用于加工颗粒的微流控设备和方法与流程

用于加工颗粒的微流控设备和方法
1.本发明涉及微流控设备和使用该设备来加工颗粒、特别是细胞的方法。更具体地，本发明涉及微流控设备和使用该设备实现对活细胞进行各种类型的生物生产的操作的方法，各种类型的生物生产的操作例如过滤、接种、扩增、转导、分选、收获等。


背景技术：

2.近年来，微流控“芯片”技术被广泛应用于细胞悬液的加工。然而，在现有的加工细胞悬液的微流控设备中，输入悬液的分散限制了程序的功效和准确性。事实上，细胞是对其环境的许多参数敏感的复杂系统。因此，生物生产方案执行过程中的微小变化可产生大的影响。同样，生物生产步骤中的参数不均匀性意指细胞分别经历不同的重要参数值，能够导致非常不均匀的输出。不均匀性还意指某些细胞经历的参数与最佳参数不同，这能够导致效率和功效降低。不均匀性还妨碍了对最佳加工参数的有效识别，因为测量的输出代表了参数是扩展的分布的，因此提供了有限量的关于目标参数集的相关性的信息。因此，参数的批次间的再现性和参数的批次间的均匀性是生物生产中获得可再现和均匀输出的关键。反过来，这使得可以从方案参数的筛选中获得可靠数据，从而确定提供最大效率、最大功效和最大再现性的最佳加工条件。
3.此外，很少有微流控生物生产设备被配置为支持包括“培养步骤”的生物生产，“培养步骤”例如扩增和分化步骤。支持此类通用生物加工步骤的现有微流控设备无法在提供足够的容量的同时以合理的复杂性和成本提供细胞和反应物效率。
4.正是由于这些缺点，本发明旨在更具体地通过提出一种微流控设备和一种用于加工颗粒、特别是细胞的方法来补救，该设备和方法能够在颗粒和反应物的数量方面实现廉价的、有功效的、高效的以及准确的生物加工技术。


技术实现要素：

5.为此目的，根据一个方面，本发明的主题是一种用于加工颗粒、特别是细胞的微流控设备，其包括：
[0006]-加工室，其包含至少两个细长段，
[0007]-至少一个输入接种通道和至少一个输出接种通道，它们配置为在加工室的所有段的纵向方向的横向方向上限定接种流，和
[0008]-至少一个输入收获通道和至少一个输出收获通道，它们配置为在加工室的所有段的纵向方向上限定收获流，
[0009]
其中，微流控设备包括：
[0010]-用于加工室的第一段s1的、与s1的接合部沿s1分布的多个输入接种通道，所述多个输入接种通道由单个输入接种树限定；
[0011]-用于加工室的不同于s1的第二段s2的、与s2的接合部沿s2分布的多个输出接种通道，所述多个输出接种通道由单个输出接种树限定；和
[0012]-一个连通通道或多个连通通道，每个连通通道具有接合加工室的两个不同段的
接合部，一个连通通道或多个连通通道被配置为允许接种流串行通过所有段。
[0013]
在本发明的含义内，加工室是可在其中实施生物加工的微流控设备的体积。室可以是流体连通在一起的若干段的总和，室的分段对于诸如接种和收获的一些流的步骤是有用的。由于段是流体连通的，因此可将室限定为其中生物加工参数可保持相同的体积，与分段无关。在一些特定情况下，生物加工的步骤可在室的单个段中实施。
[0014]
在本发明的含义内，当流的前端连续地流过每个段时，流串行通过若干段：换言之，流穿过第一段，然后到达并穿过第二段，依此类推，直到流到达最后一段。特别地，对于接种流，通过连通元件允许段之间的串行连通；并且对于收获流，通过流体连通器允许段之间的串行连通。为了让接种流串行流过所有段，每个段：
[0015]-通过连通通道与两个或多于两个不同的段流体连通；或
[0016]-通过连通通道与一个或多于一个不同的段流体连通，并与接种树(输入端或输出端)接合。
[0017]
连通通道可以是永久的或激活的。
[0018]
永久的连通通道由微流控设备的几何形状限定，具有特定的长度、宽度和高度(即截面)，并与两个不同的段接合。它们如图1、图3、图4a和图5所示。
[0019]
激活的连通通道是室的可变形部分，该连通通道例如在施加外部压力的情况下可以被挤压。在其未变形状态下，激活的连通通道的厚度与室的厚度相当，但限定了细长段之间的界限。在它们被挤压状态下，激活的连通通道在两个段之间限定一个薄且非常大的通道或在两个段之间限定多个薄通道，连通通道与段之间的接合部是从段厚度变为连通通道厚度的厚度改变的区域。在特定配置中，室被单个激活的连通通道分成两段，当被挤压时，该激活的连通通道限定了单个大的连通通道。在另一种配置中，室被单个激活的连通通道分成两段，当被挤压时，该激活的连通通道限定了多个狭窄的连通通道。在另一种配置中，室被n-1个激活的连通通道分成n(n大于2)个段，当被挤压时，该激活的连通通道各自限定了单个大的连通通道。这种配置(n＝4)如图4b所示。
[0020]
利用上述特点，本发明具有以下优点：
[0021]-包括至少两个细长段的加工室在接种期间促进接种通道和室中的高的剪切速率差异，从而增加接种的稳健性并促进处理的颗粒的高产量；在本发明的含义内，段在其长度至少是其宽度的两倍、优选是其宽度的四倍的情况下被认为是细长的；
[0022]-细长段被串行接种，需要具有简单几何形状和覆盖面积减少的单个输入接种树和单个输出接种树来接种整个加工室，从而增加微流控设备的有用表面，即加工室的表面。实际上，利用这种配置，加工室的表面可以占微流控设备的整个表面的大于45％，甚至大于50％、55％、60％或70％。
[0023]
根据一个特征，加工室的至少两个细长段沿它们的纵向方向平行。
[0024]
根据一个特征，加工室的至少两个细长段具有相同的几何形状。
[0025]
根据一个特征，比率rs_input：
[0026][0027]
高于50，优选地高于75，优选地高于100，优选地高于150，优选地高于200，其中s
21
是垂直于横向方向的段的横截面，并且(∑
kvk
*sk)/v
tots_input
是对于在最接近输入接种树的
树根的第一个节点与加工室的第一段之间的所有输入接种通道而言的输入接种通道的体积和其横截面的乘积的总和除以总体积v
tots_input
，总体积是这些输入接种通道的体积之和。
[0028]
根据一个特征，比率rh_input：
[0029][0030]
低于20，优选地低于15，优选地低于10，优选地低于5，其中w是垂直于纵向方向的段的横截面，并且(σ
jvj
*sj)/v
toth_input
是对于在最接近输入收获树的树根的第一个节点与段之间的所有输入收获通道而言的输入收获通道的体积和其横截面的乘积的总和除以总体积v
toth_input
，该总体积是这些输入收获通道的体积之和。
[0031]
利用上述特点，本发明具有以下优点：
[0032]-值高于50、优选地高于75、优选地高于100、优选地高于150、优选地高于200的接种比率rs_input在接种流期间引起接种通道与加工室的第一段之间的剪切速率的大的变化，从而通过促进颗粒在加工室中的沉积来提高接种效率；
[0033]-值低于20、优选地低于15、优选地低于10、优选地低于5的收获比率rh_input在收获流期间引起收获通道与加工室之间的剪切速率的小的变化，从而提高收获效率。
[0034]
根据一个特征，比率rs_output：
[0035][0036]
高于50，优选地高于75，优选地高于100，优选地高于150，优选地高于200，其中s
21
是垂直于横向方向的段的横截面，并且(∑
kvk
*sk)/v
tots_output
是对于在最接近输出接种树的树根的第一个节点与加工室的第二段之间的所有输出接种通道而言的输出接种通道的体积和其横截面的乘积的总和除以总体积v
tots_output
，总体积是这些输出接种通道的体积之和。
[0037]
根据一个特征，比率rh_output：
[0038][0039]
低于20，优选地低于15，优选地低于10，优选地低于5，其中w是垂直于纵向方向的段的横截面，并且(∑
jvj
*sj)/v
toth_output
是对于在最接近输出收获树的树根的第一个节点与段之间的所有输出收获通道而言的输出收获通道的体积和其横截面的乘积的总和除以总体积v
toth_output
，该总体积是这些输出收获通道的体积之和。
[0040]
根据一个特征，比率rs_connect：
[0041][0042]
