐述）的孔中。培育lh后，收集来自上及下隔室的样品且使用荧光 剂测量。两个隔室中的肽浓度相等指示肽的扩散不受膜的限制。
[0538] 穿过测试程序
[0539] 在DMEM/F12培养基中在20 y g/ml的最终荧光团浓度下制备每一测试肽溶液（将 以一式三份研宄的每一条件考虑在内）。使用经荧光标记的不规则肽样品作为阴性对照。 将20 yM荧光黄（LY)添加至每一样品中。LY是呈现低大脑渗透的亲水性小分子，且因此其 内皮渗透系数揭露内皮细胞单层的完整性。选择与测试肽所携载的荧光标记的Em/Ex光谱 兼容的分子示踪剂至关重要以防止FRET样事件。
[0540] 将插入物移动至每孔含有0. 8ml培养基的新24孔板，且在37°C下加热。将400 y 1 预热样品溶液添加至每一插入物中。收集每一溶液的等份试样（t = 0上），储存在4°C下， 且防止其暴露于光以及培养基（t = 0下）。在37°C及5% C02下培育60min后收集上及下 溶液（t = 60上及t = 60下）。
[0541] 将来自每一条件（测试肽及阴性对照）的所有样品（t = 0上、t = 0下、t = 60 上及t = 60下）平铺于黑色96孔微量板以及相应标准曲线中。使用多孔板读数器测量荧 光。
[0542] 然后实施肽的质量平衡以检查可能的吸收或累积现象。质量平衡值给出实验结束 时所回收化合物的百分比，且如下文所显示来计算：
[0543]
[0544] 渗透率计算
[0545] 亦测定LY及所测试肽的内皮渗透系数值。使用清除率原理获得非浓度依赖型运 输参数。通过用所运输化合物的量除以供体室浓度及所计算的总清除体积来计算培育时间 之间清除体积的增量，如下文所显示：
[0546]
[0547] [C] 1代表初始腔室示踪剂/肽浓度，[C] a代表近腔室示踪剂/肽浓度，且Va代表 近腔室的体积。在实验期间，清除体积随时间以线性方式增加。针对时间绘制平均清除体 积，且通过线性回归分析估计斜率以提供估计的平均值及标准偏差。共培养清除率曲线的 斜率表示为PSt，其中PS代表渗透率X表面积产物（以微升/分钟表示）。仅覆盖有胶原的 过滤器的清除率曲线的斜率表示为PSf。如下文中所显示来计算内皮单层的PS值（PSe):
[0548]
[0549] 用PSe值除以过滤器的表_枳（对于细胞培养插入物milliCell24为0. 7cm2)以 产生内皮渗透系数（Pe，以厘米/分钟表示）。
[0550] 计算每一样品的LY Pe及测试肽/无规则肽Pe系数。若LY Pe系数值介于 0. 2-0. 8X l(T3cm. mirf1之间，则屏障在实验后视为完整且测试肽及对照的渗透率值主要归 因于跨细胞通量。
[0551] 结果
[0552] 使用此方法，荧光肽穿过模型BBB且具有下列百分比：
[0553]调节子
[0554] HKKWQFNSPFVPRADEPARKGKVHIPFPLDNITCRVPMAREPTVIHGKREVTLHLHPDH(SEQ ID N0:1)〇
[0555] BBB穿过百分比：3. 73 %
[0556] 调节子多肽
[0557] 序列：PTVIHGKREVTLHL(SEQ ID N0:2)
[0558] BBB 穿过百分比：11. 43%
[0559] RAP 多肽
[0560] 序列：ELKHFEAKIEKHNHYQKQLE(SEQ ID N0:4)
[0561] BBB穿过百分比：8. 27%
[0562] 桡件多肽
[0563] 序列：TGESNTVRGKRGSYKDENR(SEQ ID NO:7)
[0564] BBB穿过百分比：8. 17%
[0565] 刚件多肽
[0566] 序列：GDAAAAKAAKAAAKAAADGY(SEQ ID N0:12)
[0567] BBB穿过百分比：7. 51%
[0568] 这些数据以图表形式表示于图24中。
[0569] 结论
[0570] 发明人已研发出经受受体介导的BBB转胞吞作用的多肽。本发明多肽与试剂的偶 联使得可穿过BBB将试剂运输至脑中，此运输原本为BBB所排斥。本发明多肽与治疗剂和/ 或诊断剂的偶联使得可将治疗剂和/或诊断剂运输至脑，由此提供新的且经改良的治疗及 诊断可能性。
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【主权项】
