一种重金属Al

molybdenum in a dietetic preparation by flame aas after dry ashing [j]. journal of pharmaceutical & biomedical analysis, 2001, 25(1): 103-108.[6]tangen g, wickstr m t, lierhagen s, et al. fractionation and determination of aluminum and iron in soil water samples using spe cartridges and icp-aes [j]. environmental science & technology, 2002, 36(24): 5421-5425.[7]paktsevanidou i p, manousi n, zachariadis g a. development and validation of an inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry (icp-aes) method for trace element determination in vinegar [j]. analytical letters, 2020, 54(13):1-12.[8]rpa b, pj b, dkb c. aluminon functionalized silver nanoparticles for the colorimetric detection of aqueous al(iii) [j]. materials chemistry and physics, 2020, 239(1): 122318-122326.[9]luo x, xie x, meng y, et al. ligands dissociation induced gold nanoparticles aggregation for colorimetric al3+ detection [j]. analytica chimica acta, 2019, 1087(9): 76-85.[10]joshi p, painuli r, kumar d. label-free colorimetric nanosensor for the selective on-site detection of aqueous al3+ [j]. acs sustainable chem eng, 2017, 5(6): 4552-4562.[11]mendecki l, granados-focil s, jendrlin m, et al. self-plasticized, lumogallion-based fluorescent optical sensor for the determination of aluminium (iii) with ultra-low detection limits [j]. analytica chimica acta, 2019, 1101(8):141-148.[12]xue t a, hong l a, min w b, et al. highly sensitive chemiluminescent sensing of intracellular al3+ based on the phosphatase mimetic activity of cerium oxide nanoparticles [j]. biosensors and bioelectronics, 2020, 152(15): 112027-112034.[13]guo l, zhi s, sun x, et al. ultrasensitive detection of bioanalytes based on signal amplification of coil-integrated giant magnetoimpedance biosystems [j]. sensors & actuators b chemical, 2017, 247:1-10.