一种表面印迹抗体的疏水电荷诱导模式膜层析介质及其制备方法

1.本发明涉及生物分离领域，特别涉及一种表面印迹抗体的疏水电荷诱导模式膜层析介质及其制备方法。


背景技术：

2.随着生物技术的快速发展，具有特异性强、毒性低、生物功能明确等特点的蛋白质药物在医药领域的应用不断扩大。然而，生物医药行业对抗体药物的纯度及活性有很严格的要求，这导致纯化成本较高占到总生产成本的50％～80％。因此，开发出一种经济高效的生物药物分离纯化方法，对生物医药领域有重大意义。
3.层析技术作为纯化分离最重要的一种途径，不但选择性高，而且可以较好的保持生物制品的活性，是分离纯化蛋白类产品最理想的方法之一。近年来，混合模式层析由于其具有高选择性、高分离效率和高负载能力的优势，已经成为蛋白质纯化领域的热点方向。基于该技术的介质兼有多种作用模式，包括疏水作用，静电作用和氢键作用等。其中将疏水相互作用与离子交换作用相结合的疏水电荷诱导层析(hcic)在纯化抗体方面有巨大潜力，有望在很多场合有效替代protein a亲和层析，以降低抗体药物的分离成本。然而，疏水电荷诱导层析技术对靶蛋白的选择性仍需进一步提高。而将其与另外一种具有高识别目标分子能力的技术相结合可能是一个很好的解决方法。
4.分子印迹技术(mit)具有高选择性及优秀的特异性识别能力，被广泛应用于分离领域。它是通过在制备过程中形成的“印迹空腔”优先与目标分子发生相互作用来进行识别与分离。目前，关于小分子的印迹技术已经发展的十分成熟，然而，由于蛋白质分子尺寸较大，结构灵活多变且易于变性，因此对其进行分子印迹仍然是一个巨大的挑战。近年来，为了解决蛋白质分子在印迹材料中的扩散限制、变性失活以及难以洗脱等问题，一系列新型印迹方法发展起来，包括表面印迹、表位印迹、微接触印迹等，这些方法都成功的将分子印迹技术应用到了蛋白质分离纯化领域。将hcic和表面印迹相结合，是制备高选择性色谱层析介质的有效方法。如shi等人将hcic与mit相结合获得的双识别模式树脂4ff-try/mips从牛血清中分离出的牛血清白蛋白的纯度比单识别模式树脂4ff-try高约20％(separation and purification technology,2018,202:165-173)。但是，制备过程比较复杂，他们首先对琼脂糖凝胶进行活化和溴化处理，然后在材料表面偶联上hcic配体，在印迹蛋白之后又通过有机硅烷的溶胶-凝胶聚合得到印迹层，最后解吸蛋白获得双识别模式树脂4ff-try/mips。要使层析介质具有双识别模式，需要将hcic配体的选择性引入与表面分子印迹技术相结合，这会增加层析介质制备过程的复杂程度。因此，寻求更加简便高效的配体表面接枝方法成为制备双识别模式层析介质的关键。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种操作简便，条件温和的表面印迹抗体的疏水电荷诱导模
式膜层析介质的制备方法。
6.本发明的另一目的是提供一种采用上述表面印迹抗体的疏水电荷诱导模式膜层析介质的制备方法制备得到的表面印迹抗体的疏水电荷诱导模式膜层析介质
7.为此，本发明技术方案如下：
8.一种表面印迹抗体的疏水电荷诱导模式膜层析介质的制备方法，步骤如下：
9.s1、将再生纤维素膜浸泡于氧化剂溶液中，并于20～60℃下搅拌2～6h；
10.该步骤s1的目的在于：将膜表面的羟基氧化为醛基。
11.s2、将经过步骤s1处理的膜浸泡在甲醇溶液中，依次加入色胺，对羧基苯磺酰氯，异氰基乙酸甲酯，在25～60℃下搅拌4～12h后取出；
12.该步骤s2的目的在于：引入疏水电荷诱导模式配体及atrp反应引发剂；具体来说，色胺的加入用于引入疏水电荷诱导模式配体，对羧基苯磺酰氯的加入用于之后atrp反应的引发剂，异氰基乙酸甲酯的加入用于提供异氰基使其能够与其他组分进行ugi-四组分反应；
13.s3、将步骤s2处理的膜放入免疫球蛋白g溶液中，并置于25℃的恒温混匀仪中吸附5～10h；
14.该步骤s3的目的在于：印迹模板蛋白免疫球蛋白g；