1. 一种用于穿过血脑屏障（BBB)的多肽，其中该多肽是： (a) 长度小于59个氨基酸的调节子多肽，其包括SEQ ID N0:2的7个或更多个连续氨 基酸，且包括K48及R49 (相对于SEQ ID NO: 1编号）； (b) 长度小于100个氨基酸的RAP多肽，其包括来自SEQ ID NO:4的至少20个连续氨 基酸； (c) 长度小于100个氨基酸的挠性多肽，其包括挠性环且其中该多肽包括以下序列： X1 X2 E X3 X4 X5 X6 R G K R X7 X8 X9 K D E X10 X1^ R G K R X7 X8 X9 K D E 其中 X1= A、F、S 或 T ;X2= G、K、R 或 S ;X3= S 或 T ;X4= N或 S ;X5= A、I 或 T ;X6 = I、T 或 V ;X7= D、E 或G ;X8= S、T 或 Y ;X9= F、T 或 Y ;X1Q= G 或N J11= K或 R;或 (d) 长度小于100个氨基酸的刚性多肽，其包括a螺旋且包括以下共有序列： (K/R) A (A/E/Q) K A (A/E/Q) A (K/R)，任选地 G D(A/E)a (K/R)A(A/E/Q)K A (A/E/Q) A (K/R) A XpG Y 其中优选地，。为I至10,且^为I至25。2. 根据权利要求1 (a)所述的调节子多肽，包括： (&)(丨）了43、￥44、145、1146、647和/或（^)￡50、￥51、了52、153及册4(相对于5￡0 1〇 N0:1编号）；和任选地 (b) P43及L55 (相对于SEQ ID NO: 1编号）；和任选地 (c) (i)P37、M38、A39、R40、E41 和 / 或（ii)H56、P57、D58 及 H59(相对于 SEQ ID N0:1 编号）。3. 根据权利要求1所述的多肽，其中该多肽： (a) 是包括以下序列或由其组成的调节子多肽：SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:3; (b) 是包括以下序列或由其组成的RAP多肽：SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5或SEQ ID NO:6 ； (c) 是包括以下序列或由其组成的挠性多肽：SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、 SEQ ID NO:10 或 SEQ ID NO:11 ; (d) 是包括以下序列或由其组成的刚性多肽：SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15 或 SEQ ID NO:16。4. 根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中该多肽是以重组方式产生。5. 根据权利要求1至3中任一项所述的多肽，其中该多肽是通过化学合成产生。6. -种用于运输试剂穿过血脑屏障（BBB)的偶联物，其包括： (a) 根据前述权利要求中任一项所述的肽；及 (b) 试剂， 其中该偶联物能够穿过该BBB。7. 根据权利要求6所述的偶联物，其中该试剂为药物、多肽、酶、抗生素、抗癌剂、放射 性试剂、抗体、细胞毒素、可检测标记或抗血管生成化合物。8. 根据权利要求6或权利要求7所述的偶联物，其中该试剂是治疗剂。9. 根据权利要求8所述的偶联物，其中该试剂是小分子药物。10. 根据权利要求6或权利要求7所述的偶联物，其中该试剂是诊断剂，任选地其中该 诊断剂为染料、化学发光染料、放射性成像剂、金属螯合络合物、荧光标记、酶-底物标记、 抗体或其抗体片段。11. 根据权利要求6至10中任一项所述的偶联物，其中该多肽是经由连接体偶联至该 试剂。12. 根据权利要求6至10中任一项所述的偶联物，其中该多肽是直接偶联至该试剂。13. 根据权利要求6至12中任一项所述的偶联物，其包括纳米颗粒。14. 根据权利要求11至13中任一项所述的偶联物，其中该试剂可在运输穿过该BBB后 自该多肽释放。15. -种药物组合物，其包括：根据前述权利要求中任一项所述的多肽或偶联物，及药 学上可接受的载体。16. 根据前述权利要求中任一项所述的多肽、偶联物或药物组合物，其用于疗法中。17. 根据权利要求16所述的多肽、偶联物或药物组合物，其用于治疗神经疾病，任选地 脑瘤、脑转移、精神分裂症、癫痫、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、卒中和/或与BBB的 功能障碍相关的疾病。18. 根据前述权利要求中任一项所述的多肽、偶联物或药物组合物，其用于诊断方法 中。19. 根据权利要求18所述的多肽、偶联物或药物组合物，其用于诊断神经疾病。20. -种分离的多核苷酸，其编码根据权利要求1至5中任一项所述的多肽。
【专利摘要】本发明提供穿过血脑屏障(BBB)的多肽。因此，这些多肽是BBB运输剂。这些多肽在单独或与治疗剂或诊断剂偶合时通常能够以治疗上或诊断上有用或生理上显著的有效量穿过该BBB。
【IPC分类】C07K7/00, C07K14/00, A61K38/16, A61K38/04, A61K38/10
【公开号】CN104968359
【申请号】CN201380069981
【发明人】萨尔瓦多·博罗斯戈麦斯, 弗兰塞斯克·哈维尔·里韦罗蒙索, 安娜·卡斯坎特西雷拉
【申请人】萨吉堤斯生物技术有限公司
【公开日】2015年10月7日
【申请日】2013年11月14日
【公告号】CA2890704A1, EP2919798A1, WO2014076655A1