[14]gupta a, kumar n. a review of mechanisms for fluorescent ''turn-on'' probes to detect al3+ ions [j]. rsc advances, 2016, 6(108): 106413-106434[15]ju p, su q, liu z, et al. a salen-based covalent organic polymer as highly selective and sensitive fluorescent sensor for detection of al3+ , fe3+ and cu2+ ions [j]. 2019, 54: 851
–
861。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的是基于al
3+
对单原子铈纳米酶类磷酸酶活性的特异性抑制研发的快
速检测al
3+
的试剂盒。
[0006]
本发明提供一种单原子纳米酶，所述纳米酶为单原子铈纳米酶。
[0007]
上述单原子纳米酶的制备方法，包括以下步骤：将十六烷基三甲基溴化铵溶解于1 m hcl中，加入过硫酸铵搅拌均匀，并添加吡咯搅拌聚合；真空过滤收集黑色沉淀，用水和乙醇洗涤；将0.2-0.6 mol/l氯化锂和0.01-0.06 mol/l硝酸铈混合，加入上述体系并超声和剧烈搅拌，干燥后在n2流和nh3流下热解，加入h2so4浸泡，合成单原子铈纳米酶；将合成的单原子铈纳米酶溶解于无水乙醇和5 % nafion溶液组成的混合溶液中，超声至溶解，即得到单原子铈纳米酶溶液。
[0008]
进一步的，单原子铈纳米材料的合成是通过将0.4-1.5 g十六烷基三甲基溴化铵溶解在40-100 ml 0.5-2 m hcl溶液中，在冰浴下通过超声处理。将0.2-2.5 g过硫酸铵加入到上述溶液中搅拌均匀，得到具有白色沉淀的十六烷基三甲基溴化铵模板。其中优选的，十六烷基三甲基溴化铵量为0.5-1.2 g，优选0.75-1 g，更优选为0.8-0.9 g。优选的，过硫酸铵 量为0.5-1.8 g，优选0.75-1.5 g，更优选为1-1.3 g。
[0009]
在上述体系中再加入0.2-5 ml吡咯，连续搅拌0.5-3天以达到聚合。再通过真空过滤收集得到黑色沉淀，用水和乙醇洗涤2-6次。将混合物分散在氯化锂（0.2-0.6 mol/l）和硝酸铈（0.01-0.06 mol/l）的混合体系中，进行1-10分钟的超声处理和12-48小时的剧烈搅拌，使其吸附li
+
和ce
3+
阳离子。通过真空过滤收集该混合物前体，并在40-85℃下干燥6-18 h，之后在300-1200℃下在n2流下热解0-90 min，在nh3流下热解0-90 min。将获得的碳材料在20-80℃下用0.3-0.8 m h2so4溶液浸泡2-10 h，以除去氯化锂和不稳定物质，从而获得最终的单原子铈纳米催化剂。
[0010]
将合成的单原子铈纳米酶溶解于无水乙醇和5%的nafion的混合溶液（混合溶液中无水乙醇的体积分数为90-99%）中，超声至溶解，即得到单原子铈纳米酶溶液。
[0011]
优选的，单原子铈纳米酶制备方法，还可以是将0.6-0.8g十六烷基三甲基溴化铵（ctab）溶解在60 ml 1 m hcl溶液中，在冰浴下通过超声处理。然后将1.2-1.5 g过硫酸铵（aps）加入到上述溶液中搅拌均匀，得到具有白色沉淀的ctba模板。再加入1.0 ml吡咯，连续搅拌一天以达到聚合。再通过真空过滤收集得到黑色沉淀，再用水和乙醇洗涤。然后再将混合物分散在100 ml氯化锂（0.4 mol/l）和硝酸铈（0.02 mol/l）的混合体系中，进行2分钟的超声处理和24小时的剧烈搅拌，使其吸附li
+
和ce
3+