高于50，优选地高于75，优选地高于100，优选地高于150，优选地高于200，其中s21是垂直于横向方向的段的横截面，并且(∑
kvk
*sk)/v
tots_connect
是对于在加工室的段的一侧灌注加工室的段的所有连通通道而言的连通通道的体积和其横截面的乘积的总和除以总
体积v
tots_connect
，该总体积是这些连通通道的体积之和。
[0043]
输出接种树和输出收获树的配置使得比率rs_output和rh_output中的每个与对应的比率rs_input或rh_input具有相同的数量级，增强了微流控设备的对称性及其接种和收获的效率。
[0044]
注意，在只有一个收获通道而没有真正的收获通道树的情况下，本文使用的表述“收获树”可以指定唯一的收获通道。在这种情况下，收获树的第一个节点被认为是段与收获通道之间的几何过渡(如图1所示)。
[0045]
根据一个实施方案，对于加工室的第一段s1，输入接种树在从树根到与s1的接合部的每个可能的流路径上具有至少一个位置，使得该位置处的输入接种通道的接种剪切指标ssi与s1的平均接种剪切指标ssi的比率大于10，优选地大于20，更优选地大于40，其中，通道或段的接种剪切指标被定义为：
[0046][0047]
其中，tq是流经所考虑的输入接种通道或段的接种流的百分比，s为接种流垂直于其纵向纤维截取的输入接种通道或段的横截面表面积，并且h是输入接种通道或段在高度方向上的高度。
[0048]
根据实施方案，对于在加工室的两个段之间建立流体连通的连通通道，连通通道的接种剪切指标ssi与加工室各段的平均接种剪切指标ssi的比率高于10，优选地高于20，更优选地高于40，其中，连通通道或段的接种剪切指标被定义为：
[0049][0050]
其中，tq是流经所考虑的连通通道或段的接种流的百分比，s为接种流垂直于其纵向纤维截取的连通通道或段的横截面表面积，并且h是连通通道或段在高度方向上的高度。
[0051]
注意，由于流体特性，例如当流体是细长颗粒的悬液或剪切稀化流体时，或者由于惯性效应，特别是通道交叉口的惯性效应，例如在所谓的“特斯拉阀”中发生的惯性效应，流的分布以及相应的tq值可以根据给定微流控设备的流速而变化。在本文中，对于所有评估，通过忽略这些影响来估计流的分布和相应的tq值，特别是通过基于在37℃和惯性效应可忽略不计的低流速下的水流数值模拟来估计流的分布，特别地在这些估计中将使用0.1μl/s的总接种或收获流速。
[0052]
由于根据本发明的接种剪切指标的特定选择，当通过输入接种通道、连通通道和加工室施加接种流时，上游相对较高的剪切速率可以分离、再悬浮颗粒并将其移向加工室，而在加工室中，相对较低的剪切速率和速度允许悬浮颗粒沉降并防止沉降颗粒的位移、分离和再悬浮。加工室中的接种剪切指标远低于输入接种通道和连通通道中的接种剪切指标，这确保以接种流速有效置换输入接种通道和连通通道中的颗粒的接种流不会移动太多，并且优选地根本不移动之前在加工室中接种的颗粒。特别地，在脉冲式接种流的情况下，在一个脉冲期间接种的颗粒保持被捕获并且在下一个接种脉冲期间不会被排出。
[0053]
这种配置，结合单个输入接种树和单个输出接种树的存在，通过连通通道串行灌注加工室的所有段，可以提供实现加工室的均匀接种的具有分散补偿的接种功能和悬液浓度，该悬液浓度是有利地在没有任意过滤器或离心机的情况下获得的，这些过滤器或离心
机通常会导致额外的成本、复杂性和潜在的性能损失或对颗粒的不利影响。除了接种通道和连通通道相对于加工室的段的特定布置之外，根据本发明的微流控设备提供独立于接种功能的具有高效和稳健的收获能力的收获功能，以便能够在加工室内引起相对高的剪切速率而不需要太高的压力。
[0054]
应当注意，在本发明中，最相关的剪切速率是发生在微流控设备的壁附近，特别是在微流控设备的底表面附近的剪切速率，因为正是这些壁附近的剪切速率值表明了对位于壁附近的颗粒的剪切相关影响的大小，并且尤其表明了取决于颗粒的性质、壁的性质和流体的性质的允许再悬浮颗粒的力。因此，在本发明中，除非另有说明，否则剪切速率的估计值是用以下公式计算的：
[0055][0056]
其中q是垂直于流截取的横截面的流速，s是所考虑的横截面表面积，并且h是沿高度方向截取的横截面平均高度。
[0057]
根据有利的特征，对于加工室的第一段，在与该段相连的输入接种树的输入接种通道体积的一半以上中，输入接种通道的接种剪切指标与加工室第一段的平均接种剪切指标的比率高于10，优选地高于20，更优选地高于40。
[0058]
根据一个实施方案，在输入接种树中，输入接种通道的接种剪切指标基本恒定。每个输入接种通道的这种配置导致输入接种通道中的剪切速率大致恒定。这使得可以选择导致足够高的剪切速率的流速，从而在接种过程中有效地将颗粒移向加工室，而没有会产生裂解风险的重要局部峰值或倾向于卡住颗粒的局部最小值。
[0059]
在实践中，很难在输入接种树中保持接种剪切指标恒定。在这种情况下，接种剪切指标的值范围优选地覆盖小于3个数量级，优选地小于2个数量级，并且更优选地小于1个数量级。
[0060]
根据一个实施方案，微流控设备的每个接种树在液压阻力方面是对称的，即，相同层级的节点之间的接种通道对于相同温度下的相同流体具有相同的液压阻力，这可以通过数值或分析估计。这种在液压阻力方面的对称性提高了接种流的均匀性。
[0061]
根据一个实施方案，微流控设备的每个接种树在几何形状方面是对称的，即，相同层级的接种树的所有节点，包括与加工室的接合部，相对于树根的通道路径距离相同；并且在距树根的给定通道路径距离处，接种通道的横截面对于所有通道都是相同的。这种几何形状是获得在液压阻力方面对称的接种树的一种方式。
[0062]
为了进一步简化微流控设备的设计，根据本发明，微流控设备的每个接种树可以另外设计为至少部分地为二叉树。这意指给定层级的接种树的所有节点都有两个新兴的通道。为了优化结果，与较高层级的节点，即更接近与加工室的接合部的节点相比，较低层级的节点即更接近树根的节点是具有更高的优先级的二叉的。当每棵接种树都是完全二叉树时，该设计是特别简化的。
[0063]
根据一个实施方案，在连通通道中，连通通道的接种剪切指标基本恒定。每个连通通道的这种配置导致连通通道中的剪切速率大致恒定。这使得可以选择导致足够高的剪切速率的流速，从而在接种过程中有效地将颗粒从一个段移向下一个段，而没有会产生裂解风险的重要局部峰值或倾向于卡住颗粒的局部最小值。
[0064]
根据一个实施方案，微流控设备包括阻塞装置，该阻塞装置被配置为当通过输入接种通道、连通通道和输出接种通道将接种流施加到加工室时选择性地阻塞输入和输出收获通道。
[0065]
根据一个实施方案，微流控设备包括阻塞装置，该阻塞装置被配置为当通过输入收获通道和输出收获通道将收获流施加到加工室时选择性地阻塞输入接种通道和输出接种通道。
[0066]
根据一个实施方案，微流控设备包括阻塞装置，该阻塞装置被配置为当通过输入收获通道和输出收获通道将收获流施加到加工室时选择性地阻塞连通通道。
[0067]
可以组合阻塞装置的三个前述实施方案以便精确地管理期望的流并避免微流控设备中的寄生流。
[0068]
阻塞装置可以包括能够塌陷进一组通道的移位膜。在这种情况下，通道优选地具有有利于通过膜位移完全挤压通道内部体积的横截面。这种阻塞装置可以在大部分通道上延伸，以在不使用时减少收获通道、流体连通器、连通通道和接种通道的体积，从而减少反应物消耗。这种基于膜的阻塞装置可以由膜的与通道相对的另一侧上的流体驱动。
[0069]
在特定配置中，激活的连通通道可表现为阻塞装置。实际上，激活的连通通道呈现出具有不同厚度的不同配置。在其未变形状态下，激活的连通通道的厚度与室的厚度相当。在变形之后，激活的连通通道可以具有较薄的厚度，从而限定连通通道。在进一步变形时，激活的连通通道可被完全挤压，厚度几乎为零，从而限定了阻塞装置。
[0070]
根据一个特征，输入接种通道与加工室的第一段的相邻接合部之间的间距和输出接种通道与加工室的第二段的相邻接合部之间的间距相同。串行连通的段的两侧的这种恒定间距有助于加工室的接种流均匀和灌注均匀。
[0071]
根据一个特征，连通通道与段的相邻接合部之间的间距和输入接种通道与加工室的第一段的相邻接合部之间的间距相同。串行连通的段的所有侧的这种恒定间距有助于加工室的接种流均匀和灌注均匀。
[0072]