15.s4、将步骤s3处理的膜浸泡在磷酸盐缓冲液中，依次加入丙烯酰胺、n,n-亚甲基双丙烯酰胺、配体和催化剂，并置于惰性气氛下，于25～80℃下反应0.5～6h；
16.该步骤s4的目的在于：通过atrp反应将模板蛋白印迹在聚合物层中；
17.s5、依次用ph＝5的乙酸盐缓冲液、ph＝7的磷酸盐缓冲液和去离子水充分冲洗经过步骤s4处理的膜，使模板蛋白解吸附，获得表面印迹抗体的疏水电荷诱导模式膜层析介质；
18.该步骤s5的目的在于：洗脱模板蛋白，在膜表面形成印迹层；
19.优选，在步骤s1中，在步骤s1中，氧化剂溶液为采用高碘酸钠或2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基溶于水配制而成的0.5～5wt.％的氧化剂水溶液。更优选，氧化剂溶液采用高碘酸钠水溶液。
20.优选，在步骤s1中，再生纤维素膜采用孔径为0.45μm且表面带有羟基的再生纤维素膜。
21.优选，在步骤s2中，色胺、对羧基苯磺酰氯、异氰基乙酸甲酯的摩尔加量均过量于经过步骤s1处理的膜上的醛基的摩尔量，且色胺、对羧基苯磺酰氯、异氰基乙酸甲酯的摩尔比为1:1:1。
22.优选，在步骤s3中，免疫球蛋白g溶液的浓度为0.5～5mg/ml。
23.优选，在步骤s4中，配体为n,n,n',n,'n
”‑
五甲基二亚乙基三胺或四甲基乙二胺或2,2-联二吡啶；更优选，配体采用n,n,n',n,'n
”‑
五甲基二亚乙基三胺。
24.优选，在步骤s4中，催化剂为cucl或cubr；更优选，催化剂采用cucl。
25.优选，在步骤s4中，基于每1g经过步骤s3处理的膜，丙烯酰胺、n,n-亚甲基双丙烯酰胺、配体和催化剂的加入量依次为2g、0.3g、0.13g和0.065g。
26.一种采用上述表面印迹抗体的疏水电荷诱导模式膜层析介质的制备方法制备得到的表面印迹抗体的疏水电荷诱导模式膜层析介质。
27.与现有技术相比，该表面印迹抗体的疏水电荷诱导模式膜层析介质的制备方法的操作过程简单，条件温和，且采用该方法制备得到的表面印迹抗体的疏水电荷诱导模式膜层析介质为一种具有疏水电荷诱导模式及分子印迹模式的双识别模式的层析介质，可以高效纯化抗体。
附图说明
28.图1为本发明的实施例1制备的表面印迹抗体的疏水电荷诱导模式膜层析介质和表面未印迹抗体的膜层析介质的扫描电镜图；
29.图2为本发明的实施例1制备的表面印迹抗体的疏水电荷诱导模式膜层析介质和表面未印迹抗体的膜层析介质的静态吸附对比图；
30.图3为本发明的实施例1制备的表面印迹抗体的疏水电荷诱导模式膜层析介质对免疫球蛋白g的动态吸附结果图。
具体实施方式
31.下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步的说明，但下述实施例绝非对本发明有任何限制。
32.在以下实施例和对比例中，作为膜层析基质，再生纤维素膜均采用德国sartorius公司生产的再生纤维素膜，该每片再生纤维素膜的直径为47mm，孔径为0.45μm，厚度为160μm。
33.实施例1
34.一种表面印迹抗体的疏水电荷诱导模式膜层析介质的制备方法，步骤如下：
35.s1、将再生纤维素膜浸泡于1wt.％的高碘酸钠溶液中，并于25℃下搅拌4h；
36.s2、将0.1g经过步骤s1处理的膜浸泡在甲醇溶液中，然后依次加入1mmol色胺、1mmol对羧基苯磺酰氯和1mmol异氰基乙酸甲酯，并于25℃下搅拌12h；
37.s3、将经过步骤s2处理的膜放入1mg/ml免疫球蛋白g溶液中，并置于25℃下恒温混匀仪中吸附5h；
38.s4、将0.1g经过步骤s3处理的膜浸泡在20mmol/l、ph＝7的磷酸盐缓冲液中，并依次加入0.2g丙烯酰胺、0.03g n,n-亚甲基双丙烯酰胺、13mgn,n,n',n,'n
”‑
五甲基二亚乙基三胺和6.5mgcucl，而后置于惰性气氛下，升温至25℃下在恒温混匀仪中反应0.5h；
39.s5、依次用20mmol/l、ph＝5的乙酸盐缓冲液，20mmol/l、ph＝7的磷酸盐缓冲液和去离子水充分冲洗经过步骤s4处理的膜，使模板蛋白解吸附，获得表面印迹抗体的疏水电荷诱导模式膜层析介质。
