微流控芯片及其检测方法与流程

本发明属于医疗器械体外诊断，具体涉及一种用于进行床旁诊断(poct)的微流控芯片以及该微流控芯片的检测方法。

背景技术：

1、床旁诊断(point of care testing，poct)即通过借助小型化或适中的桌面式设备或试剂对患者进行现场快速诊断。由于poct检测方法具有操作简单便捷、检测系统易维护、可以随时随地进行检测、检测成本低等特点，poct检测产品逐渐被市场所接受以及推广。

2、现有技术中用于疾病诊断的poct检测产品按照检测方法学或产品材料大致可以分为两类：层析poct检测技术和微流控poct检测技术。

3、层析poct检测技术已经有三十多年发展历史，目前市场上poct检测的主导产品就是基于层析技术开发。基于层析技术开发的poct产品虽然技术成熟技术门槛低，但是由于其结构不封闭导致检测易受到外界环境干扰，并且样本流动不受控制，检测个体之间差异大，从而影响到检测灵敏度和检测重复性，无法满足检验科医生对临床诊断的检测性能要求。

4、微流控芯片poct检测技术是近十年发展起来的快速检测技术。由于微流控技术拥有样本流动控制、芯片封闭、管道微小、可控性强等特点，使得微流控芯片poct检测技术的检测灵敏度和检测重复性相比于层析poct检测技术均有不同程度提升，因此微流控芯片poct检测技术越来越受到市场的青睐。

5、现有技术中微流控芯片poct检测产品根据样本驱动方式不同大致可以分为两类：一类是被动式微流控检测芯片，即通过芯片中的微小管道来提供毛细力而驱动样本在芯片中的流动。被动式微流控芯片poct虽然检测方式简单，对检测系统要求低，但是整个样本检测反应控制性不强，试剂反应随机性大。被动式微流控芯片中含有的试剂反应腔预先填埋有干燥的反应试剂，当样本流入该试剂腔后复溶所干燥的试剂。该复溶过程随机，样本复溶体积和复溶过程不可控，从而导致检测重复性不佳，其检测重复性与层析poct检测技术相比并无明显改善。

6、另一类微流控芯片poct检测产品则是主动式微流控检测芯片，即通过外部作用力如气压力、机械力、离心力、电动力等方式驱动样本在芯片中的流动。主动式微流控芯片poct则对检测样本和试剂的流动和混匀反应过程精准控制，从而大大提高试剂检测重复性和检测灵敏度。但是以整合磁微粒检测技术的主动式微流控芯片poct，由于包被不同抗体的磁微粒不能通过磁场进行分离，因此该检测技术最主要的缺陷是只能进行单项目检测，在单通道微流控芯片中不能同时进行多项目检测。以整合压力阀的主动式微流控芯片poct，由于需要在芯片中整合弹性薄膜，而使得整个芯片封装工艺变得极为复杂，导致芯片制造产量低下。

技术实现思路

1、有鉴于此，为了克服现有技术中的缺陷，本发明的目的之一是提供了一种能够实现现场快速、准确、高灵敏且多项目定量检测的微流控芯片。

2、为了达到上述目的，本发明采用以下的技术方案：

3、一种微流控芯片，包括芯片基板和芯片盖板，所述芯片盖板上开设有用于添加检测样本的加样口，所述芯片基板上依次开设有位于所述加样口下方的反应腔、与所述反应腔相连通的混匀管道、与所述混匀管道相连通的检测管道以及废液槽，所述混匀管道中包被有用于提供荧光检测信号的荧光微球标记试剂，所述检测管道中装载有载体膜，所述载体膜上包被有至少一种捕获抗体试剂。在一些实施例中，检测管道的深度为50μm-1000μm；废液槽的深度为0.2mm-2mm。

4、在微流控芯片具体使用时，加样口可以连接到驱动装置，驱动装置的驱动方式可以是气压、液压或电动等方式，该驱动装置提供所加检测样本在芯片的管道中来回流动的驱动力，以使样本与管道中的试剂充分反应。

