一种二甲基吡啶胺修饰的纳米磁珠及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物。更具体地，涉及一种二甲基吡啶胺修饰的纳米磁珠及其制备方法和应用。

背景技术：

1、磁性纳米材料一直是生物医药、材料物理等研究领域的研究热点。这些纳米磁颗粒具有粒径小、生物相容性高、超顺磁性强等特点，具有优秀的生物学价值。纳米磁颗粒小粒径使其拥有巨大的表面积，可对目标物质进行吸附包裹，在磁场作用下，进行有效的分离；生物相容性高表明其在生物体中有高度安全性，不会对其他组织造成损伤；超顺磁性，即当磁性材料的粒径小于临界半径时，纳米晶粒将不再具有磁畴结构，矫顽力为零，具有顺磁性。这赋予了纳米磁珠良好的分散性及操纵性。目前，国内外许多研究都致力于将纳米磁颗粒应用于细菌、毒素等的分离。

2、目前纳米磁颗粒制备方法有共沉淀法、高温热分解法、生物合成法、水热合成法等。如孙飞龙等使用共沉淀法合成的fe3o4纳米磁颗粒，发现该磁珠在ph在5.5-6.0时，对细菌的吸附率达85％，吸附效果有限；且裸磁珠还存在聚集沉淀，吸附能力差等缺点，在水体系不稳定。现有技术公开了一种表面具有一种或多种官能团的磁性纳米颗粒，对其进行表面修饰，使其在水体系中拥有稳定的分散系，并赋予了更多优点：磁含量高，灵敏度高，可实现快速分离；又如现有技术公开一种磁珠氨基化的方法，主要采取硅胶包埋和硅烷偶联试剂反应制的氨基官能团覆盖的纳米粒子，以此为载体对目标抗体、多肽等进行吸附。进一步修饰后的磁珠具有更好的性能，但还是存在磁珠捕获目标不明确、磁响应低、使用范围受限等问题，造成磁颗粒本身在应用领域方面还是比较被动。

3、因此，为了明确纳米磁颗粒捕获目标，提高纳米磁颗粒对微生物有较强的捕获能力和磁响应，扩大使用范围，有必要研究和开发出更多新的纳米磁颗粒，用于科学研究、临床、食品安全和环境保护等领域的样品分离与纯化，对于纳米磁颗粒的应用与研究具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是克服现有纳米磁珠捕获目标不明确、磁响应低、使用范围受限等问题，提供一种用于广谱富集微生物的二甲基吡啶胺修饰纳米磁珠及其制备方法和应用。

2、本发明的目的是提供一种二甲基吡啶胺修饰的纳米磁珠。

3、本发明另一目的是提供一种二甲基吡啶胺修饰的纳米磁珠制备方法。

4、本发明再一目的是提供所述二甲基吡啶胺修饰的纳米磁珠的应用。

5、本发明又一目的是提供一种富集、吸附、分离、纯化细菌的产品。

6、本发明上述目的通过以下技术方案实现：

7、本发明提供一种二甲基吡啶胺修饰的纳米磁珠的制备方法，含有以下步骤；

8、s1.氨基化纳米磁颗粒的合成：将fecl3、多元醇、胺类化合物，在氧化剂的作用下，反应合成氨基化纳米磁颗粒；

9、s2.采用cl-(ch2)n-coo(ch2)mch3(n＝1～4，m＝0～4)与二甲基吡啶胺(dpa)，在催化剂和活性介质溶剂中接合形成二甲基吡啶乙酸酯，再经水解，得到二甲基吡啶羧酸；

10、s3.将氨基聚乙二醇羧酸偶联到步骤s2的二甲基吡啶羧酸上，得到dpa-peg-cooh；

11、s4.将步骤s3的dpa-peg-cooh偶联到步骤s1的氨基化纳米磁颗粒上，固液分离，得到peg-dpa-conh-mnps；

12、s5.将甲氧基聚乙二醇羧酸偶联到步骤s4的peg-dpa-conh-mnps中，进行封闭，固液分离，再络合二价金属离子，最终得到dpa修饰的纳米磁珠。

13、本发明首先在高温高压环境中合成携带有氨基的纳米磁颗粒，随后对二甲基吡啶胺(dpa)进行化学修饰，具体为引入聚乙二醇(peg)和氨基、羧基官能团，得到dpa-peg-cooh；然后，将修饰得到的dpa-peg-cooh与纳米磁颗粒表面的氨基官能团接合，接着加入甲氧基聚乙二醇羧酸(m peg-cooh)与上一步剩下的磁性纳米颗粒表面氨基反应，最后将反应后的磁性纳米颗粒络合二价金属离子，赋予磁珠正电荷，进一步增强对细菌的捕获能力。