根据一个特征，连通通道全部具有相同的长度。在这种特殊的配置中，加工室的各个段是平行的，并且所有段中的接种流线相似，从而使接种具有更好的均匀性。
[0073]
根据另一特征，在每个接种树中，接种通道的横截面随着距树根的通道路径距离的增加而减小。更精确地说，考虑到接种树的接种通道中的流速分拆，在距树根的给定通道路径距离处，调整接种通道与加工室的段的相邻接合部之间的间距和各个接种通道的横截面从而导致加工室中产生大约“n倍”的剪切速率，其中，如上所述，n大于10，优选大于20，更优选大于40。在二叉接种树的情况下，调整二叉树的接种通道数，该通道数是二的幂，以达到期望的结果。
[0074]
根据一个实施方案，对于加工室的第一段，垂直于横向方向的第一段的横截面与灌注第一段的输入接种通道即更接近与该段的接合部的横截面之和的比率，大于5，优选地大于10，更优选地大于15。
[0075]
根据一个实施方案，对于加工室的所有段，垂直于横向方向的段的横截面与在段的一侧上灌注段的连通通道的横截面之和的比率高于5，优选高于10，更优选高于15。
[0076]
根据一个实施方案，接种剪切速率分布是通过估计接种流期间在沿加工室的中间纵向纤维l的连续位置处垂直于长度为dl的接种流的窄横截面中的剪切速率而获得的，其
特征在于相对标准变化小于66％、优选小于33％、更优选小于10％的，这种分布是dl恒定的情况下估计的，相当于小于加工室中间纤维l总长度的1％，并且dl乘以这些横截面的数量等于加工室中间纤维l的总长度，以提高接种性能和均匀性。
[0077]
根据一个实施方案，接种体积分布，其是类似地沿加工的中间纤维l估计的，通过在相同的连续横截面上计算穿过该横截面的接种流速与加工室的局部宽度之间的比率，加工室的局部宽度是通过此横截面与最近的接种树或与此横截面两侧的加工室接合的连通通道接合部之间的距离之和来估计的，接种体积分布的特征在于相对标准变化小于66％，优选小于33％，更优选小于10％，以改善接种性能，特别是减少在接种脉冲期间损失的颗粒量。
[0078]
根据一个实施方案，收获剪切速率分布是通过估计收获流期间沿加工室中间纤维l垂直于收获流的横截面中的剪切速率而获得的，其中这种分布是通过沿由所考虑的收获流灌注的加工室的段的整个长度均匀分布的至少100个连续测量的横截面获得的，收获剪切速率分布的特征在于相对标准变化小于66％、优选小于33％、更优选小于10％，以提高收获效率和均匀性。
[0079]
根据一个实施方案，接种树的总体积小于加工室的总体积，优选地小于加工室的总体积的33％，更优选地小于加工室的总体积的10％，以提高反应物的使用效率。
[0080]
在本发明的一个有利实施方案中，每个输入接种通道、输出接种通道和连通通道与加工室的接合部在高度方向上位于加工室的上部。这种配置利用颗粒惯性——在颗粒相对密度大于周围流体的相对密度的情况下——在接种期间获得加工室中更均匀的颗粒分布，特别是避免在接种脉冲期间新接种的颗粒在加工室的底表面附近行进。
[0081]
根据本发明的一个特征，对于加工室的每个段，在横向方向上截取的段的宽度与在高度方向上截取的段的高度的比率高于5，优选地高于10，更优选高于20。以这种方式，加工室的每个段都是浅的段，其中层流导致包含在该段中的大部分流体发生对流置换。能够添加模锻斜度即加工室的段的侧壁与垂直于该段底表面的方向之间的角度以及底部边缘处的圆角即圆形底部边缘，以进一步促进段中包含的流体的完全更新。
[0082]
应当注意，如果段的底表面与接种通道或连通通道的底表面之间的距离大于段的宽度，则一个或若干占加工室的段的很大一部分体积的稳定的漩涡可在施加接种流时在段中向下发生。这导致漩涡与接种通道或连通通道之间很少或没有对流交换，能够发现这会增加执行特定生物加工操作所需的反应物体积。
[0083]
为了使微流控设备的制造更容易并降低通道之间泄漏的风险，平行通道之间具有最小距离是有利的。例如，平行通道之间的典型最小距离为1mm，而准精确的制造方法可允许减少这个最小距离至例如500μm或小于500μm。能够发现通过聚合物材料例如聚苯乙烯、环烯烃聚合物或共聚物的注塑或热压花来制造微流控设备的部件是有利的，特别是为了实现低的单位成本。在这种情况下，通过应用如上所述的最小模锻斜度，有助于脱模并提高最终精度。
[0084]
根据一个实施方案，微流控设备的加工室和通道都共享相同的顶表面的平面，以便允许用诸如聚合物的平坦材料片封闭微流控设备，这使得制造更容易。在特定实施方案中，微流控设备可以包括由聚合物材料制成的注塑或热压花的底部部分和由相同或不同的聚合物材料制成的顶部部分例如平板。
[0085]
还可以通过使微流控设备的通道弯曲部的内边缘以大约为50μm或100μm的最小曲率半径整圆来促进模具制造。有利地，通道弯曲部的外边缘也可以以最小曲率倒圆，特别是为了使弯曲部中的流规则化。
[0086]
根据一个实施方案，微流控设备在化学残留物、灰尘和颗粒、内毒素和其他生物污染物方面非常干净，这可以通过调整制造方法和/或通过实施包括例如超声处理、辐照、洗涤、高压灭菌等的后加工步骤来实现。在一个优选实施方案中，微流控设备由医用级材料制成。在一个优选实施方案中，由聚合物制成的微流控设备的部件不含增塑剂。
[0087]
根据一个实施方案，微流控设备在诸如密封的聚合物袋的包装内被例如通过伽马射线辐照灭菌。这降低了使用微流控设备时的污染风险。
[0088]
根据一个实施方案，微流控设备是一次性设备，以减少连续过程之间的交叉污染和/或干扰。
[0089]
根据一个实施方案，微流控设备的外部连通器或连通端口使得可以将微流控设备与其他系统流体连通，微流控设备的外部连通器或连通端口具有小于2mm或等于2mm、优选小于1mm或等于1mm的内径。这种配置减少了所谓的“死体积”并提高了生物生产效率。
[0090]
为了减少接种期间的颗粒损失，对加工室进行接种有利地用占比加工室的体积小的体积的接种流脉冲，以及接种流脉冲之间的对应于没有施加或施加非常有限的流的接种暂停，以便让悬浮颗粒沉淀在加工室的段中。根据微流控设备的设计，选择的接种脉冲期间的流速，使其足够小而不会在加工室的段中产生导致沉降颗粒的再悬浮或大的位移的剪切率，并使其足够大从而输入颗粒悬液在接种流脉冲期间不会沉降太快，在这种情况下，颗粒将向加工室的段的输入接种侧积累，并且还使得上游剪切速率足以有效地将颗粒移向加工室的段。
[0091]
或者，体积等于或大于加工室体积的50％的接种流脉冲容易在脉冲之后导致输出接种通道中有颗粒，接种流脉冲随后是接种暂停。然后是反向(从输出接种树到输入接种树)接种流脉冲，旨在将最终沉积在输出接种通道中的颗粒带回加工室中，然后是另一次接种暂停。
[0092]
在阻塞装置导致流体从阻塞通道排出到相邻通道或空腔中的一些实施方案中，这些阻塞装置可以有利地在接种暂停期间被激活，以便最小化在接种通道和连通通道中的颗粒沉积。当阻塞装置包括挤压阻塞通道的移位膜时尤其如此。
[0093]
根据有利的特征，接种通道与加工室的第一段的相邻接合部之间的间距小于加工室的第一段在横向方向上的宽度，优选小于加工室的第一段的宽度的1/2，更优选地小于加工室的第一段的宽度的1/3。类似地，连通通道与段的相邻接合部之间的间距小于加工室的段在横向方向上的宽度，优选地小于加工室的段的宽度的1/2，更优选小于加工室的段的宽度的1/3。在两个段仅通过一个连通通道连通的情况下，连通通道的宽度尽可能接近连接的段的长度，获得了等效的效果。以这种方式，在加工室的段内出现更均匀的接种流。
[0094]
根据本发明的一个特征，每个输入和输出接种通道与加工室的段的接合部是倒角的。在接种通道与加工室之间的接合部的这种倒角使得可以具有长度增加的加工室的段，从而在不会产生不均匀的接种流的情况下获得更高容量的微流控设备。优选地，每个倒角在其与加工室的段的接合部相对于接种通道的纵向方向具有小于45
°
的角度，以提供均匀的接种流。
[0095]
根据一个实施方案，接种通道和收获通道被配置为使得在加工室中施加收获流时，每个接种通道和每个连通通道中的绝对流速小于施加在每个输入收获通道与加工室的接合部处的收获流的流速总和的10％，优选小于5％，更优选小于2.5％。该百分比的降低可描述为收获流期间的分流，有助于降低颗粒在收获期间在接种通道或连通通道损失的风险，从而提高收获的性能。
