一种微生物检测用PCR芯片

本实用新型涉及一种微流控芯片，具体涉及一种微生物检测用pcr芯片。

背景技术：

聚合酶链式反应(pcr)检测是一种通过对特定dna片段的扩增进行目标核酸检测的技术，其能够基于极微量的样品实施精确的定量检测，是当前的一种重要生物检测手段。当下，将pcr技术与微流控装置将相结合的pcr芯片是行业内的研究热点，其具有所需样品和试剂量少，检测速度快，反应单元数量多，精确度高等优点。

pcr芯片相较于传统pcr实施手段的一个主要区别在于前者主要以单个微液滴作为一个微反应单元，而由于微液滴的尺寸很小，因此一块pcr芯片可以同时容纳很多微液滴，这使得基于pcr芯片执行的扩增反应相比于传统pcr实施手段具有高得多的精确性。

目前，pcr芯片检测结果的输出主要依靠于荧光测试，即对扩增反应后的微液滴阵列区域进行荧光检测，然后采用统计学手段得出有荧光信号和无荧光信号的微液滴单元的比例，再结合扩增倍率最终得出目标dna的原始浓度。因此，pcr芯片检测结果的准确性主要取决于有荧光信号和无荧光信号的微液滴单元比例。而这一比例的准确度则取决于作为反应单元的液滴在反应区域的准确分配。而在实际的应用过程中，这样的要求往往难以得到满足。以巢式pcr芯片为例，微液滴需要被均匀的分配到众多微反应腔中，这要求每个反应腔中均包含有一个液滴，不能出现空腔；同时，阵列区域除反应腔之外的空间不应当存在残留液滴。

现有的液滴分配手段包括并联式和串联式两类，其中，串联式分配方案由于采用单一分配路径，其分配过程中的空腔率较低，但该方案完成所有微反应腔的液滴分配耗时太长，不利于实现快速检测；而并联式分配虽然分配速率快，但由于芯片制备水平的限制，多个并联分配通道的一致性通常难以保证，这使得各并联通道内实际的液滴分配量并不均衡，因此采用这类分配方案往往出现很高的空腔率，导致检测结果误差偏大。因此，亟需开发一种能够快速准确的执行微液滴分配的技术手段。

技术实现要素：

为解决现有技术中的上述问题，本实用新型提供一种用于微生物检测的pcr芯片。本实用新型的pcr芯片能够同时实现并联式分配的高分配速率和串联式分配方案的低空腔率；同时，本实用新型的pcr芯片还能够降低反应腔阵列区域的液滴残留量。

为实现上述目标，本实用新型具体提供如下方案：

一种微生物检测用pcr芯片，其包括盖片层1和结构层4；其中，所述结构层4包括液滴分配区42、微反应腔区41和出口区43；所述液滴分配区42包括主通道44，连接于所述主通道44末端的若干级连接通道45和连接于所述连接通道45末端的分配通道46；所述微反应腔区41包括与所述分配通道46数量相同的输送通道411，每一个所述输送通道411的入口均对应连接一个分配通道46的出口；还包括交替设置在所述输送通道411两侧，用于容纳微液滴5的若干微反应腔412；所述出口区43包括与所述输送通道411数量相同且一一对应连接的排出通道415；所述盖片层1至少对应于微反应腔区41的部分为透明材质。

优选的，所述微反应腔412的尺寸仅允许容纳单个微液滴5，其前侧壁414(指靠近液体来流方向的一侧壁)和后侧壁均为相对于输送通道411内液体流动方向以锐角倾斜的斜面，所述锐角的角度优选不超过30度。

优选的，每个所述微反应腔412的后侧壁上均设置一个向所述输送通道411内延伸的阻流凸起413；所述阻流凸起413到所述输送通道411的相对侧壁的最小距离小于液滴5的直径，从而使得液滴5需要经过形变才能通过所述阻流凸起413；所述阻流凸起413能够对输送通道411内的液滴5进行阻挡，使其优选填充于相应阻流凸起413前端尚未被填充的微反应腔412内；而由于所述微反应腔412的尺寸仅允许容纳充单个液滴5，液滴5在经过已被填充的微反应腔412对应的阻流凸起413处时，由于连续相流体的挤压，将被迫产生一定程度的形变，进而通过所述阻流凸起413，并继续向下游输送。所述阻流凸起413的设置保证了若干微反应腔412的有效填充。

优选的，所述阻流凸起413在所述输送通道411内的竖直侧壁为曲线，且上游侧的弧度大于下游侧的弧度，从而防止液滴5在因在阻流凸起413处触碰尖锐表面或由于在所述阻流凸起413的下游形成强湍流而撕裂液滴。