14、本发明利用电荷相互作用进行分离纯化，经过特定的反应制备可以提高磁珠的亲水性与生物相容性，具有较好的富集效果，还能避免与细胞产生吸附作用，dpa修饰的纳米磁珠的磁珠表面的正电荷与细菌表面的磷壁酸或脂多糖(带负电)、核酸片段的磷酸基团(带负电)结合从而达到富集纯化的效果，吸附率达90％以上，能够应用于科学研究、临床检测、食品安全和环境保护等领域的样品分离与纯化。

15、优选地，步骤s1中多元醇为乙二醇，胺类化合物为乙二胺或丙二胺，氧化剂为乙酸钠和氢氧化钠。

16、优选地，步骤s1中反应方法为高温高压法：在温度为100～130℃，压强为90～120kpa下，连续进行3～5次高压反应，每次反应时间为1～3h。

17、更优选地，步骤s1中高温高压法为：在温度为121℃，压强为105kpa，连续进行4次压反应，每次反应时间为2h。

18、优选地，步骤s1中氨基化纳米磁颗粒为球状的黑色粉末，直径在50nm-300nm，氨基含量不低于0.4％，磁响应性为50-70emu/g。

19、优选地，步骤s2中催化剂为碳酸钾和碘化钾，活性介质溶剂为乙腈。

20、优选地，步骤s4中偶联在氨基化纳米磁颗粒的大分子为peg-dpa-cooh。

21、优选地，步骤s5中二价金属离子为锌离子、铜离子、钴离子或镍离子，使生成的纳米磁珠携带正电荷。

22、本发明提供一种二甲基吡啶胺修饰的纳米磁珠，由上述方法制备得到。

23、本发明提供的dpa修饰的纳米磁珠的磁响应较好，能够在外磁场作用下，快速分离出磁珠，具有较好的顺磁性，能在3-5min内迅速从溶液中分离出来。同时，本发明的提供的纳米磁性颗粒的具有较高的磁响应性为50-70emu/g，实现磁分离的时间为3-5min；且dpa修饰的纳米磁珠的捕获目标明确，只吸细菌不吸细胞，对宿主细胞具有很好地的细菌吸附能力。本发明制备得到的dpa修饰的纳米磁珠具有广谱的细菌富集能力，对大肠杆菌的吸附率为99％，对沙门氏菌的吸附率为99％，对志贺氏菌为吸附率为98％，对单增李斯特菌吸附率为90％，对植物乳杆菌为100％，特别对革兰氏阴性菌有高度的亲和力；还对血液模拟样本的中的细菌吸附率为97％，还保持较高的细胞的存活率，达77.5％。本发明提供的dpa修饰的纳米磁珠在水体系中分散性好，专一性强，可通过电荷作用集聚水体系生物样品中致病菌，并在外磁场的作用下，可快速分离，吸附率高，可回收再利用，成本低，具有用于临床样品的微生物检测和内毒素患者、败血症病人治疗的良好潜力。

24、因此，本发明提供二甲基吡啶胺修饰的纳米磁珠在非疾病诊断和治疗为目的的富集、吸附、分离、纯化细菌，或在制备富集、吸附、分离、纯化细菌的产品中的应用。

25、本发明还提供二甲基吡啶胺修饰的纳米磁珠在水体系生物样品和模拟血液样品的富集、吸附、分离、纯化细菌、或制备富集、吸附、分离、纯化细菌的产品中的应用。

26、优选地，所述细菌为革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。

27、更优选地，所述革兰氏阴性菌为：大肠杆菌(escherichia coli)、伤寒沙门氏菌(salmonella typhi)、宋氏志贺氏菌(shigella sonnet)，革兰氏阳性菌为：单增李斯特菌(listeria monocytogenes)、植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)。

28、本发明还提供一种富集、吸附、分离、纯化细菌的产品，含上述二甲基吡啶胺修饰的纳米磁珠。

29、本发明具有以下有益效果：

30、本发明提供一种dpa修饰的纳米磁珠的制备方法，先通过高温高压法制备氨基化磁颗粒，然后通过碳二亚胺反应连接二甲基吡啶羧酸，最后结合peg并络合二价金属离子制备得到。本发明制备的纳米磁珠在水体系中分散性好，专一性强，可通过电荷作用集聚水体系生物样品中微生物，并在外磁场的作用下，可快速分离，吸附率高，可回收再利用，成本低；具有广谱的细菌富集能力，捕获率达90％以上，还具有较高的磁响应性，能够更好地结合外磁场作用进行分离，其捕获目标明确，能避免与人体和动物细胞产生吸附作用，应用于临床样品的微生物检测和内毒素患者、败血症病人的治疗。