[0096]
更一般地，根据本发明，在接种流期间，接种通道和连通通道的特征在于具有与加工室相比更低的横截面和更高的剪切速率，而收获通道的特征在于在收获流期间与加工室相似的横截面和剪切速率。
[0097]
以有利的方式，在高度方向上截取的加工室的高度为50μm至300μm。发现该高度范围与适度的流的阻力相适应。应当注意，加工室的底表面在大多数情况下代表微流控设备的生产能力，而加工室的高度代表每单位生产能力的流体体积。因此，发现相对于经加工的颗粒的数量，该高度范围有利地最小化进行生物生产操作所需的反应物的量。优选地，加工室的高度是恒定的。更一般地，通过表现出低的液压阻力、流的障碍物的最小尺寸和最小数量，将加工室设计成在流的分布方面具有低的影响。
[0098]
在有利的方式中，垂直于高度方向的加工室表面大于0.25cm2，优选大于1cm2，更优选大于4cm2，更优选大于10cm2，更优选大于16cm2，更优选大于20cm2，更优选大于30cm2。换言之，加工室的表面可以占微流控设备的整个表面的大于45％，甚至大于50％、55％、60％或70％。如此高的表面积确保了足够的用于生物生产的颗粒处理能力。
[0099]
根据本发明的一个特征，加工室的每个段的上壁和下壁中的至少一个在高度方向上对于用于穿过微流控设备的壁进行成像的设备的成像波长是可透光的。这允许穿过微流控设备的壁进行清晰的成像，从而可以进行过程监控。成像波长可以包括在可见光、红外和/或紫外光谱中。根据一个实施方案，加工室的段的上壁和/或下壁是平面且平行的，以便于聚焦和成像。应当注意，表面的平面性并不排除提供例如颗粒黏附特征的微结构的存在。当存在这种微结构时，它们的尺寸优选比成像波长小得多或大得多。
[0100]
根据本发明的一个特征，加工室的底表面设置有颗粒黏附涂层，例如黏附肽、ecm分子或片段、抗体、纳米抗体、细胞膜锚定分子。类似地，接种通道和连通通道可以设置有涂层以减少颗粒的黏附，例如基于以下物质的亲水涂层，例如白蛋白例如牛血清白蛋白(bsa)、聚甲基丙烯酸羟乙酯(phema)、聚-l-赖氨酸(pll)、聚乙二醇(peg)、羧基甜菜碱、琼脂、纤维素、壳聚糖或其聚合物或共聚物。或者，为了在加工室中，加工室底表面附近的剪切速率捕获颗粒，以及为了在接种通道和连通通道中，使接种通道和连通通道的底表面附近的剪切速率有规律地足够强，以补偿颗粒黏附并提供颗粒运动，能够出于类似目的选择表面微结构和/或粗糙度。
[0101]
根据一个实施方案，微流控设备包括加工室的段之间的流体连通器。这些流体连通器被配置为允许收获流串行流过加工室的所有段。
[0102]
在该实施方案中，流体连通器的横截面优选地适于对流产生适度的阻力，同时占最小的体积，因为就设备的生产能力而言，该体积通常是“死体积”。例如，每个流体连通器的横截面可以大约是垂直于其纵轴的加工室的横截面，或大约是该横截面的一半。
[0103]
除了液压阻力变得太高而无法有效地进行接种或收获的一定尺寸的微流控设备(或芯片)之外，可以考虑加工室的段的其他布置，例如若干个段和所连通道在同一平面上
并行连通的配置，或若干个段和附加通道垂直堆叠的配置，或若干个段径向分布的配置，或若干个段沿曲线设置的配置。然而，与加工室的段以蛇形连通的配置相比，这些配置增加了流体连通的数量，特别是不同尺寸和形状的连通通道，使得难以设计足够的接种流；并且，在堆叠配置的情况下，对加工室的内容物进行光学显微镜分析变得更加复杂。
[0104]
根据一个实施方案，微流控设备包括可渗透气体的膜，其形成加工室的顶表面和/或底表面的至少一部分。该膜的目的是提供气体交换(该膜也可以称为气体交换膜)。为此，将包含给定浓度的气相或溶解在液体中的气体的气体交换介质定位在可渗透气体的膜的相对于加工室向外定向的一侧。这个实施方案很有趣，例如用于处理对溶解气体浓度敏感的颗粒或用于处理能够化学转化溶解气体的颗粒例如活体动物细胞。
[0105]
根据一个实施方案，微流控设备包括聚合物部分，该聚合物部分包括加工室和在其中形成的接种、收获和连通通道，该聚合物部分通过可渗透气体的膜密封。聚合物部分可由弹性体或刚性聚合物制成，例如环状烯烃共聚物(coc)。在该实施方案中，形成加工室的顶表面或底表面的可渗透气体的膜还可以形成微流控设备的接种、收获和连通通道的顶表面或底表面。例如，聚合物部分可以通过注塑或热压花来制造。可渗透气体的膜可以有利地由可透光材料制成以保持成像能力，可透光材料例如过氧化物或铂固化的硅酮。可以使用本领域已知的任意常规组装方式来组装聚合物部分和可渗透气体的膜。特别地，可渗透气体的膜可以是可变形的并且局部用作激活的连通通道或阻塞装置。
[0106]
如果可渗透气体的膜形成加工室的顶表面，则每个输入接种通道、输出接种通道和连通通道与加工室的接合部可以位于加工室在高度方向上的下部。当在聚合物部分上报告可渗透气体的膜时，这种配置允许与加工室进行气体交换的简单设置，而无需修改输入接种通道、输出接种通道和连通通道的几何形状。
[0107]
相反，如果可渗透气体的膜形成加工室的顶表面，则每个输入接种通道、输出接种通道和连通通道与加工室的接合部可以位于加工室在高度方向上的上部。具有可变形的可渗透气体的膜的这种配置允许简单地限定阻塞装置，推动膜以挤压连通通道。
[0108]
根据一个特征，将可渗透气体的膜设计成具有足以保持其形状并保持其高度上的压力差的厚度。然而，也应避免可渗透气体的膜过厚，特别是由于气体交换的诱导限制和膜在加工室中由于其弹性变形而坍塌的风险，例如在外部向微流控设备施加压力以避免泄漏。举例来说，例如由硅酮制成的气体交换膜，根据其气体扩散和机械性能，其厚度可为10μm至2mm，优选15μm至1mm，更优选20μm至250μm。
[0109]
当可渗透气体的膜形成加工室的底表面的至少一部分时，颗粒在接种后可位于可渗透气体的膜上，因此由于颗粒与相对于加工室向外定向的可渗透气体的膜外侧之间的距离减小，因此允许更好地控制溶解气体浓度。也可以通过使用化学改性的可渗透气体的膜，特别是化学涂覆的可渗透气体的膜，获得加工室底表面的特定生化性质例如选择性黏附性质，例如使用可用于将抗体或抗体部分结合至加工室的底表面的硅烷。
[0110]
当可渗透气体的膜形成加工室的顶表面和/或底表面的至少一部分时，为微流控设备配备“气体芯片”可能是有利的，“气体芯片”配置为控制在可渗透气体的膜外侧的气体交换介质中的流或扩散，并且还任选地在可渗透气体的膜外侧提供机械支撑。气体芯片有利地由可透光材料制成以保持设备的成像能力。因为气体芯片不与经加工的颗粒直接接触，所以可以使用多种材料。气体芯片可以包括互连的通道或室，它们的底表面或顶表面由
可渗透气体的膜形成。
[0111]
在一个优选的实施方案中，气体芯片包括具有柱阵列或通道阵列的室，该阵列面向加工室定位，以便限制可渗透气体的膜相对于加工室向外的变形。在这种情况下，气体芯片的室和柱阵列或通道阵列优选布置成最小地影响加工室内容物的成像，例如通过降低柱或通道的高度并增加它们的密度。这种布置使得可以保持微流控设备的几何形状，特别是当微流控设备中的压力高于气体交换介质中的压力时，即使在可渗透气体的膜和设备的其他部分之间没有强化学键的情况下，通常是这种情况，特别是由于难以在塑料和硅酮之间建立牢固的化学键。也可以优化气体交换介质以减少对成像的干扰。举例来说，气体交换介质可以是在所选择的成像光谱上基本可透光的液体，例如，可见光谱，并且在所选成像光谱中具有与气体芯片材料相匹配的折射率。
[0112]
气体芯片还优选地包括用于更新气体交换介质的输入和输出通道，其可以连通至被配置为更新气体交换介质或调节其气体浓度的外部模块。气体芯片的输入和输出通道优选地布置成避开面向微流控设备的输入和输出接种通道的区域，例如，通过遵循输入和输出采集通道的路径。气体芯片的另外的通道可以布置成面向连通加工室以用于收获流的微流控设备的流体连通器。这样的布置允许更好地控制和更均匀的接种。气体芯片和包括可渗透气体的膜的微流控设备可以使用本领域已知的任意常规组装方式来组装，例如共价键合、黏合剂、机械夹紧、磁力夹紧等。
[0113]
本发明的另一个主题是使用如上所述的微流控设备加工颗粒特别是细胞的方法，该方法包括：
[0114]-通过将接种流经输入接种通道、连通通道和输出接种通道施加至加工室来用颗粒接种加工室同时阻塞输入收获通道和输出收获通道的步骤，