5、根据本发明的一些优选方面，所述混匀管道与所述检测管道之间还设置有超疏水管道。所述超疏水管道包括凹槽微结构以及微米结构的第一微米柱，所述凹槽微结构的表面具有超疏水试剂。超疏水管道可以起到检测样本与试剂反应形成反应复合物以及反应复合物流动至检测管道的过渡功能。凹槽微结构中每个凹槽的深度为20-500μm、宽度为50-4000μm；第一微米柱的直径为20-500μm，高度为20-500μm；超疏水试剂为溶解在电子氟化液中的氟硅烷。

6、超疏水管道由凹槽微结构、第一微米柱以及覆盖在凹槽微结构表面超疏水试剂组成，超疏水试剂以及凹槽微结构形成的超疏水表面能够实现被动式流动阻断阀，当检测样本受到驱动力而流动至该超疏水表面时，能有效阻挡液体继续流动，液体会留在凹槽中不会铺开，必须提高驱动力才能驱动液体继续向前流动，使得对液体流动的可控性进一步增强。

7、根据本发明的一些优选方面，所述混匀管道内设置有微米结构的第二微米柱，所述荧光微球标记试剂包被在所述第二微米柱上。第二微米柱的直径为10-500μm，高度为10-500μm。

8、混匀管道和反应腔相连通，并能够提供检测样本来回流动空间，检测样本复溶包被的荧光微球标记试剂的同时与之均匀混合，使之发生液体匀相免疫反应形成反应复合物。检测样本进入混匀管道后，先是对荧光微球标记试剂进行复溶，之后检测样本与荧光微球标记试剂之间混匀，最后检测样本与荧光微球标记试剂之间孵育反应，其中复溶和混匀基本发生在混匀管道中，孵育主要发生在反应腔内。即反应腔可以存储检测样本，并提供检测样本与试剂的反应场所。

9、更加优选地，所述荧光微球标记试剂为采用荧光微球标记的检测抗体。

10、更加优选地，所述捕获抗体试剂为采用纳米聚苯乙烯微球标记的捕获抗体。

11、根据本发明的一些优选方面，所述混匀管道与所述反应腔之间设置有过渡管道，所述过渡管道内设置有微米结构的第三微米柱以及凸台。过渡管道中的第三微米柱以及凸台能够对在反应腔和混匀通道之间流动的液体进一步起到混匀的作用，使得检测样本与试剂之间的反应更加充分。第三微米柱的直径为20-500μm，高度为20-500μm；凸台的高度为20-1000μm，宽度为100-4000μm。

12、所述载体膜为硝酸纤维素膜。如果载体膜内只包被有一种捕获抗体试剂，那该捕获抗体试剂可以随意分散在载体膜内；若载体膜内包被有两种或两种以上的捕获抗体试剂，则需要将载体膜分为几个区域，在不同的区域内包被有不同的捕获抗体试剂。这样在最后的检测中，才能分辨出对应不同区域的复合物产生的荧光信号。

13、本发明还提供了一种如上所述的微流控芯片的制备方法，具体包括以下步骤：

14、步骤1)荧光微球标记试剂的制备：采用时间分辨荧光微球分析法对已纯化的检测抗体原料进行标记，并收集荧光微球标记物即为荧光微球标记试剂；

15、步骤2)捕获抗体试剂的制备：采用稀释液对已纯化的捕获抗体原料进行稀释，并将稀释后的捕获抗体原料标记于纳米聚苯乙烯微球上，制备成捕获抗体试剂；

16、步骤3)芯片表面材料超亲水改性：采用真空等离子体轰击或大气等离子体轰击的方法对芯片表面材料进行超亲水改性；

17、步骤4)封闭液的喷涂和烘干：步骤3)中芯片表面超亲水改性完成后，将微流控芯片表面喷涂一层封闭液进行表面封闭，然后将芯片进行烘干处理；

18、步骤5)超疏水管道的制备：步骤4)中芯片烘干后，使用精密点样仪和超疏水试剂，对芯片中特定管道表面即凹槽微结构的表面进行超疏水改性，然后将芯片进行烘干处理，得到超疏水管道；

