无孔层析介质在病毒纯化上的应用的制作方法

1.本发明属于纯化领域，具体涉及无孔层析介质在病毒纯化上的应用。


背景技术：

2.随着基因工程、疫苗、细胞治疗等领域的迅速发展，越来越多的大的病毒或类病毒颗粒需要制备或半制备纯化。除了超滤手段外，层析分离纯化是最常用的方法来获得高纯度的病毒颗粒样品，包括离子交换层析、亲和层析、疏水层析等等。传统的制备或半制备层析介质填料都是多孔的微球，因为多孔微球材料的比表面积大因而可以对一般生物分子分离物提供较高的吸附载量。现有技术(prior art)层析介质的孔隙率(porosity)都大于20％，一般都介于30％-90％之间。这些层析介质的孔径一般都小于(通常都小于100纳米)的macropore或者mesopore。而很多病毒颗粒的粒径一般都大于20纳米，有的甚至都超过100纳米。由于体积排阻的原因，病毒颗粒无法扩散进入层析介质的孔内，(参考如journal of chromatgraphy a 2007，1142：2-12以及journal of chromatography a 2013，1297：96-105)，因而在层析吸附病毒颗粒时只有介质微球的外表面可以利用，孔内表面积由于体积排阻的原因而无法吸附病毒颗粒。然而，病毒样品中的杂质分子一般都比病毒小，因而可以扩散进入层析介质孔内被吸附在里面。由于传统层析介质孔内表面积远远大于介质微球外表面积，杂质吸附往往由于孔内表面积的存在而非常显著，吸附洗脱时杂质含量因而较高，病毒颗粒纯化效果往往不理想。