[0115]-通过将收获流经输入收获通道和输出收获通道施加至加工室从加工室收集颗粒同时阻塞输入接种通道、连通通道和输出接种通道的步骤。
[0116]
在该方法的特定实施方案中，在流体连通器被阻塞的同时完成加工室的接种步骤。
[0117]
在以上部分和文件的其余部分中，当一组通道被阻塞时，其是指，至少，该组的通道与微流控设备或任意其他设备的外部之间的流被例如通过定位在微流控设备中或定位在与其连通的流线上的一个或若干个阀阻止。虽然所考虑的通道组被阻塞，但在这组通道和它所连通的加工室的段之间可出现一些流。但是，当使用此表达时，通常优选阻止该组通道内的任意流。
[0118]
通过收获通道将收获流施加至加工室，同时接种通道被阻塞，以相对低的液压阻力提供足够的剪切速率以非常有效地从加工室回收颗粒。
[0119]
根据一个实施方案，在施加收获流之前，可以通过在接种通道中灌注闭塞材料例如适当尺寸的珠来阻止接种通道中的流。这在收获流期间接种通道中的流是高的并且干扰收获的情况下发现是特别有利的。
[0120]
根据一个实施方案，对加工室进行接种的步骤是通过施加由静止时间分开的接种流的连续脉冲来执行的。通过这种方式，悬液中的颗粒通过流经加工室的段和从输入接种通道到输出接种通道的连通通道的流以脉冲方式灌注，而收获通道以及，视情况而定的流体连通器被阻塞，这导致悬浮颗粒沿输入接种通道向下行进至加工室的段和连通通道中，
沉降并保持被捕获在加工室中。任选地，每个接种流脉冲，即从输入接种通道至输出接种通道的每个接种流脉冲，可以被较小体积的反向接种流脉冲分开，即从输出接种通道至输入接种通道反向接种流脉冲，该反向接种流脉冲两侧暂时有接种暂停。此选项允许在接种期间限制加工室下游的颗粒损失，并通过补偿流的非平坦速度分布来提高接种的均匀性。
[0121]
在改进的实施方案中，每对接种脉冲被两侧是两个接种暂停的反向流接种脉冲分开，其中接种脉冲具有较大的比率r且反向流接种脉冲具有较小的比率r。在本发明中，接种流的比率r代表接种流的体积除以加工室的体积，即所有串行布置的段的体积之和。直接接种脉冲的比率r记为r_dir，而反向流脉冲的比率r记为r_rev。与普通(直接)接种脉冲相比，反向流接种脉冲以相反的流速施加，即反向流是从输出接种通道至输入接种通道。反向流接种脉冲的流速绝对值的选择类似于直接接种脉冲的绝对值。在正常接种脉冲之间添加的反向流接种脉冲，其全部由接种暂停分开，允许使用r_dir更高的直接接种脉冲，从而更好地分配加工室的段内的细胞，但通常在脉冲之后有许多细胞驻留在输出接种通道中。暂停后的反向流接种脉冲然后允许恢复这些细胞并将它们沉积在最靠近输出接种通道的通常较少细胞被接种的室中，从而进一步提高接种均匀性。每个接种脉冲(直接或反向流动)之间的暂停允许沉积在加工室的各段中的细胞不会因后续脉冲而显著移位。r_dir可为100％至250％，而r_rev可为20％至170％。在特定实施方案中，直接接种流后跟反向接种流的有效比率r是r＝r_dir-r_rev并且可为70％至110％。
[0122]
根据一个实施方案，从加工室收集颗粒的步骤通过在接种通道被阻塞时连续施加不同流速的收获流来执行。收获流的不同流速有利地适于收集颗粒，所述颗粒具有不同数量级的黏附至加工室的表面和/或它们受到的不同流诱导力和/或与其他颗粒的不同聚集状态。
[0123]
通过以下对根据本发明的微流控设备和用于加工颗粒的方法的实施方案的描述，本发明的特征和优点将变得显而易见，该描述仅作为示例并参考附图给出。
附图说明
[0124]
图1是根据本发明第一实施方案的微流控设备的俯视图，
[0125]
图2是沿图1的ii-ii线的截面图，
[0126]
图3是根据本发明的微流控设备的第二实施方案的类似于图1的视图，
[0127]
图4是根据本发明的微流控设备的第三实施方案的类似于图1的视图，具有两种配置：图4a具有永久的连通通道，图4b具有激活的连通通道。
[0128]
图5是根据本发明的微流控设备的第四实施方案的类似于图1的视图，
[0129]
图6和图7是根据本发明第五实施方案的微流控设备的两种变体的截面图，
[0130]
图8a、图8b、图8c是配备有根据本发明第六实施方案的三个变体的气体芯片的微流控设备的截面图，和
[0131]
图9a、图9b、图9c分别是图7a、图7b、图7c的每个变体中的气体芯片的俯视图。
具体实施方式
[0132]
第一个实施方案——相同的段
[0133]
在图1和图2所示的第一实施方案中，微流控设备1包括加工室2，该加工室2包括沿
纵轴x延伸的两个段21。在该实施方案的第一变体中，两个段21是相同的。微流控设备1还包括限定多个输入接种通道33的单个输入接种树3和限定多个输出接种通道43的单个输出接种树4。输入接种通道33和输出接种通道43与加工室的第一段和第二段21的接合部31、41分别沿着第一段和第二段21的一侧分布。微流控设备1还包括连通通道73，每个连通通道都具有与两个段的接合部71。两个段都相对于输入接种树3和输出接种树4串行布置。
[0134]
更具体地，在该特定实施方案中，输入接种树3和输出接种树4是二叉树，它们在串行布置的段21的两侧彼此相对地布置。输入接种通道33和输出接种通道43被配置为沿横贯段21的纵向方向x的方向y限定接种流。每个接种二叉树3、4在液压阻力方面是对称的，这有利于确保接种流均匀。
[0135]
输入接种通道33与第一段21的相邻接合部31之间、输出接种通道43与第二段21的相邻接合部41之间以及连通通道73与两个段21的相邻接合部71之间的间距p是相同的，这也有助于加工室2的接种流均匀和灌注均匀。从图2中能够看出，每个输入接种通道33和连通通道73与第一段21的接合部31、71在高度方向z上位于加工室2的上部。输出接种通道43配置相同(未示出)。这种配置利用惯性，在适当的接种流速下，在接种脉冲之后在加工室内更均匀地分布颗粒。然后能够使用接种暂停来允许颗粒沉积在加工室的底部表面22上。相反，在较低的流速下，在重力的作用下，可以发现颗粒沿着较低的流线f移动，如图2所示，这在接种均匀性方面不太有利。
[0136]
以有利的方式，段21的底部表面22设有颗粒黏附涂层，例如黏附肽、ecm分子或片段、抗体、纳米抗体、细胞膜锚定分子。例如，段21底部表面可以涂有硅烷-peg-生物素或pll-peg-生物素，然后生物素-链霉亲和素连接可以用来移植特定的生物分子。反过来，输入接种通道33和连通通道73有利地设有涂层以减少颗粒的黏附，涂层例如基于bsa、phema、pll、peg、羧基甜菜碱、琼脂、纤维素、壳聚糖或其聚合物或共聚物的亲水涂层。通过在培养期间施加液体溶液的流动，特别是在培养期间重复来回的流动，发现通过对涂层反应物的液体溶液的培养显著改进了微流控芯片的涂层，特别是在均匀性方面。此外，可以将足够小的不会堵塞通道并且在涂覆后易于清洗的固体颗粒添加至涂层溶液中，以促进通过流动诱导的旋转进行混合。
[0137]
在该实施方案中，比率rs_input、rs_output和rs_connect高于50，而比率rh_input和rh_output低于20。
[0138]
在本实施方案中，加工室的段21垂直于横向方向y的横截面s
21
与输入接种通道33在与加工室2的接合部31处的横截面s
31
之和的比率高于15。此外，加工室的段21在横向方向y上的宽度w与段21在高度方向z上的高度h的比率大于20。以这种方式，加工室的段21是浅的段，其中层流导致包含在该段中的大部分流体的对流置换。与加工室的段21的侧壁的角度进一步促进了段21中包含的流体的完全更新。
[0139]
微流控设备1还包括两个输入收获通道53和两个输出收获通道63，它们被配置为在加工室2的段21的纵向方向x上连续限定收获流。如图1所示，输入收获通道53和输出收获通道63与加工室2的段的接合部51、61被倒角，这有利于收获流的均匀性。接种、收获和连通通道33、43、53、63、73被配置为使得在加工室的段21中施加收获流时，每个接种通道33、43或连通通道73中的绝对流速小于在输入收获通道53与加工室2的段21的接合部51处施加的收获流的流速的2.5％。
[0140]
在该实施方案中，输入接种树3在其通道体积的一半以上中，输入接种通道33的接种剪切速率指标ssi与加工室的段21的平均接种剪切速率指标ssi的比率高于20，其中通道或段的接种剪切速率指标ssi被定义为：