19、步骤6)荧光微球标记试剂的干燥：步骤5)中芯片烘干后，将步骤1)中收集的荧光微球标记物添加至芯片基板中的混匀管道中，然后进行烘干，使荧光微球标记物干燥于芯片中并包被在第二微米柱上；

20、步骤7)捕获抗体的固定：步骤6)中芯片烘干后，采用精密点样仪将步骤2)中制备的捕获抗体试剂包被于载体膜上，然后进行烘干，使聚苯乙烯微球标记的捕获抗体固定于载体膜上，并将该包被有捕获抗体试剂的载体膜放置于芯片基板的检测管道上；

21、如果载体膜内只包被有一种捕获抗体试剂，那该捕获抗体试剂可以随意分散在载体膜内；若载体膜内包被有两种或两种以上的捕获抗体试剂，则需要将载体膜分为几个区域，在不同的区域内包被有不同的捕获抗体试剂，这样在最后的检测中，才能分辨出对应不同区域的复合物产生的荧光信号；

22、步骤8)微流控芯片封装：在废液槽中放入吸水纸，并将芯片盖板与芯片基板进行组装并键合，得到微流控芯片。芯片基板与所述盖板通过压力胶、超声波、激光等方式键合在一起，形成封闭地床旁诊断的微流控芯片。

23、优选地，所述封闭液包含0.05％-0.5％bsa、0.01％-0.5％tween 20和10mm-200mmpbs；所述稀释液为10mm pbs。其中bsa为牛血清蛋白，优选其质量与封闭液的总体积比为0.1％；tween 20为表面活性剂，优选其体积与封闭液的总体积比为0.01％；pbs为缓冲液，优选其浓度为10mm。

24、本发明还提供了一种如上所述的微流控芯片的检测方法，具体包括以下步骤：

25、步骤a.加样混匀：移液枪加样，吸取检测样本加入上述键合完成的微流控芯片的加样孔内，随后将加样完成的微流控芯片放置入检测仪器的卡槽内，微流控芯片的加样孔与仪器的气路驱动装置结合，控制气路驱动装置在加样孔产生交替的正压和负压，驱动检测样本在芯片中的反应腔和混匀管道中来回流动，复溶混匀管道中的荧光微球标记试剂的同时与之均匀混合，混匀完成后停止产生正气压或负气压，并对混合溶液进行孵育使之发生免疫复合反应，形成荧光微球标记的抗体/抗原复合物；

26、步骤b.抗体/抗原复合物的捕获：步骤a完成后，气路驱动装置在加样孔产生一个高正气压，驱动含有抗体/抗原复合物的混匀样本流过超疏水管道之后，将高正气压降低为低正气压，驱动混匀样本流入芯片检测管道中的载体膜中，同时包被在该载体膜中的捕获抗体试剂与混匀样本中的抗体/抗原复合物进行免疫反应，形成捕获抗体-抗原-标记抗体复合物，未被捕获的其他物质随着液体流入废液槽中并被吸水纸吸收；

27、步骤c.数据读取：步骤b完成后，检测仪器的光学装置读取微流控芯片中载体膜上的荧光强度，计算出捕获抗体-抗原-标记抗体浓度并生成检测结果。

28、上述检测步骤中驱动装置产生的正压、负压以及高正压、低正压的大小以及时间根据实际需求进行设定。

29、由于以上技术方案的实施，本发明的微流控芯片与现有技术相比具有如下优点：

30、1、本发明的微流控芯片设计了固定反应体积的反应腔和混匀管道，结合主动驱动方式，驱动检测样本和试剂在管道中流动，精准控制样本与试剂的复溶和混匀过程，从而实现试剂复溶体积以及反应时间严格可控，大大提高检测可重复性；

31、2、本发明的微流控芯片设计的超疏水管道形成被动式流动阻断阀，封装简单，极大地简化芯片生产工艺，提高芯片产量；

32、3、本发明的微流控芯片在载体膜中不同的区域包被一种以上捕获抗体，实现多项目联合检测。