一种粒径单分散HbA1C离子交换色谱填料合成方法及其应用与流程

本发明属于离子交换色谱填料制备领域，特别是涉及一种粒径单分散hba1c离子交换色谱填料合成方法及其应用。

背景技术：

糖尿病是由血糖水平升高引起的一种慢性代谢紊乱性疾病，可导致多种并发症，如肾脏病、心脏病、神经损伤等。糖化血红蛋白是血红蛋白β链n末端缬氨酸的游离氨基与不同碳水化合物糖基化形成的一类糖化血红蛋白，合成过程缓慢、不可逆，且不受日常葡萄糖水平波动影响，因此是糖尿病诊断的标准之一。

其中，血红蛋白(hb)与糖未结合部分为hba0，结合部分为hba1，根据所结合的碳水化合物的不同，可分为hba1a1，hba1a2，hba1b及hba1c，其中hba1c约占hba1的80%(t.m.thevarajah,n.nani,y.y.chew.performanceevaluationofthearkrayadamsha-8160hba1canalyser[j].malaysjpathol,2008,30(2):81-86)，且其含量与血糖浓度含量呈明显的正相关，且可保持约120天，能直接反应糖尿病患者8-12周内的血糖控制情况。目前测定糖化血红蛋白含量的方法很多，主要包括电泳、离子交换色谱法，高效液相离子交换色谱法(hplc)，硼酸亲和层析法，免疫分析法和液质连用法等，其中hplc被国际临床化学和实验医学联合会作为检测糖化血红蛋白的“金标准”。

种子溶胀法是先利用乳液聚合合作无皂乳液聚合或者分散聚合方法制成小粒径单分散的聚合物种子,用可聚合单体、引发剂、交联剂等进行溶胀，是种子微球变大，然后再进行聚合，从而可以制得粒径单分散的的聚合物微球的方法。是目前可以稳定、大批量合成单分散聚合物微球的主要方法。而传统的悬浮聚合法、沉淀聚合法，分散聚合法等制备的微球粒径较大且分布过宽，难以直接用作色谱色谱领域，需要经过严格是筛分和沉淀处理，且批次之间相差较大，难以进行规模化生产，因此质量控制要求极其严格。

因此，针对以上问题研制出一种用于检测糖化血红蛋白的离子交换色谱填料是本领域技术人员所急需解决的难题。

技术实现要素：

为了解决以上技术问题，本发明提供一种粒径单分散hba1c离子交换色谱填料合成方法。为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：一种粒径单分散hba1c离子交换色谱填料合成方法，通过溶胶与油相乳液制备载体油相，