[0141][0142]
其中，tq是流经所考虑的通道或段的接种流量的百分比，它等于所考虑的通道或段中的接种流量q与总接种流量qtot的比率，s是接种流的垂直于通道或段纵向纤维截取的通道或段的横截面，h为沿高度方向z截取的通道或段的高度。
[0143]
在第一实施方案的非限制性实例中：
[0144]-加工室2的段21是相同的并且具有100μm的高度h和5mm的宽度w，
[0145]-接种通道33、43和连通通道73在与加工室2的段21的接合部31、41、71处的横截面s
31
为100μm宽乘50μm高，
[0146]-输入接种通道33的相邻接合部31之间的间距p、输出接种通道43的相邻接合部41之间的间距p和连通通道73的相邻接合部71之间的间距p是恒定的并且等于1.25mm，
[0147]-加工室2的垂直于高度方向z的表面大于0.25cm2。
[0148]
在该实施方案中，加工室2的上壁10和下壁12在高度方向z上对可见光、近红外和近紫外波长是可透光的，例如上壁10或底壁12由环烯烃共聚物(coc)制成。通过这种方式，能够通过在微流控设备1的壁上成像来监测生物加工。在本实施方案中，加工室2的段21的上壁10和下壁12为平面且平行，便于对焦和成像。
[0149]
第一实施方案——不同的段
[0150]
在第一实施方案的这个变体中，段21是不同的。
[0151]
此后，第一段21对应于通过接合部31连通至输入接种树的段，而第二段21对应于通过接合部41连通至输出接种树的段。
[0152]
更具体地，第一段和第二段的不同之处在于它们的高度和/或与细胞黏附有关的表面涂层。
[0153]
在一个实施方案中，第一段的高度为50μm至100μm，而第二段的高度为100μm至300μm。
[0154]
在一个实施方案中，第一段被涂覆为抗黏附的(细胞不黏附至表面)，而第二段被涂覆为黏附的(细胞确实黏附至表面)。
[0155]
在一个非限制性实例中，第一段可以较薄(75μm高)并涂覆成抗黏附的(聚乙二醇涂层)，而第二段可以较厚(高150μm)并涂覆成黏附的(聚-l-赖氨酸涂层)。这种配置允许用收获流模式将细胞带入第一段21。通过抗黏附涂层防止细胞黏附。然后可以用接种流模式将细胞从第一段转移至第二段。在第二段，细胞沉积在段的底部并最终黏附在表面。接种过程因此得到改进。实际上，这允许使用较高的流速将细胞带入第一段，从而减少典型设置中细胞的上游损失。然后使用较小的流速在第二段中容易地置换细胞，这种置换已经存在于第二段中的细胞的风险较小。总体而言，这允许将来自上游体积的细胞悬液的输入流速与第二段中细胞悬液的接种流速解耦，以选择对这两个方面都最佳的值。此外，它允许在置换第二段中的细胞之前使用第一段的光学监测，以在接种第二段之前检查它们的质量。
[0156]
第二实施方案
[0157]
在图3所示的第二实施方案中，与第一实施方案相似的元件具有相同的附图标记。第二实施方案的微流控设备1与第一实施方案的不同之处在于，单个输入收获通道53和单个输出收获通道63被输入和输出收获二叉树5和6所取代，输入和输出收获二叉树5和6与加工室2的段21具有带倒角的接合部51、61。与第一实施方案相比，收获树5和6提供较均匀的收获流。注意，在该第二实施方案中，收获树5、6和接种树3、4不能互换。实际上，在给定的流速下，收获流在加工室内提供比用接种流使用同一流速来灌注微流控设备时高得多的剪切速率。
[0158]
在该实施方案中，比率rs_input、rs_output和rs_connect高于50，而比率rh_input和rh_output低于20。
[0159]
第三实施方案
[0160]
在图4所示的第三实施方案中，与第一实施方案相似的元件具有相同的附图标记。第三实施方案的微流控设备1与第一实施方案的不同之处在于加工室2包括通过流体连通器24连通的四个段21，这允许收获流串行通过所有段。在该第三实施方案中，微流控设备1包括与第一段接合的单个输入接种树3和与第四段接合的单个输出接种树4以及第一段与第二段、第二段与第三段、第三段与第四段之间的连通通道，这允许接种流串行通过所有段。这种配置对于微流控设备的紧凑性和整个加工室2的接种流的均匀性二者都是有利的。由于不需要第二通道层，因此以相对简单的设计和相对简单的制造工艺将流体连通器24设置成蛇形配置使得可以优化微流控设备1的容量及其尺寸二者。
[0161]
在图4a中，阻塞装置(以阴影框表示)被设置在所有接种通道、永久的连通通道和收获通道上。接种流期间，打开和关闭这些阻塞装置降低了收获通道中的寄生流，反之亦然。
[0162]
在图4b中，阻塞装置(以阴影框表示)被设置在所有接种通道和收获通道上。连通通道在这里是激活的连通通道。3个激活的连通通道81布置在整个加工室中，限定了四个细长段。挤压时，激活的连通通道限定了3个薄而大(与段长度一样大)的连通通道。在进一步变形时，激活的连通通道可被完全挤压，厚度几乎为零，从而限定了阻塞装置。
[0163]
在该实施方案中，在加工室的上壁10与下壁12之间的段添加柱(由规则设置的圆圈表示)。这些柱提高了机械阻力并限制了微流控设备在操作期间受压力变化时的变形。
[0164]
在该实施方案中，比率rs_input、rs_output和rs_connect高于50，而比率rh_input和rh_output低于20。
[0165]
第四实施方案
[0166]
在图5所示的第四实施方案中，与第一实施方案的元件相似的元件具有相同的附图标记。第四实施方案的微流控设备1与第三实施方案的不同之处在于加工室的四个段21与单个输入收获树和单个输出收获树接合。在该实施方案中，收获流是并行进行的。通过适当地使用阻塞装置，可以在加工室2的一些段21上而不是同时在所有段21上限定收获流。
[0167]
在该实施方案中，比率rs_input、rs_output和rs_connect高于50，而比率rh_input和rh_output低于20。
[0168]
第五实施方案
[0169]
在图6和图7所示的第五实施方案中，与第四实施方案的元件相似的元件具有相同
的附图标记。第五实施方案的微流控设备1与第四实施方案的不同之处在于，设备的所有通道和段共享由可渗透气体的膜8形成的共同底部表面，可渗透气体的膜8由硅酮制成并且具有50μm至2mm恒定厚度。作为变体，可渗透气体的膜8可以由与生物医学用途兼容的任意其他材料制成，并且优选是可透光的。微流控设备的其余部分由聚合物部分形成，例如由聚苯乙烯(ps)或环状烯烃共聚物(coc)制成。
[0170]
图6示出了可渗透气体的膜8形成微流控设备1的上部的配置，而图7示出了可渗透气体的膜8覆盖有附加刚性板80的配置。附加刚性板80可以在流操作期间限制可渗透气体的膜8的变形。有利地，在流操作的持续时间内，刚性板80位于可渗透气体的膜8上方，并且使用任意合适的装置，特别是机械装置，将等于或大于灌注压力的平均压力施加至刚性板80上。为了允许在流操作之外通过可渗透气体的膜8进行气体交换，刚性板80优选在流操作之后被移除。
[0171]
第六实施方案
[0172]
在图8a、图8b、图8c和图9a、图9b、图9c所示的第六实施方案中，与第五实施方案相似的元件具有相同的附图标记。第六实施方案的微流控设备1与第五实施方案的不同之处在于，它还包括位于可渗透气体的膜8外侧的气体芯片9，其相对于加工室的段21向外定向，配置为用于控制流或气体的扩散。气体芯片9优选地由刚性和可透光的聚合物材料例如聚苯乙烯(ps)或环状烯烃共聚物(coc)制成。气体芯片9由可渗透气体的膜8封闭并且包括面向加工室定位的室910，该室910设有如图8a、图9a和图8b、图9b的实例中所示的通道92的阵列，或者设有如图8c、图9c的实例中所示的柱911的阵列，通道92或柱911的阵列与可渗透气体的膜8接触。
[0173]
调整通道92或柱911的高度和间距，以便当加工室中的压力大于气体交换介质中的压力，例如相差1巴时，气体芯片中的可渗透气体的膜8塌陷的风险被降至最低。支撑可渗透气体的膜8的通道92或柱911优选地具有小于100μm的高度，优选地小于50μm；纵横比接近1，优选地小于1；以及它们宽度数量级的间距，例如它们宽度的两倍。在使用密集布置的通道92的情况下，通道92被布置成通过扩散和对流提供对存在于气体芯片中的气体交换介质中的气体浓度的有效控制。如图所示，低液压阻力通道可以沿着加工室的段21的纵向轴线添加至气体芯片，以允许以较低压力更新气体交换介质。