技术实现要素：

3.为解决以上问题，本发明公开了无孔层析介质在病毒纯化上的应用，该无孔层析色谱填料的粒径大于10微米，该介质填料中mesopore和macropore的孔隙率小于20％，较少吸附病毒中的杂质，因而经层析洗脱后得到的病毒样品的分离纯度显著提高。
4.为实现上述技术目的，本发明的技术方案是，一种无孔层析介质在病毒纯化上的应用，所述无孔层析介质的粒径≥10微米，且，所述无孔层板介质的孔隙率小于20％。孔隙率是指介质中含有孔的体积占介质微球的总体积的百分比。
5.优选的，所述无孔层析介质的粒径≥15微米。
6.优选的，所述无孔层板介质的孔隙率小于10％。
7.优选的，所述无孔层析介质应用于病毒、类病毒颗粒、以及类似病毒尺寸的超大型生物分子的层析分离纯化。
8.优选的，所述无孔层析介质的层析功能包括离子交换、亲合、疏水。
9.优选的，所述无孔层析介质的基质可以是合成聚合物，也可以是天然聚合物。
10.优选的，所述合成聚合物包括但不限于聚酯、聚醚、聚苯乙烯-二乙烯基苯、聚酰胺，所述天然聚合物包括但不限于琼脂糖、纤维素。
11.如前在背景技术中所述，现在用于制备或半制备纯化病毒或类病毒颗粒的层析介质填料都是多孔的微球，这是因为多孔微球材料的比表面积大，因而可以对一般生物分子
分离物提供较高的吸附载量。但是其缺陷是在层析吸附病毒颗粒时只有介质微球的外表面可以利用，介质孔内表面积由于体积排阻而无法吸附病毒颗粒。而病毒样品中的杂质分子一般都比病毒小，因而可以扩散进入层析介质孔内进而被吸附在介质孔里面。由于多孔层析介质的孔内表面积远远大于介质微球外表面积，杂质吸附往往由于孔内表面积的存在而非常显著，从而使得吸附洗脱时杂质含量较高，病毒颗粒纯化效果往往不理想。
12.本发明采用粒径大于10微米的无孔层析色谱填料，这些介质填料没有显著的mesopores(中孔)或者macropores(大孔)，介质填料中mesopore和macropore的孔隙率小于20％，小于10％更优。(根据国际纯粹与应用化学协会(iupac)的定义，孔径小于2纳米的称为微孔；孔径大于50纳米的称为大孔macropores；孔径在2到50纳米之间的称为介孔或者中孔mesopores)。和现有技术层析介质相比，本发明所用的无孔层析填料由于没有大量只能容纳杂质进入而病毒颗粒无法扩散进入的孔，病毒颗粒在介质外表面的层析吸附量虽然不会有明显变化，但样品中的杂质被层析吸附的量会显著减少。因此经无孔层析填料层析洗脱后，病毒样品的分离纯度显著提高。
13.填料的粒径和孔态影响层析色谱分离性能。分辨率和填料的粒径的平方根成反比，粒径越小分辨率越好。但是，层析色谱的反压却是和填料粒径的平方成反比，粒径减小，反压以平方指数增加。填料的孔径和孔隙率则对色谱分效率和载量有重要影响。一般来说，孔径越大、孔隙率越低，填料内的传质效果越好，分辨率越高，但是载量却会越低。由于分析型的色谱分离对分辨率要求很高，而对高反压和低载量通常可以接受。因此分析型色谱填料可以采用小粒径(通常2-10微米)低孔隙率甚至无孔的填料。例如，tosoh公司的tsk-gel q-stat色谱柱以及thermofisher公司的propac系列分析柱是用粒径小于10微米的无孔色谱填料。但是，以制备纯化(preparative purification)为目的层析分离填料通常粒径都大于10微米，这是因为常规制备型层析柱的耐压无法承受用10微米以下粒径层析填料所带来的高反压。另外，制备纯化型层析介质对载量的要求很高，因为介质的高载量可以提高制备纯化的生产效率。基于这些原因，现有技术的层析介质都是粒径大于10微米、含有大量mesopore和macropore的多孔型树脂，因为这些多孔树脂有很大的孔内表面积提供高载量的层析吸附。而大粒径的无孔层析纯化介质则在现有技术(prior arts)中未曾有过。病毒及疫苗等超大型生物分子的制备纯化中所用的层析介质在现有技术中也无一例外都还是采用传统的多孔层析介质。本发明打破了常规的惯性思维，用无孔的制备型层析介质来纯化病毒颗粒，并发现无孔层析介质比传统的多孔层析介质更能提供高纯度的病毒颗粒。
14.本发明的层析介质可采用包括离子交换、亲和、疏水等常规层析作用模式。本发明的层析介质基质可以是合成聚合物类(包括聚甲基丙烯酸酯、聚苯乙烯、聚醚、聚酰胺等等)，也可以是天然聚合物类(包括琼脂糖、纤维素等等)。本发明的层析介质适用的纯化应用对象是各种病毒或类病毒颗粒以及类似尺寸的超大生物分子。
15.在本专利中，层析介质、层析填料、色谱填料、微球等，均指用于层析分离纯化的球状材料。
16.本发明提供了粒径≥10微米且孔隙率小于20％的无孔层析介质在病毒纯化上的应用，纯化应用对象是各种病毒或类病毒颗粒以及类似尺寸的超大生物分子。由于本发明无孔层析介质的孔隙率低，较少吸附病毒中的杂质，因而经本发明无孔层析介质层析洗脱后得到的病毒样品的分离纯度显著提高，使纯化效率大大提高。
附图说明