40.对比例1
41.作为实施例1的对照，制备表面未印迹抗体的膜层析介质，其具体步骤为：
42.s1、将再生纤维素膜浸泡于1wt.％的高碘酸钠溶液中，并于25℃下搅拌4h；
43.s2、将0.1g经过步骤s1处理的膜浸泡在甲醇溶液中，然后依次加入1mmol色胺、1mmol对羧基苯磺酰氯和1mmol异氰基乙酸甲酯，并于25℃下搅拌12h；
44.s3、将经过步骤s2处理的膜浸泡在20mmol/l、ph＝7的磷酸盐缓冲液中，并依次加入0.2g丙烯酰胺、0.03g n,n-亚甲基双丙烯酰胺、13mg n,n,n',n,'n
”‑
五甲基二亚乙基三
胺和6.5mg cucl，而后置于惰性气氛下，升温至25℃下在恒温混匀仪中反应0.5h；
45.s4、用20mmol/l、ph＝7的磷酸盐缓冲液和去离子水充分冲洗，获得表面未印迹抗体的膜层析介质。
46.实施例2
47.一种表面印迹抗体的疏水电荷诱导模式膜层析介质的制备方法，步骤如下：
48.s1、将再生纤维素膜浸泡于0.5wt.％的高碘酸钠溶液中，在40℃下搅拌6h后取出；
49.s2、将0.1g经过步骤s1处理的膜浸泡在甲醇溶液中，依次加入2mmol色胺、2mmol对羧基苯磺酰氯和2mmol异氰基乙酸甲酯，在60℃下搅拌4h后取出；
50.s3、将经过步骤s2处理的膜放入0.5mg/ml免疫球蛋白g溶液中进行吸附，在25℃下恒温混匀仪中吸附10h；
51.s4、将0.1g步骤s3获得的膜浸泡在20mmol/l、ph＝7的磷酸盐缓冲液中，并依次加入0.2g丙烯酰胺、0.03gn,n-亚甲基双丙烯酰胺、13mgn,n,n',n,'n
”‑
五甲基二亚乙基三胺和6.5mgcucl，而后置于惰性气氛下，升温至40℃下在恒温混匀仪中吸附6h；
52.s5、依次用20mmol/l、ph＝5的乙酸盐缓冲液，20mmol/l、ph＝7的磷酸盐缓冲液和去离子水充分冲洗经过步骤s4处理的膜，使模板蛋白解吸附，获得表面印迹抗体的疏水电荷诱导模式膜层析介质。
53.实施例3
54.一种表面印迹抗体的疏水电荷诱导模式膜层析介质的制备方法，步骤如下：
55.s1、将再生纤维素膜浸泡于3wt.％的2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基溶液中，在60℃下搅拌2h后取出；
56.s2、将0.1g经过步骤s1处理的膜浸泡在甲醇溶液中，依次加入0.5mmol色胺、0.5mmol对羧基苯磺酰氯和0.5mmol异氰基乙酸甲酯，在40℃下搅拌8h后取出；
57.s3、将经过步骤s2处理的膜放入5mg/ml免疫球蛋白g溶液中进行吸附，在25℃下恒温混匀仪中吸附8h；
58.s4、将步骤s3获得的膜浸泡在20mmol/l、ph＝7的磷酸盐缓冲液中，并依次加入0.2g丙烯酰胺、0.03g n,n-亚甲基双丙烯酰胺、13mg 2,2-联二吡啶和6.5mgcubr，而后置于惰性气氛下，在80℃下在恒温混匀仪中吸附3h；
59.s5、依次用20mmol/l、ph＝5的乙酸盐缓冲液，20mmol/l、ph＝7的磷酸盐缓冲液和去离子水充分冲洗经过步骤s4处理的膜，使模板蛋白解吸附，获得表面印迹抗体的疏水电荷诱导模式膜层析介质。
60.实施例4
61.一种表面印迹抗体的疏水电荷诱导模式膜层析介质的制备方法，步骤如下：
62.s1、将再生纤维素膜浸泡于5wt.％的2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基溶液中，在25℃下搅拌6h后取出；
63.s2、将0.1g经过步骤s1处理的膜浸泡在甲醇溶液中，依次加入1mmol色胺、1mmol对羧基苯磺酰氯和1mmol异氰基乙酸甲酯，在25℃下搅拌12h后取出；
64.s3、将经过步骤s2处理的膜放入1mg/ml免疫球蛋白g溶液中进行吸附，在25℃下恒温混匀仪中吸附10h；
65.s4、将步骤s3获得的膜浸泡在20mmol/l、ph＝7的磷酸盐缓冲液中，并依次加入