[0174]
当为输入接种二叉树3选择上述横截面时，可以为输出接种二叉树4选择相同的横截面。此外，当为输入接种二叉树3选择上述横截面时，灌注加工室2的段21的相邻接种通道33在其与加工室的接合部之间的间距p可以选择为1mm，加工室2的高度h可以选择为100μm，加工室2的宽度w可以选择为5mm。
[0175]
连续循环
[0176]
作为以上公开的所有实施方案的变体，循环泵可用于使培养基连续流动通过接种流模型。泵流体连通至输入接种树根30和输出接种树根40。通过低流速的连续流，培养基被更新而不会发生细胞移位。这种循环泵可以集成至微流控设备，例如使用集成至微流控设备中的微型蠕动泵。
[0177]
方法
[0178]
使用微流控设备1的上述实施方案中的任一项来加工细胞的方法包括如下所述的步骤。
[0179]
任选步骤-加工室的涂覆
[0180]
微流控设备1的涂覆的任选步骤配置为在加工室2内产生一种或多于一种涂层反应物的均匀涂层。
[0181]
使用如上所述的微流控设备1，第一涂层溶液通过接种流或通过收获流流动。激活阻塞装置是指当可用时，在使用收获流时限制接种和连通通道的涂覆。将涂层溶液在微流控设备内培育可变的时间段，通常约为30分钟。设备1在该过程期间优选地保持在恒定的涂覆温度下，所述温度是根据所选涂层来选择的。取决于涂层的类型，该设备可以在涂层溶液培育之前例如通过氧等离子体来激活。为了获得均匀的涂层，优选在培育期间保持涂层溶液流动，例如通过来回的流。可以将足够小而不会阻塞通道的但尽可能大的颗粒如珠添加至涂层溶液中，前提是在涂覆后它们能够被有效地消除，以便通过混合流进一步增加涂覆的均匀性，因为流内的剪切引起颗粒旋转。
[0182]
涂覆可包括用若干种涂层溶液重复上述涂覆步骤以产生多层涂层。
[0183]
接种加工室
[0184]
将借助于微流控设备1的接种步骤配置为使得细胞在加工室2内均匀分布。注意，接种应该相对快速地进行，特别是在出现贴壁细胞的情况下，以避免接种前的条件对细胞的影响，例如失巢凋亡、设备上游细胞的不希望的黏附、聚集。
[0185]
使用如上所述的微流控设备1，通过接种流脉冲来接种细胞，接种流脉冲也称为接种脉冲，其占的体积通常为加工室2的体积数量级，通常为加工室体积的r＝40％至r＝200％。然后，如果待接种的细胞悬液占加工室2体积的x倍的体积，则需要大约x/r个接种流脉冲来接种它们。附加接种脉冲称为二次接种脉冲，也与“无细胞”培养基输入一起执行，以便接种特别是由于沉降和分散而留在上游的细胞。
[0186]
对于每对连续的接种脉冲，脉冲由静止时间或接种暂停分开，允许最近接种的细胞在加工室2中沉降。为了加速沉降并因此加速接种过程，将细胞接种在低至中等黏度和弹性可忽略的培养基中是有利的，例如交联的水凝胶不优选作为接种培养基，低至中等黏度的培养基例如在37℃下运动黏度不超过水的五倍的培养基。例如，对于包括高度串行布置的段各自的高度为100μm、宽度为5mm和长度为80mm的加工室：加工室的体积为320μl，接种流速能够在0.125μl/s与100μl/s之间选择，这主要取决于细胞沉降速度。3.75μl/s的典型值作为进一步优化前的首选，根据细胞沉降速度能够使用5s到1200s的接种暂停。100s至300s之间的典型值用作进一步优化之前的首选。假设在接种脉冲期间接种细胞的位置分布广泛，能够选择190μl(r_dir＝60％)的接种脉冲作为第一值。该值根据接种脉冲期间接种细胞的实际位置分布进行调整。在这种情况下，建议一个，优选两个至十个二次接种脉冲，以确保非常低的上游细胞损失率。二次接种脉冲的数量应调整为接种流中加工室2上游的总体积，该总体积包括用于灌注微流控设备1的潜在管道和其他附件。或者，能够选择480μl(r_dir＝150％)的接种脉冲，然后选择224μl(r_rev＝70％)的反向流，产生r＝80％的有效比率，作为进一步优化之前的首选。
[0187]
为避免长的接种时间，优选地将待接种的细胞悬浮在x/r低于20的培养基体积中。太低的值例如x/r＝1也不优选，因为分散的输入细胞悬液可强烈影响沿加工室宽度的接种的均匀性。建议x/r值为3至10。使用这样的参数和300秒的接种暂停，初始接种脉冲在大约30分钟内执行，这是可接受的持续时间。由于包括沉降和分散在内的各种原因，向上游较慢
地行进的很少细胞，可能经历更长的接种过程持续时间，发现这点不会危及本发明的优点。注意，该方法提供了细胞悬液的浓度。这是本发明的另一优点，因为在生物生产中经常需要浓缩细胞悬液。通过在生物加工设备中集成浓缩功能，减少了对细胞浓缩专用模块的需求，从而简化了生物生产方案的实施。
[0188]
任选的加工室的进一步接种
[0189]
当需要执行两个接种步骤，例如在同一加工室中连续接种两个不同的细胞群时，能够在第一步骤之后执行如上所述的第二接种步骤。当两次接种之间不需要延迟时，可以使用第二接种初始脉冲作为第一接种的二次接种脉冲。通过这样做，本发明有利地允许同时混合和浓缩两种不同的细胞群。
[0190]
加工室的三个或多于三个接种的步骤能够与上述第二接种类似地顺序地执行。然后，再一次，下一个接种初始脉冲能够用作先前接种的二次接种脉冲。
[0191]
任选步骤-培养基的更新
[0192]
许多生物生产的普通操作涉及在不收获细胞的情况下部分或大量地更换培养基，它们在下文中称为培养基更新步骤。
[0193]
培养基更新步骤例如通常用于细胞扩增、分化、病毒转导(或其他基因编辑方法)、标记、加标签、染色、过滤、解冻、冷冻(等)方案。
[0194]
在生物生产中，培养基更新通常必须按体积准确进行，以在加工室内产生均匀的培养基，以避免下游细胞的损失，以避免暴露于机械应力或其他扰动。
[0195]
任选步骤-通过接种通道和连通通道进行培养基更新
[0196]
为了使用根据本发明的微流控设备1来做到这一点，用接种流模型在加工室2的所有段中串行分配流，同时对细胞的压力最小并且细胞损失的风险最小。对于部分更换培养基，将添加的体积注入加工室2中，然后通过来回流或循环流或两者的组合进行均质化。
[0197]
在这种培养基更新操作期间，选择流速以避免压力过大(流速过高)或操作过慢(流速过低)。流速也根据细胞进行选择，以降低不希望的细胞损失的风险。这些培养基更新操作的允许流速取决于加工室2的潜在涂层以及细胞的类型。此外，优选在细胞损失可忽略不计的范围内选择高流速，以允许更快地操作和更有效地清除某些化合物，例如非细胞囊泡、细胞碎片、垂死或死细胞。
[0198]
在某些实施方案中，流的回路可以部分或全部由气体可渗透(或半渗透或选择性渗透)材料制成，以提供气体交换，特别是co2和o2的交换。当加工室2的气体渗透率低时，这种类型的设置特别有用，以避免过于频繁地更换培养基。
[0199]
在某些实施方案中，能够发现频繁更换一小部分培养基而不是较不频繁更换大部分培养基对减少培养基参数例如营养物浓度的波动来说是有利的。实际上，较小和较频繁的变化导致加工参数的不那么突然变化，能够发现这会导致较稳健和可再现的过程。
[0200]
在某些实施方案中，能够发现通过用较少量的浓缩溶液而不是较大量的较低浓度溶液更换培养基来增加一种或若干种培养基的浓度来说是有利的。事实上，更换较少量的体积可以避免不必要地培养基成分的消除，这样的浓度比那些需要较频繁添加的浓度衰减得慢。此外，这种类型的操作导致细胞分泌的化合物的稀释度较低，能够发现这些化合物对维持或进化细胞表型具有重要作用，例如干细胞的维持和分化。
[0201]
在某些实施方案中，能够发现通过使用循环泵连续流动培养基是有利的。
[0202]
任选步骤-通过收获通道进行培养基更新
[0203]
在某些和不太常见的实施方案中，特别是当发现细胞对加工室具有相对较高的黏附性时，能够发现收获流模型中的培养基更新是有利的。在以下情况下尤其如此：
[0204]-需要较高的剪切速率来消除诸如垂死细胞、死细胞、非细胞囊泡、细胞碎片、血小板、红细胞等物体，
[0205]-需要高剪切速率来触发机械转导，
[0206]