阳离子。再通过真空过滤收集该混合物前体，并在60℃下干燥12 h，之后在900℃下在n2流下热解30 min，在nh3流下热解30 min。将获得的碳材料在60℃下用0.5 m h2so4溶液浸泡4 h，以除去氯化锂和不稳定物质，从而获得最终的单原子铈纳米催化剂。将合成的单原子铈纳米酶溶解于无水乙醇和5%的nafion的混合溶液（混合溶液中无水乙醇的体积分数为99%）中，超声至溶解，即得到单原子铈纳米酶溶液。
[0012]
另一方面，本发明提供一种重金属al
3+
快速检测方法，检测试剂中包含上述单原子铈纳米酶。
[0013]
检测方法中包含单原子铈纳米酶溶液、4-甲基伞形酮磷酸二钠盐4-mup溶液和tris-hcl缓冲液。
[0014]
其中单原子铈纳米酶溶液的溶剂为乙醇和5% nafion溶液组成的混合溶剂，浓度
为 0.1-2.3 μm。优选0.5-1.5 μm，更优选的为0.8-1.2 μm，更优选为0.6-0.8 μm，优选为0.73 μm。
[0015]
上述混合溶剂为乙醇：（5% nafion）体积分数为（50-150）：1，优选(90-110):1,优选99:1。
[0016]
其中4-mup溶液，其溶剂为ph7-8的tris-hcl缓冲液中，浓度为1-5 mm。优选为2mm。
[0017]
另一方面，本发明提供一种al
3+
检测试剂盒，试剂盒中包含上述单原子铈纳米酶。
[0018]
另一方面，本发明提供一种al
3+
检测传感器，传感器中包含上述单原子铈纳米酶。
[0019]
另一方面，本发明提供一种单原子铈纳米酶在al
3+
检测中的应用。应用包括重金属污染物检测，食品安全检测等。所述食品包括粉丝、粉条、宽粉、桃酥、红豆酥、月饼、枣糕、腐乳、豆腐、豆腐皮、蛋糕、蛋卷等的检测。
[0020]
其他方面，本发明提供了一种重金属al
3+
的快速检测试剂盒及其应用，包括：（1）单原子铈纳米酶类磷酸酶活性的验证和评估，（2）快速检测试剂盒检测体系的构建。
[0021]
本发明提供上述单原子铈纳米酶类磷酸酶活性的验证和评估，包括：水解底物分子特征吸收峰、类磷酸酶最佳反应条件和拟合参数大小；所述水解底物分子特征吸收峰是指比色底物p-npp被单原子铈纳米酶水解后在405 nm处产生的特征吸收峰，以及荧光底物4-mup被单原子铈纳米酶水解后在430 nm处产生的特征吸收峰；所述类磷酸酶最佳反应条件，反应ph7.0-9.0、反应温度20-80℃、反应时间10-20 min和相对稳定时间20-30 d；所述拟合参数为：最大反应速率（v
max
）为5.86
×
10-6 m s-1
、米氏常数（km）为0.28 mm和酶活力（sa）为29.61 u/mg；类磷酸酶活性验证和评估过程为：（1）比色体系：在96孔板中依次加入120 μl 的ph 9.0 tris-hcl缓冲溶液、40 μl的p-npp溶液及40 μl 的单原子铈纳米酶溶液，涡混均匀后，静置20 min观察溶液颜色是否会从无色变为黄色，并检测在310 nm和405 nm处的吸收峰值变化。若溶液颜色变为黄色，且在405 nm处有特征吸收峰，即说明单原子铈纳米材料具有类磷酸酶活性，反之则无。（2）荧光体系：在1.5 ml离心管中依次加入40 μl的ph 9.0 tris-hcl缓冲溶液、40 μl 的4-mup溶液和60 μl 的去离子水最后加入60 μl的单原子铈纳米酶溶液，观察体系的荧光变化。若溶液有蓝绿色荧光，且在430 nm处有特征吸收峰，即说明单原子铈纳米材料具有类磷酸酶活性，反之则无。
[0022]
以此同时，在比色体系中，测试其酶活力sa以及酶动力学参数v
max
和km以此来评价单原子铈纳米酶类磷酸酶活性的大小。
[0023]
另一方面，本发明提供上述快速检测试剂盒体系的检测条件：重金属al
3+
快速检测试剂盒体系中，荧光底物4-mup浓度为1-2.5 mm；具体地，荧光底物4-mup浓度为2 mm；单原子铈纳米酶溶液浓度为0.18-1.44 μm；具体地，单原子铈纳米酶溶液浓度为0.72 μm。检测时间为4-6 min；具体地，检测时间为4 min；荧光产物的稳定时间为0.5-4 h。
[0024]