0.2g丙烯酰胺、0.03g n,n-亚甲基双丙烯酰胺、13mg 2,2-联二吡啶和6.5mgcubr，而后置于惰性气氛下，在25℃下在恒温混匀仪中吸附3h；
66.s5、依次用20mmol/l、ph＝5的乙酸盐缓冲液，20mmol/l、ph＝7的磷酸盐缓冲液和去离子水充分冲洗经过步骤s4处理的膜，使模板蛋白解吸附，获得表面印迹抗体的疏水电荷诱导模式膜层析介质。
67.在上述实施例和对比例中，乙酸盐缓冲液由醋酸铵和盐酸混合配制而成，磷酸盐缓冲液为磷酸钠缓冲液或磷酸钾缓冲液。
68.性能测试：
69.(一)微观结构测试：
70.对实施例1制备的表面印迹抗体的疏水电荷诱导模式膜层析介质和表面未印迹抗体的膜层析介质进行电镜扫描，得到如图1所示的电镜扫描图像。
71.图1(a)为表面印迹抗体的疏水电荷诱导模式膜层析介质的电镜扫描图像，图1(b)为表面未印迹抗体的膜层析介质的电镜扫描图像。从图1(a)和图1(b)的对比可以明显看出，该表面印迹抗体的疏水电荷诱导模式膜层析介质保持了再生纤维素膜的大孔结构，并在孔周围形成了一层聚合物层，与表面未印迹抗体的膜层析介质相比，两种膜层析介质的孔径大小及膜孔分布没有明显变化，但由于表面未印迹抗体的膜层析介质没有印迹蛋白和洗脱蛋白的步骤，所以表面相对较为光滑。
72.(二)静态吸附性能测试：
73.对实施例1制备的表面印迹抗体的疏水电荷诱导模式膜层析介质进行静态吸附性能测试，并与表面未印迹抗体的膜层析介质进行比较。
74.具体地，静态吸附性能测试的具体步骤为：
75.1)将介质裁剪为1x1cm2大小，用ph＝7.0的磷酸盐缓冲液平衡约30min，然后放入容积为10ml的玻璃小瓶中，并分别在各小瓶内加入2ml浓度值依次为0.5mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml和5mg/ml的免疫球蛋白g溶液；
76.2)将全部小瓶置于恒温混匀仪中并于25℃、200rpm条件下吸附22h；待达到吸附平衡后，取上清液测定免疫球蛋白g浓度；
77.3)根据物料平衡计算介质的吸附容量，绘制吸附等温线，并用langmuir方程进行拟合获得吸附容量。
78.如图2所示为实施例1制备的表面印迹抗体的疏水电荷诱导模式膜层析介质的静态吸附曲线a和表面未印迹抗体的膜层析介质的静态吸附曲线b的对比图。
79.从图2的曲线结果中可以看出，表面印迹抗体的疏水电荷诱导模式膜层析介质的饱和吸附容量为46.0mg/ml，而表面未印迹抗体的膜层析介质的饱和吸附容量为10.1mg/ml；可见，表面印迹抗体的疏水电荷诱导模式膜层析介质对目标蛋白具有较高的吸附能力。
80.采用上述方法对实施例2～4制备的表面印迹抗体的疏水电荷诱导模式膜层析介质进行静态吸附性能测试，测试结果如下表1所示。
81.表1：
[0082][0083]
从上表1可以看出，实施例1制备的表面印迹抗体的疏水电荷诱导模式膜层析介质对蛋白的吸附能力更强，实施例2由于atrp聚合时间较长，形成的聚合物层可能把部分模板蛋白包裹在内部，无法洗脱，因此吸附量相对较低。而对比实施例3与实施例4的吸附量下降了更多，这可能与更换了氧化剂以及atrp的催化体系有关。因此实施例1的制备条件为本技术优选条件。
[0084]
(三)动态吸附性能测试：
[0085]
对实施例1制备的表面印迹抗体的疏水电荷诱导模式膜层析介质进行动态吸附性能测试。具体地，动态吸附性能测试的具体步骤为：
[0086]
1)用ph 7.0磷酸盐缓冲液配置1mg/ml免疫球蛋白g溶液；
[0087]
2)取5片膜层析介质填充入层析柱(直径1cm)，用ph 7.0的磷酸盐缓冲液进行平衡，而后以1ml/min线性流速上样；采用20mmol/l的乙酸盐缓冲液进行洗脱，利用uv检测器(280nm)在线监测柱出口蛋白浓度变化。
[0088]
如图3所示为实施例1制备的表面印迹抗体的疏水电荷诱导模式膜层析介质的动态吸附图。
[0089]
从上图3中可以看出来，在洗脱过程中出现了非常尖锐的洗脱峰，这说明表面印迹抗体的疏水电荷诱导模式膜层析介质具有较为优秀的抗体吸附效果。