在某些实施方案中，这些操作仅在线性流中执行，在其他的实施方案中仅在循环流中执行，在又一些实施方案中在线性流和循环流的组合中执行。
[0207]
任选步骤-通过两种通道进行培养基更新
[0208]
当需要完全清洗设备以消除化合物例如化学物质、酶、病毒时，可以同时或顺序地并最终重复地使用接种和/或收获通道进行培养基更新。
[0209]
这些操作至少包含一些线性流，但它们有时也包含一些循环流。
[0210]
任选步骤-使用穿过封闭加工室的可渗透气体的膜的扩散交换来维持气体浓度
[0211]
加工室中的气体浓度有利地通过穿过可渗透气体的膜的扩散交换获得，因此允许减少培养基消耗以补偿例如在活细胞的情况下的氧消耗。为了提供这种扩散交换，气体交换介质，例如具有所需成分的气体混合物，或具有调节溶解气体浓度的液体，被设置在与加工室相对的可渗透气体的膜的外侧。为了提供稳定的加工条件，或根据加工室中气体浓度改变加工条件，具有调节的气体浓度的气体交换介质在气体交换介质的与加工室相对的一侧以适合于加工室中气体浓度的期望变化速度或适用于补偿加工室中的气体浓度变化的速率更新，这些变化可能是由于例如代谢活动引起的。
[0212]
在包括气体芯片的实施方案中，使用诸如泵、气体源或交换器的常规装置，气体交换介质流过气体芯片，从其输入端到其输出端。气体芯片可以很好地控制加工室中的气体浓度更新，并减少所需的气体交换介质体积。当要扩散至加工室中的气体来自诸如包含高分子纯度气体的高压容器的源时，这尤其令人感兴趣。
[0213]
收获加工室
[0214]
收获能够包括以下步骤，下面指示的顺序仅是非限制性实例。以下步骤能够以任意顺序和任意类型的实现执行或不执行任意次数：
[0215]-根据培养基更新方法之一清洗加工室2或整个微流控设备1，
[0216]-通过将细胞脱离反应物例如酶注入加工室2中来更新培养基。该步骤能够根据任意培养基更新方法进行，但优选使用仅使用接种通道33、43的方法，
[0217]-附加物理处理，例如温度、振动、电场、磁场、用可见光或不可见光例如紫外线或后者的组合进行照明，以促进细胞脱附，
[0218]-清洗加工室2。该步骤能够根据任意培养基更新方法进行，但非常优选地使用仅使用接种通道33、43的方法，
[0219]-仅使用收获通道53、63回收细胞，同时接种通道33、43在其末端被尽可能生硬地阻塞，收获溶液的流如培养基或缓冲液施加至微流控设备1和在输出端中收获的细胞中。考虑到微流控设备1及其附件的机械完整性的约束，相对于产生的压力和细胞机械敏感性的约束，选择该操作的代表性剪切速率为允许的最高速率。允许有效回收对加工室壁残留黏附性低的细胞的典型剪切速率为100s-1
至10000s-1
；然而，在特定情况下，例如细胞对剪切
非常敏感，或者相反，细胞对加工室壁具有高残留黏附性的情况下，可以使用超出此范围的值，
[0220]-可以任选地执行微流控设备1的成像，特别是加工室2的成像，以评估收获的功效，特别是当使用比通常更低的剪切速率时。
[0221]
在细胞回收期间通过微流控设备1冲洗的体积至少等于加工室2的段21、中间和下游流的路径体积的总和至回收体积。优选地，使用两倍于该最小量或大于两倍于该最小量的体积。作为在进一步优化之前使用的首选值，建议使用三倍于上述最小体积的体积。
[0222]
在某些实施方案中，在细胞回收期间使用的流速连续或不连续增加。但是，除非特定情况表明它有用，否则不建议这样做。可表明在细胞回收期间增加的流速的相关性的因素可以例如是加工室2内的非常高的细胞密度。在这种情况下，细胞密度能够增加流速阻力，因此在细胞回收过程中增加流速能够通过逐渐减少设备中细胞的数量来避免压力过大。在这种情况下，能够有利地监测上游压力以调节流速并避免压力过大和泄漏风险。
[0223]
任选步骤-细胞分选
[0224]
由于细胞在加工室2中可具有不同类型的黏附到涂覆或未涂覆的加工室或其他细胞的黏附性，并且由于它们也可具有不同的形状和大小，因此可以利用微流控设备1内的这些差异选择性地收获某些细胞和/或选择性地保留某些细胞以实现细胞分选。
[0225]
在一些实施方案中，加工室2预先涂覆有一种或若干种化合物(结合锚)，例如抗体、纳米抗体、ecm分子、ecm分子的片段、与分子特异性结合的肽(结合靶)，这在要彼此分离的两组细胞之一的细胞表面比在第二组细胞的表面较常见。
[0226]
加工室可以涂覆有图案，该图案包括抗黏附区域和用于结合锚的结合位点，以增加颗粒黏附的特异性。例如，加工室底部表面(以及最终的其他表面)可以用pll-peg-生物素或硅烷-peg-生物素涂覆，并且链霉抗生物素蛋白键可以用于与结合锚结合，结合锚例如生物素化抗体或抗体片段。在这种情况下，peg-生物素涂层可以在设备包装之前进行，并且结合锚可以由用户根据他们希望进行的分选类型添加。在这种情况下，抗黏附区域限制了颗粒在室中的非特异性黏附，从而提高了颗粒分选的选择性。
[0227]
在一些实施方案中，根据上述方法之一将细胞接种在加工室2中。在一些实施方案中，在接种步骤之后向加工室2施加小而强的来回脉冲以降低重叠细胞的频率。这样的脉冲应该占小于加工室体积的25％的体积，并且至少与接种流脉冲一样强。
[0228]
在一些实施方案中，通过在接种通道33、43和连通通道73在它们的末端被阻塞的同时施加通过收获通道53、63的流来执行第一回收。在这样的实施方案中，对加工室表面、涂层或黏附非常强烈的其他细胞具有较低黏附性的细胞被优先回收，使得在流的输出端中富集这些细胞并在加工室2内的耗尽那些细胞。在一些这样的实施方案中，流速连续地或不连续地增加至稍低于那些损害感兴趣的细胞的生存力的值或那些损害装置机械完整性的值。在一些这样的实施方案中，在该流期间从加工室2获得的体积根据所施加的流速范围被分开。在一些这样的实施方案中，在该操作期间，例如使用定位在收获通道63的输出端处的成像传感器来监测每单位时间回收的细胞的数量。在一些这样的实施方案中，每单位时间回收的细胞数量的测量值用于调节流速。在一些这样的实施方案中，当每单位时间回收的细胞数量的测量值低于先前定义的阈值时，流速被自动增加，直至特定速率的最大值。
[0229]
在一些实施方案中，根据上述收获方法之一的收获(第二回收)在应用第一分选流
以回收留在加工室2中的一些也可能是全部的细胞之后执行。
[0230]
在一些实施方案中，将在第一回收或第二回收期间收集的分选部分之一再次接种在加工室2中，或类似微流控设备的加工室中，以进行另外的分选。可以进行任意次数的此类分选重复以获得所需的细胞群组成和纯度。任选地，不同的结合位点可用于按多个特征分选细胞。
[0231]
从前面的实例能够看出，根据本发明的微流控设备提供了一种新颖的几何形状，其中高容量的加工室连通至对应于两种不同的流模型的两组通道，两种不同的流模型即接种流模型和收获流模型。接种流模型使得可以获得加工室的均匀和高效接种，同时上游和下游颗粒沉积的风险低，并且使得微流控设备能够浓缩和洗涤颗粒悬液，而收获流模型提供了快速、有效和高效的收获。通过将这些功能集成到一个微流控设备中，本发明特别适用于实现自动化和/或小型化的生物生产，这具有许多技术优势，例如由于转移步骤数量的减少而提高了颗粒和反应物效率。这种独特的配置具有另外的优势，即仅使用一个通道层，无需过滤膜，从而大大降低了制造复杂性和成本。
[0232]
本发明不限于所描述和示出的实施例。
[0233]
特别地，在上述说明性实施方案中，微流控设备包括用于加工室的若干段的与连通通道连通的单个输入接种树和单个输出接种树。
[0234]
此外，在图中所示的实施例中，微流控设备在输入接种通道、输出接种通道和连通通道与加工室的接合部处不包括倒角。然而，这种倒角的存在是有利的并且在本发明的范围内。还能够发现，在加工室附近和朝向加工室的通道横截面的可选的逐渐增加例如圆角有利于改善接种流。
[0235]
此外，在上述实施方案中，加工室的每个段具有矩形几何形状，并且接种树是接种通道的对称二叉树。然而，在本发明的其他实施方案中，加工室和接种通道树可以具有不同的形状和布置。在本发明的一些实施方案中，也可以将根据本发明的多个微流控设备堆叠，然后堆叠的设备可通过液压歧管连通。
[0236]
根据另一变体，加工室可包含连接其顶表面和底表面的柱，以降低与加工室平坦度相关的塌陷风险。在加工室的宽度远大于其高度的实施方案中，这样的另外的柱可以是特别有利的。