本发明快速检测试剂盒的检测分析原理：利用单原子铈纳米酶具有类磷酸酶活性，且al
3+
可特异性与单原子铈纳米酶结构中的氧原子结合形成al-o键使其发生聚集，从而抑制类磷酸酶活性，从而实现对al
3+
检测（图1）。
[0025]
具体检测过程为：分别将粉丝、粉条、宽粉、桃酥、红豆酥、月饼、枣糕、腐乳、豆腐、豆腐皮、蛋糕、蛋卷作为实际样品进行分析检测。将各个样品分别称取约0.5 g，加入5.0 ml浓hno3，1 ml 30% h2o2进行微波消解20 min后加水稀释定容至50.0 ml，得到待测液进行检测（图1）。
[0026]
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：a）本发明提供了一种单原子铈纳米酶，其具有类磷酸酶活性，且验证其可特异性与al
3+
结合，可用于al
3+
的检测。
[0027]
b）本发明基于al
3+
对单原子铈纳米酶类磷酸酶活性的特异性抑制研发的快速检测试剂盒具有以下优点：（1）在4 min范围内能快速、高效及灵敏的检测食品基质中al
3+
。
[0028]
（2）易操作，不需要专业人员及大型设备。
附图说明
[0029]
图1为al
3+
检测原理及操作流程。
[0030]
图2为单原子铈纳米酶类磷酸酶活性验证。图a为比色及荧光反应示意图；图b为紫外光谱分析；图c为荧光光谱分析。
[0031]
图3为检测机理验证；图a为比色体系；图b为荧光体系；图c为不同浓度的edta-2na对al
3+
的螯合实验；图d为al
3+
对商用碱性磷酸酶活性影响；图e为al
3+
对单原子铈纳米酶结构影响；图f为al
3+
对商用碱性磷酸酶结构影响。
[0032]
图4为单原子铈纳米酶类磷酸酶活性优化。图a为反应ph对类磷酸酶活性的影响；图b为反应温度对类磷酸酶活性的影响；图c为反应时间对类磷酸酶活性的影响；图d为贮藏时间对类磷酸酶活性的影响。
[0033]
图5为单原子铈纳米酶类磷酸酶活性拟合参数；图a为米氏方程及双倒数图；图b为酶活力sa线性拟合图。
[0034]
图6为快速检测试剂盒体系优化；图a为4-mup浓度；图b为单原子铈纳米酶浓度；图c为检测时间；图d为产物4-mu稳定性。
[0035]
图7为灵敏度分析。图a为al
3+
检测的灵敏度实物检测图；图b为al
6+
检测的灵敏度线性关系。
[0036]
图8为特异性分析。
[0037]
图9为加标样品检测应用。
具体实施方式
[0038]
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0039]
实施例1单原子铈纳米酶的合成十六烷基三甲基溴化铵（ctab）、过硫酸铵（aps）、硝酸铈、二甲基亚砜（dmso）、氯化锂由上海阿拉丁生化科技有限公司提供；聚吡咯（ppy）和3,3’,5,5
’‑
四甲基联苯胺（tmb）由上海麦克林生化科技有限公司提供。
[0040]
1、单原子铈纳米材料的合成
单原子铈纳米材料的合成是通过将0.73 g十六烷基三甲基溴化铵（ctab）溶解在60 ml 1 m hcl溶液中，在冰浴下通过超声处理。然后将1.37 g过硫酸铵（aps）加入到上述溶液中搅拌均匀，得到具有白色沉淀的ctba模板。再加入1.0 ml吡咯，连续搅拌一天以达到聚合。再通过真空过滤收集得到黑色沉淀，再用水和乙醇洗涤。然后再将混合物分散在100 ml氯化锂（0.4 mol/l）和硝酸铈（0.02 mol/l）的混合体系中，进行2分钟的超声处理和24小时的剧烈搅拌，使其吸附li
+
和ce
3+
阳离子。再通过真空过滤收集该混合物前体，并在60 ℃下干燥12 h，之后在900℃下在n2流下热解30 min，在nh3流下热解30 min。将获得的碳材料在60℃下用0.5 m h2so4溶液浸泡4 h，以除去氯化锂和不稳定物质，从而获得最终的单原子铈纳米催化剂。
[0041]
2、单原子铈纳米酶溶液的制备将合成的单原子铈纳米酶溶解于无水乙醇和5%的nafion的混合溶液（混合溶液中无水乙醇的体积分数为99%）中，超声至溶解，即得到单原子铈纳米酶溶液。