优选的，所述液滴分配区42处，除主通道44外，每一条连接通道45和分配通道46在其入口处的通道底面均设置有一个下覆膜电极423，且每一个所述下覆膜电极423均配设有一个与之电连接的第一触点电极421；相应的所述下覆膜电极423和所述第一触点电极421之间通过第一接线422实现电连接；所述第一触点电极421位于结构层4的上表面；所述第一接线422位于通道内的部分和所述下覆膜电极423的表面覆盖有疏水膜或疏水涂层。

所述pcr芯片还包括直接贴附于结构层4上表面的控制层3；所述控制层3上设有对应于微反应腔区41的透明区31(可以是透明材质或镂空结构)；所述控制层3上还设有对应于分配所述液滴分配区42的分配控制区32；所述分配控制区32设有数量与所述下控制电极423的数量相同且处于对应位置(指且当所述结构层4和控制层3被正确贴合时，处于相同的垂直投影位置)的上覆膜电极323；以及数量与所述第一触点电极421相同且处于对应位置的第二触点电极321；所述上覆膜电极323与所述第二触点电极321之间不连通，每一个所述第二触点电极321均通过独立的触点引线322接通外部电源的一极；每一个所述上覆膜电极323均通过独立的覆膜引线324接通外部电源的另一极。因此，当所述结构层4与所述控制层3被正确贴合后，可以通过独立的覆膜引线324和触点引线322分别向对应的上覆膜电极323和下覆膜电极423通电，从而改变该对覆膜电极的表面对液滴5的润湿性能。当某一对覆膜电极被通电后，流经此处的液滴5将被可润湿的覆膜电极表面截留，从而形成阻止液滴5进一步流入下级通道或对应的输送通道411的微阀。

所述结构层4的出口区43还包括设置在排出通道415的两侧壁上的条电极433，每一条电极433均通过一第二接线432连接一位于所述结构层4的上表面的第三触点电极431；其中，所述条电极433裸露设置在所述排出通道415中；相应的，所述控制层3上设有对应于所述出口区43的出口检测区33；所述出口检测区33包括数量与所述第三触点电极431相同且处于对应位置的第四触点电极331；每一个所述第四触点电极331均通过一个独立的检测引线332连接至外部电源。

上述的结构层4和控制层3至少允许执行如下的液滴控制逻辑。当所述结构层4与所述控制层3被正确贴合后，外部电源通过检测引线332、第四触点电极331、第三触点电极431和第二接线432向位于所述排出通道415两侧的条电极433通电，当水相的液滴5尚未填满对应输送通道411内的所有微反应腔412时，仅有油连续相通过所述排出通道415，两个条电极433所在电路不能导通；反之，当对应输送通道411内的所有反应腔412均已被填充时，将有水相的液滴5从排出通道415中流出，此时，所述条电极433所在电路将被导通，从而可以向外输出间隔的电信号，该间隔电信号的出现意味着对应的输送通道411已完成液滴填充。

此时，通过逻辑控制器向该输送通道411对应的分配通道46内的上覆膜电极323和下覆膜电极423通电，激活对应分配通道46内的微阀，阻止液滴5继续流入该已完成液滴填充的输送通道411内；此时，液滴5将优先向微阀尚未被激活的其他分配通道46内流动，从而增加整体分配效率，并减少无效的液滴分配过程。当连接至同一个连接通道45的两个分配通道46内的微阀均被激活时，进一步激活该两个分配通道46的上一级通道内的微阀(即向该上级通道内的上下覆膜电极通电)，进而阻断液滴5进一步流入该两个已完成液滴分配的输水通道411；依次类推，直至所有微阀均被激活，则可以感知已完成微反应腔区41内所有微反应腔412的填充。

优选的，所述pcr芯片还包括贴附于控制层3上表面的冲洗层2；所述冲洗层2具有对应于结构层4的分配区42的冲洗液通道，所述冲洗液通道包括冲洗干道21、连接于所述冲洗干道21的末端的若干级冲洗连接道22和连接于所述冲洗连接通道22的末端的冲洗分配通道23；所述冲洗分配通道23的数量等于分配通道46的数量且两者处于对应的位置；所述冲洗干道21、冲洗连接到22和冲洗分配通道23均为非贯穿结构；每一支所述冲洗分配通道23的末端均设有一个对应连接至所述分配通道46的末端的贯通孔24；所述控制层3上设有对应于所述贯通孔24的若干开口34；所述贯通孔24对应于所述分配通道46内微阀的下游，其允许在该分配通道46内的微阀被激活后，向该分配通道46下游的输送通道411内供给油相冲洗液，以冲洗滞留在所述输送通道411内残余的液滴5。