并采用聚合物种子溶胀法获得。进一步地，载体油相的组成成分以及各成分所占质量份数分别为：溶胶载体：35～55份、油相乳液：17～25份、填充组份：7～11份以及辅助组份：4～9份。进一步地，具体步骤如下：（1）载体油相的原料准备：称取油相单体、交联剂以及乳化剂，混合均匀后，乳化5～20min后获得油相乳液；取用溶胶载体，升温熔化后向其中添加油相乳液，搅拌均匀；同时称取填充组份以及辅助组份备用；（2）载体油相制备：向步骤（1）中添加有油相乳液的溶胶载体中加入填充组份以及辅助组份进行聚合，获得载体油相备用；（3）水相制备；取用稳定剂，加入离子水，升温溶解，待稳定剂完全溶解于去离子水中后，冷却至室温，获得水相；（4）油相溶胀：将步骤（2）中获得的载体油相加入到种子聚合物微球中，搅拌均匀，保持体系温度于14～85℃下0.5～2h，获得油相溶胀物；（5）引发剂溶胀：取用引发剂、乳化剂以及水进行混合，乳化5～20min后加入步骤（4）获得的油相溶胀物中；（6）聚合：将步骤（3）获得水相加入油相溶胀物中，搅拌均匀后升温至75～82℃，并保温10～40h；聚合结束后，冷却至室温获得聚合物微球；（7）清洗：将步骤（6）获得的聚合物微球抽干，并用溶剂清洗，获得粒径单分散hba1c离子交换色谱填料。进一步地，步骤（2）的具体步骤如下：（2-a）将添加有油相乳液的溶胶载体转移至预转化反应器中，进行初步聚合，生成包含油相乳液、溶胶载体以及载体溶胶的混合物；（2-b）对步骤（2-a）中的混合物进行分离，生成包含步骤（2-a）中混合物的65～92wt%的第一物流以及包含余量的第二物流；（2-c）向第二反应器中添加第一物流，进行进一步聚合，引起第一物流的相转化；（2-d）将步骤（2-c）中的相转化第一物流以及步骤（2-b）中获得的第二物流以25～33s^-1的剪切速率在静态混合机中混合，进行第二次相转化，生成胶状的初级载体油相；（2-e）对步骤（2-d）获得的初级载体油相进行熔胶，并加入填充组份以及辅助组份，搅拌形成载体油相流体，挤出后获得载体油相。进一步地，填充组份为聚合物填料，为聚甲基丙酸酯以及聚苯乙烯—二乙烯基苯中的任意一种或者两种的组合。进一步地，辅助组份的组成成分以及各成分所占质量份数分别为：固化剂：13～20份、增容剂：11～20份、分散剂：10～18份、流平剂：10～16份、稳定剂：10～15份、双氧水：10～15份以及磷酸铝液：8～12份。进一步地，油相单体包括第一单体、第二单体以及第三单体；第一单体为苯乙烯、甲基苯乙烯、乙基苯乙烯、氯甲基苯乙烯、丙烯酸甲酯、丙烯酸丙酯、丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸季戊四醇酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、丙烯酸缩水甘油酯以及甲基丙烯酸丁酯中的任意一种或者任意几种的组合；第二单体为丙烯酰胺、或者甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酸羟乙酯以及甲基丙烯酰胺中的任意一种或者任意几种的组合；第三单体为2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸；交联剂为二乙烯基苯、二丙烯苯、双甲基丙烯酸乙二醇酯、三乙烯酸甘油酯、三羟甲基丙基三甲基丙烯酸、季戊四醇三丙烯酸酯、二乙二醇二甲基丙烯酸酯、二缩三乙二醇二甲基丙烯酸酯、三缩四乙二醇二甲基丙烯酸酯、1,3-丁二醇二甲基丙烯酸酯、1,4-丁二醇二甲基丙烯酸酯六亚甲基双甲基丙烯酰胺、二乙烯基苯基甲烷、三甲基丙烯酸甘油酯、亚甲基丙烯酰胺中的任意一种或者任意几种的组合；乳化剂为离子型乳化剂。进一步地，稳定剂为聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、β-环糊精、β-甲基环糊精以及羟基磷灰石中的任意一种或者任意几种的组合。进一步地，引发剂为过氧化苯甲酰、过氧化二异丁腈、偶氮二异丁酸二甲酯以及偶氮二异丁基脒中的任意一种或者任意几种的组合。一种测定糖化血红蛋白含量的方法，使用粒径单分散hba1c离子交换色谱填料通过高效液相离子交换色谱法进行测定。本发明提供了一种粒径单分散hba1c离子交换色谱填料合成方法，创新地采用以溶胶为载体，结合油相乳液制备载体油相，采用聚合物种子溶胀法获得粒径单分散性离子交换色谱填料，具有优秀的稳定性、结合性以及可控性，避免现有通过后修饰法制备的离子交换色谱填料的离子交换容量难以控制的缺点，显著减少色谱填料对糖化血红蛋白的非特异性吸附作用；并且制备方法简单、整体可控性强，有助于实现规划化、批量化的生产。

附图说明

图1为本实施例1合成的粒径单分散hba1c离子交换色谱填料的sem图。

具体实施方式以下将结合具体实施例对本发明提供的技术方案进行详细说明，应理解下述具体实施方

式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例1：一种粒径单分散hba1c离子交换色谱填料合成方法，通过溶胶与油相乳液制备载体油相，