[0042]
实施例2 基于单原子铈纳米酶类磷酸酶活性用于al
3+
检测方法的建立1、实验材料5% nafion由上海生物技术有限公司提供；tris-hcl缓冲液（ph 9.0）和无水乙醇（c2h5oh）由上海源叶生物技术有限公司制备；4-硝基苯磷酸二钠盐（p-npp）、乙二胺四乙酸二钠（edta-2na）、商用碱性磷酸酶（alp）、fcp962 96孔板购买于上海碧云天生物技术有限公司、4-甲基伞形酮磷酸二钠盐（4-mup）购买于西安齐岳生物科技有限公司；fe
3+
、cu
2+
、cd
2+
、hg
2+
、k
+
、na
+
、ca
2+
、mg
2+
、zn
2+
、pb
2+
、cr
6+
、as
5+
、f-、cl-、br-、no
3-、so
42-、po
43
‑ 、cr
3+
、al
3+
标准品溶液标准品由青岛泉畅科贸有限公司提供；粉条、粉丝、宽粉、桃酥、红豆酥、月饼、红枣糕、腐乳、豆腐、豆腐皮、蛋糕、蛋卷均购买当地超市。
[0043]
2、设计原理本发明快速检测试剂盒的检测分析原理：单原子铈纳米酶具有显著的类磷酸酶酶活性，al
3+
能与单原子铈纳米酶结构中的o原子发生反应，形成al-o键，使均匀分散的单原子铈纳米酶发生不同程度的聚集，从而抑制其磷酸酶活性，使其催化底物产生具有荧光产物的性能下降，通过荧光强度的变化实现对体系中al
3+
的检测。（图1）。
[0044]
3、单原子铈纳米酶类磷酸酶活性验证（1）比色体系：在96孔板中依次加入120 μl 的ph 9.0 tris-hcl缓冲溶液、40 μl 的p-npp溶液及40 μl 的单原子铈纳米酶溶液，涡混均匀后，静置20 min观察溶液颜色是否会从无色变为黄色，并检测在310 nm和405 nm处的吸收峰值变化（图2a,b）。
[0045]
（2）荧光体系：在1.5 ml离心管中依次加入40 μl 的ph 9.0 tris-hcl缓冲溶液、40 μl 的4-mup溶液和60 μl 的去离子水最后加入60 μl 的单原子铈纳米酶溶液，观察体系的荧光变化。（图2a,c）。
[0046]
4、检测机理验证分别在比色及荧光体系中进行可行性验证。可以观察到al
3+
的加入使405 nm处的紫外特征吸收峰（图3a）及430 nm的荧光发射光谱峰（图3b）发生明显下降趋势。为进一步说明产生的结果，我们使用了edta-2na作为螯合剂去螯合al
3+
，比较ce-n-c单原子纳米酶与al
3+
体系中加入不同浓度edta-2na后荧光强度变化。与只加有al
3+
的空白组相比，发现体系
ng/ml（图7b）。
[0054]
实施例5 检测方法的选择性验证在不同阴阳离子的存在下，探究了al
3+
对单原子铈纳米酶类磷酸酶特异性抑制的能力。除了al
3+
的加入能够使得体系荧光强度下降，cr
3+
在一定程度上也能使体系的荧光强度下降，但cr
6+
并不影响体系的荧光强度。因此，在实验前将cr
3+
氧化成cr
6+
进行后续实验，能够消除cr
3+
对al
3+
检测的影响。其他一些常见的阴阳离子均不会影响单原子铈纳米酶类磷酸酶活性。因此，所构建的传感器对体系中al
3+
具有良好的选择性（图8）。
[0055]
实施例6 加标样品检测应用对实际加标样品使用本章构建的检测方法进行检测且与常规的仪器检测方法icp-ms进行比较。豆腐制品中的al
3+
含量基本均高于其他制品，主要原因可能是在豆腐的制作过程中会加入石膏作为凝结剂，而石膏主要为无水硫酸钙含有铝等金属。此外，粉丝中的al
3+
含量仅次于豆腐制品，可能原因有商家非法加入膨松剂明矾或者制作粉丝的农产品原料如红薯在生长过程中受到了外界环境如土壤中重金属a
l3+
的污染，使得最终制作出来的粉丝具有很高的al
3+
含量（图9）。总体而言，本章构建的荧光液相传感器检测的结果与icp-ms仪器检测的最终结果基本相似，对al
3+
的回收率分别为83.13-122.2%，标准偏差为2.11-5.98%。
[0056]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。