优选的，所述油相冲洗液的供给在所有微阀均被激活后开始。

相比于现有技术，本实用新型至少能够取得如下有益效果：本实用新型的pcr芯片结合和串联分配和并联分配的优势，同时兼具高的液滴分配速率和低空腔率，适于执行快速的核酸检测，并保证检测结果的准确性，同时，本实用新型的pcr芯片还包括控制层，其能够自动感知单一输送通道内微反应腔是否已完成填充，并相应的激活对应于该输送通道的分配通道内的微阀，阻断液滴向该输送通道内的继续流动，从而加快微阀尚未激活的其他通道的液滴分配速度，位于不同等级分支通道内的微阀可以逐级激活，进一步加速液滴向尚未完成填充的输送通道内的流动速度，因而可以取得相比于传统并联分配通道更高的分配速率，抵消因芯片制造工艺限制引起的通道不均匀性带来的高空腔率和因此被削减的分配速率；本实用新型的pcr芯片还包括冲洗层，其允许在所有微阀被激活后通过连接于微阀下游的冲洗液通道向所有输送通道内供给油相冲洗液，将滞留在输送通道内的残留液滴冲刷处微反应腔区，从而使得本实用新型的pcr芯片在填充后，微反应腔区有且仅有独立填充在每个微反应腔内的单一液滴，确保检测结果的准确性。

附图说明

图1为盖片层的示意图；

图2为冲洗层的示意图；

图3为控制层的示意图；

图4为图3中左侧圆形区域的局部放大图；

图5为图3中右侧圆形区域的局部放大图；

图6为结构层的示意图；

图7为图6中左侧圆形区域的局部放大图；

图8为图6中右侧圆形区域的局部放大图；

图9为图8的三维结构示意图；

图10为微反应腔区填充液滴后的示意图；

图11为图10中圆形区域的局部放大图；

图12为本实用新型各层的叠加顺序示意图。

图中：1为盖片层，2为冲洗层，21为冲洗干道，22为冲洗连接道，23为冲洗分配通道，24为贯通孔，3为控制层，31为透明区，32为分配控制区，321为第二触点电极，322为触点引线，323为上覆膜电极，324为覆膜引线，33为出口检测区，331为第四触点电极，332为检测引线，34为开口，4为结构层，41为微反应腔区，411为输送通道，412为微反应腔，413为阻流凸起，414为前侧壁，415为排出通道，42为液滴分配区，421为第一触点电极，422为第一接线，423为下覆膜电极，431为第三触点电极，432为第二接线，433为条电极，44为主通道，45为连接通道，46为分配通道，5为液滴。

具体实施方式

为进一步说明本实用新型的构思，下面结合附图对本实用新型的方案做进一步的说明。

实施例1

如图1、6-11所示，提供一种微生物检测用pcr芯片，其包括盖片层1和结构层4；其中，所述结构层4包括液滴分配区42、微反应腔区41和出口区43；所述液滴分配区42包括主通道44，连接于所述主通道44末端的若干级连接通道45和连接于所述连接通道45末端的分配通道46；所述微反应腔区41包括与所述分配通道46数量相同的输送通道411，每一个所述输送通道411的入口均对应连接一个分配通道46的出口；还包括交替设置在所述输送通道411两侧，用于容纳微液滴5的若干微反应腔412；所述出口区43包括与所述输送通道411数量相同且一一对应连接的排出通道415；所述盖片层1至少对应于微反应腔区41的部分为透明材质。所述微反应腔412的尺寸仅允许容纳单个微液滴5，其前侧壁414(指靠近液体来流方向的一侧壁)和后侧壁均为相对于输送通道411内液体流动方向以锐角倾斜的斜面，所述锐角的角度优选不超过30度。每个所述微反应腔412的后侧壁上均设置一个向所述输送通道411内延伸的阻流凸起413；所述阻流凸起413到所述输送通道411的相对侧壁的最小距离小于液滴5的直径。

实施例2

如图3-9所示，区别于实施例1的是，所述液滴分配区42处，除主通道44外，每一条连接通道45和分配通道46在其入口处的通道底面均设置有一个下覆膜电极423，且每一个所述下覆膜电极423均配设有一个与之电连接的第一触点电极421；相应的所述下覆膜电极423和所述第一触点电极421之间通过第一接线422实现电连接；所述第一触点电极421位于结构层4的上表面；所述第一接线422位于通道内的部分和所述下覆膜电极423的表面覆盖有疏水膜或疏水涂层。