并采用聚合物种子溶胀法获得；载体油相的组成成分以及各成分所占质量份数分别为：溶胶载体：35～55份、油相乳液：17～25份、填充组份：7～11份以及辅助组份：4～9份；填充组份为聚合物填料，为聚甲基丙酸酯；辅助组份的组成成分以及各成分所占质量份数分别为：固化剂：13份、增容剂：20份、分散剂：10份、流平剂：16份、稳定剂：10份、双氧水：15份以及磷酸铝液：8份。

具体步骤如下：（1）载体油相的原料准备：称取油相单体、交联剂以及乳化剂，混合均匀后，乳化5～20min后获得油相乳液；取用溶胶载体，升温熔化后向其中添加油相乳液，搅拌均匀；同时称取填充组份以及辅助组份备用；

（2-a）将添加有油相乳液的溶胶载体转移至预转化反应器中，进行初步聚合，生成包含油相乳液、溶胶载体以及载体溶胶的混合物；（2-b）对步骤（2-a）中的混合物进行分离，生成包含步骤（2-a）中混合物的65～92wt%的第一物流以及包含余量的第二物流；（2-c）向第二反应器中添加第一物流，进行进一步聚合，引起第一物流的相转化；（2-d）将步骤（2-c）中的相转化第一物流以及步骤（2-b）中获得的第二物流以25～33s^-1的剪切速率在静态混合机中混合，进行第二次相转化，生成胶状的初级载体油相；（2-e）对步骤（2-d）获得的初级载体油相进行熔胶，并加入填充组份以及辅助组份，搅拌形成载体油相流体，挤出后获得载体油相；

（3）水相制备；取用稳定剂，加入离子水，升温溶解，待稳定剂完全溶解于去离子水中后，冷却至室温，获得水相；

（4）油相溶胀：将步骤（2）中获得的载体油相加入到种子聚合物微球中，搅拌均匀，保持体系温度于14～85℃下0.5～2h，获得油相溶胀物；

（5）引发剂溶胀：取用引发剂、乳化剂以及水进行混合，乳化5～20min后加入步骤（4）获得的油相溶胀物中；

（6）聚合：将步骤（3）获得水相加入油相溶胀物中，搅拌均匀后升温至75～82℃，并保温10～40h；聚合结束后，冷却至室温获得聚合物微球；

（7）清洗：将步骤（6）获得的聚合物微球抽干，并用溶剂清洗，获得粒径单分散hba1c离子交换色谱填料。

以上步骤（1）中油相单体包括第一单体、第二单体以及第三单体；第一单体为苯乙烯、甲基苯乙烯、乙基苯乙烯、氯甲基苯乙烯、丙烯酸甲酯、丙烯酸丙酯、丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸季戊四醇酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、丙烯酸缩水甘油酯以及甲基丙烯酸丁酯中的组合；第二单体为丙烯酰胺、或者甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酸羟乙酯以及甲基丙烯酰胺中的组合；第三单体为2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸；交联剂为二乙烯基苯、二丙烯苯、双甲基丙烯酸乙二醇酯、三乙烯酸甘油酯、三羟甲基丙基三甲基丙烯酸、季戊四醇三丙烯酸酯、二乙二醇二甲基丙烯酸酯、二缩三乙二醇二甲基丙烯酸酯、三缩四乙二醇二甲基丙烯酸酯、1,3-丁二醇二甲基丙烯酸酯、1,4-丁二醇二甲基丙烯酸酯六亚甲基双甲基丙烯酰胺、二乙烯基苯基甲烷、三甲基丙烯酸甘油酯、亚甲基丙烯酰胺的组合；乳化剂为离子型乳化剂。稳定剂为聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、β-环糊精、β-甲基环糊精以及羟基磷灰石中的组合。引发剂为过氧化苯甲酰、过氧化二异丁腈、偶氮二异丁酸二甲酯以及偶氮二异丁基脒中的组合。

通过本实施例所提供方法以及组分合成的粒径单分散hba1c离子交换色谱填料的sem图如图1所示。

实施例2：

本实施例提供了一种测定糖化血红蛋白含量的方法，通过使用实施例1中获得粒径单分散hba1c离子交换色谱填料，依靠高效液相离子交换色谱法进行测定。

最后需要说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制性技术方案，本领域的普通技术人员应当理解，那些对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。