17.图1是多孔层析介质纯化实验的层析色谱原图。图中，1是目标病毒峰，2是杂质峰。
18.图2是无孔层析介质纯化实验的层析色谱原图，1是目标病毒峰，2是杂质峰。
19.图3是溶瘤病毒溶液原样sec分析色谱图。
20.图4是用多孔层析梯度洗脱液病毒峰收集成分的sec分析色谱图。
21.图5是用无孔层析梯度洗脱液病毒峰收集成分的sec分析色谱图。
具体实施方式
22.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体实施例，对本发明的技术方案进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。
23.实施例1采用粒径为15微米的聚苯乙烯阴离子交换无孔层析介质用于病毒纯化
24.层析介质的制备：本实施例采用的无孔层析介质是阴离子交换无孔层析介质unicore 15q，用粒径15微米的聚苯乙烯-二乙烯苯无孔树脂制备而成。该树脂实心无孔，因而孔隙率为零。该无孔实心树脂经过表面亲水化处理后，再表面修饰键合三甲基季胺盐基团得到无孔的阴离子交换层析介质。与该无孔层析介质作对比的是ge healthcare的source 15q。和本实施例的unicore 15q一样，source 15q也是15微米的阴离子层析介质。这两种介质的基质完全相同，都是聚苯乙烯-二乙烯苯树脂，表面化学功能也很一致，都是季胺盐型阴离子交换，主要区别是前者是无孔实心的层析介质，而后者是传统的多孔层析介质，孔隙率大于40％。
25.病毒纯化应用：本实施例纯化的对象是纯度为6.5％的溶瘤病毒料液(图3是溶瘤病毒原样sec分析色谱图)。层析纯化的方法是阴离子交换吸附然后梯度洗脱(bind-elute)模式。表1是层析方法的具体条件。洗脱液被分段收集后，含病毒目标物的收集成分用sec进行病毒样品的纯度分析。
26.表1阴离子交换层析方法实验条件
[0027][0028]
图1是使用常规多孔树脂强阴离子交换层析介质source 15q的溶瘤病毒纯化层析
图，图2是使用本发明的无孔层析介质-树脂强阴离子交换层析介质unicore 15q的溶瘤病毒纯化层析图。当用传统多孔层析介质source 15q时，见图1，可以看到很高的洗脱杂质峰(图1中数字2所代表箭头)。而用本发明的无孔同类型层析介质unicore15q进行相同层析纯化实验时，见图2，洗脱杂质峰则很小(图2中数字2所代表箭头)，显示无孔层析介质可以显著减少病毒样品洗脱时杂质的含量。
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对层析洗脱后收集的病毒样品进行sec分析结果发现，用传统的多孔层析介质source 15q实验得到的病毒样品纯度为54％(图4)，而用无孔的同类型介质unicore 15q实验得到的病毒纯度达到接近90％(图5)。
[0030]
实施例2，采用粒径为30微米的聚甲基丙烯酸酯阴离子交换无孔层析介质用于病毒纯化
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层析介质的制备：本实施例采用的无孔层析介质是阴离子交换无孔层析介质uniq30-np，是用30微米的聚甲基丙烯酸酯无孔树脂制备而成。该树脂是实心无孔，因而孔隙率为零。该无孔实心树脂经过表面亲水改性处理后，再表面修饰键合三甲基季胺盐基团得到阴离子交换层析介质。与该无孔层析介质作对比的是苏州纳微科技公司生产的uniq-30s。和本实施例的uniq30-np一样，uniq-30s也是30微米的阴离子层析介质。这两种介质的基质完全相同，都是高交联聚甲基丙烯酸酯树脂，表面化学功能也很一致，都是季胺盐型阴离子交换，主要区别是前者是无孔实心的层析介质，而后者是传统的多孔层析介质，孔隙率大于40％。
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病毒纯化应用：本实施例纯化的对象是纯度为6％的溶瘤病毒料液。层析方法和条件与实施例1所述相同，都是阴离子交换吸附然后梯度洗脱模式。洗脱液被分段收集后，含病毒目标物的收集成分用sec进行病毒样品的纯度分析。对层析洗脱后收集的病毒样品进行sec分析结果发现，用传统的多孔层析介质uniq-30s实验得到的病毒样品纯度为57％，而用无孔的层析介质uniq30-np实验得到的病毒纯度达到91％。
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本发明提供了粒径≥10微米且孔隙率小于20％的无孔层析介质在病毒纯化上的应用，由于本发明无孔层析介质的孔隙率低，较少吸附病毒中的杂质，因而经层析洗脱后得到的病毒样品的分离纯度显著提高，使纯化效率大大提高。
[0034]
除上述实施例以外，本发明还可以有其他方式实现，在不脱离本发明内容的前提下，任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。