所述pcr芯片还包括直接贴附于结构层4上表面的控制层3；所述控制层3上设有对应于微反应腔区41的透明区31；所述控制层3上还设有对应于分配所述液滴分配区42的分配控制区32；所述分配控制区32设有数量与所述下控制电极423的数量相同且处于对应位置的上覆膜电极323；以及数量与所述第一触点电极421相同且处于对应位置的第二触点电极321；所述上覆膜电极323与所述第二触点电极321之间不连通，每一个所述第二触点电极321均通过独立的触点引线322接通外部电源的一极；每一个所述上覆膜电极323均通过独立的覆膜引线324接通外部电源的另一极。当某一对覆膜电极被通电后，流经此处的液滴5将被可润湿的覆膜电极表面截留，从而形成阻止液滴5进一步流入下级通道或对应的输送通道411的微阀。

所述结构层4的出口区43还包括设置在排出通道415的两侧壁上的条电极433，每一条电极433均通过一第二接线432连接一位于所述结构层4的上表面的第三触点电极431；其中，所述条电极433裸露设置在所述排出通道415中；相应的，所述控制层3上设有对应于所述出口区43的出口检测区33；所述出口检测区33包括数量与所述第三触点电极431相同且处于对应位置的第四触点电极331；每一个所述第四触点电极331均通过一个独立的检测引线332连接至外部电源。

实施例3

如图2-4所示，区别于实施例2的是，所述pcr芯片还包括贴附于控制层3上表面的冲洗层2；所述冲洗层2具有对应于结构层4的分配区42的冲洗液通道，所述冲洗液通道包括冲洗干道21、连接于所述冲洗干道21的末端的若干级冲洗连接道22和连接于所述冲洗连接通道22的末端的冲洗分配通道23；所述冲洗分配通道23的数量等于分配通道46的数量且两者处于对应的位置；所述冲洗干道21、冲洗连接到22和冲洗分配通道23均为非贯穿结构；每一支所述冲洗分配通道23的末端均设有一个对应连接至所述分配通道46的末端的贯通孔24；所述控制层3上设有对应于所述贯通孔24的若干开口34；所述贯通孔24对应于所述分配通道46内微阀的下游，其允许在该分配通道46内的微阀被激活后，向该分配通道46下游的输送通道411内供给油相冲洗液，以冲洗滞留在所述输送通道411内残余的液滴5。所述油相冲洗液的供给在所有微阀均被激活后开始。

实施例4

提供一种基于实施例3所述pcr芯片的液滴分配方法，包括如下步骤：

1)、将盖片层1、冲洗层2、控制层3和结构层4由上至下逐层贴合；

2)、向排出通道侧壁415侧壁的条电极433通电，此时，条电极433所在电路不接通；

3)、将主通道44连接至液滴供给单元，向微反应腔区41提供液滴5；液滴5经若干级连接通道45大体上均匀的被分配到多个分配通道46中；

4)、进入分配通道46中的液滴5随后进入对应的分配通道411，并触碰阻流凸起413的上游侧弧形侧壁，所述液滴5的流动受阻，因而优先进入相应阻流凸起413前侧空置的微反应腔412中；而对于已填充有液滴5的微反应腔412，由于其容纳空间已被占据，液滴5在油连续相和阻流凸起413的挤压下产生轻度形变并通过相应的阻流凸起413；

5)、在水相的液滴5尚未填满对应输送通道411内的所有微反应腔412前，仅有油连续相通过相应的排出通道415，因此两个条电极433所在电路仍然不能导通；当对应输送通道411内的所有反应腔412均已被填充时，将有水相的液滴5从排出通道415中流出，此时，所述条电极433所在电路将被导通，从而可以向外输出间隔的电信号，该间隔电信号的出现意味着对应的输送通道411已完成液滴填充；

6)、当接收到某一排出通道415内的一对条电极433输出的电信号时，通过逻辑控制器向该排出通道415对应的分配通道46内的上覆膜电极323和下覆膜电极423通电，激活对应分配通道46内的微阀，阻止液滴5继续流入该已完成液滴填充的输送通道411内；

7)、当连接至同一个连接通道45的两个分配通道46内的微阀均被激活时，进一步激活该两个分配通道46的上一级通道内的微阀，进而阻断液滴5进一步流入该两个已完成液滴分配的输送通道411；依次类推，直至所有微阀均被激活后，判定已完成微反应腔区41内所有微反应腔412的填充；

8)、通过冲洗层2向所有输送通道411内供给油相冲洗液，对所述输送通道411内的残余液滴进行冲刷，直至所有条电极433不再被导通，停止供应冲洗液，完成液滴分配过程。

以上实施方案仅是本实用新型技术构思较佳实施方式的举例，其不应当被理解为对本实用新型所有可行实施方式的限制，本领域的常规技术人员在不经过创造性劳动的情况下，通过常规手段的替换得到的所有实施方式均属于本实用新型的可行实施范畴，本实用新型的实际保护范围以权利要求书的限定为准。