一种利用乳液模板制备3D双连续超大孔琼脂糖整体柱的方法

本发明涉及分析检测和整体柱制备领域，特别涉及一种利用乳液模板制备3d双连续超大孔琼脂糖整体柱的方法。

背景技术：

1、根据装填形式，层析分离介质主要分为两大类：微球类固定相和整体柱固定相。相比于微球固定相，诞生于上世纪90年代的整体柱具有柱内空间利用率高、渗透性能好、压降低、分离传质速率快等优点，在分析分离技术领域受到广泛关注，又被称为第四代色谱分离介质(anal.chem.,1992,64,820-822)。根据基质材料分类，整体柱又可以分为无机硅胶整体柱、有机聚合物整体柱、有机无机杂化整体柱和多糖整体柱。硅胶整体柱骨架规整，有丰富的介孔结构，比表面积能达到数百m2/g，在分离有机小分子和多肽小分子方面表面良好，但不适合生物大分子(j.chromatogr.a,2012,1228,250-262)，并且硅胶柱不耐酸碱，化学稳定性不理想。聚合物整体柱可选择单体广泛，容易化学衍生改性，但是骨架结构均匀性较差，缺乏介孔结构，比表面积一般几十m2/g，分离生物大分子的效率较低。同时聚合物整体柱的生物相容性、化学稳定性和机械强度很难调和。多糖整体柱生物相容性好，在分离核酸、类病毒颗粒(vlp)等结构复杂易失活的生物大分子方面具有优势，但渗透系数低和机械强度差是一直限制其广泛应用的桎梏。傅强等以戊二醛为交联剂，采用冷冻法制备了掺杂琼脂糖微球的琼脂糖/壳聚糖复合整体柱，最大操作流速达到724cm/h，掺杂琼脂糖微球的目的是提高整体柱比表面积和机械强度(int.j.biol.macromol.,2012,50,1002–1007)。进一步偶联2-巯基吡啶后用来纯化免疫球蛋白igg，发现当操作流速从45cm/h升高至317cm/h时，整体柱对igg的吸附量由28.5mg/g下降到4.0mg/g，说明掺杂琼脂糖微球使整体柱的孔道变窄，igg在整体柱内以扩散传质为主，传质阻力随着流速增大急剧增大。我们实验室前期提出了一种通过掺杂无机纳米粒子制备高强度多糖-无机纳米粒子复合整体柱的思路(zl 202310176004.4)，掺杂无机纳米粒子制备的整体柱比掺杂前机械强度提高了114％。但是这种方法制备的多糖整体柱孔道结构没有得到明显改善，在分离多聚亚基乙肝疫苗(mw 3000kda左右)、狂犬疫苗(mw 1000kda左右)、质粒dna(mw 2000-150000kda)等大分子量的生物大分子方面没有优势。

2、近年来，具有有序周期性结构和三维贯通孔道的双连续整体柱引起了人们的极大兴趣。双连续结构有利于实现材料内部高效的物质传输和扩散，从而提高材料内活性位点的利用率，在色谱分离、吸附和催化等领域用途广泛(adv.mater.,2023,35,2207684)。mann等人通过冰凝诱导自组装(isisa)制备了一种具有三维网络(3d)双连续结构的石墨烯/聚乙烯醇整体柱，比表面积37m2/g，添加聚苯乙烯磺酸钠修饰的片状氧化石墨烯后，杂化整体柱的机械强度比单独的聚乙烯醇整体柱提高了近一个数量级，具有很强的应用潜力(adv.mater.,2009,21,2180–2184)。乳液模板法制备多孔材料是一种有效且广泛使用的技术，通过乳液结构调节多孔材料的孔隙率、孔径和连通性。yao等利用高内相乳液(hipe)法通过调节表面活性剂pf127的浓度制备了具有双连续亚微骨架的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(pgma)整体柱(j.mater.chem.,2009,19,767-772)。hipe法虽然能很好调控聚合物孔道结构，但是其内相的体积浓度高达80-90％，这使得整体柱骨架很薄，机械强度不高难以应用。中内相乳液(mipe)内相体积一般在30-70％，以其为模板制备的多孔材料虽然骨架强度高，但是孔道连通性很差，仅有少量的喉孔，多数都是死孔(soft matter,2009,5,4780-4787)。

技术实现思路

1、针对现有多糖层析柱操作流速低、渗透性能差等不足，本发明开发了以一种3d双连续mipe为模板制备3d双连续超大孔琼脂糖整体柱的新方法。通过油水两相表面活性剂以及多糖分子链在界面上的相互协同作用，自组装形成弹性边界层从而制备得到3d双连续mipe是本发明的关键，该方法克服了传统mipe只有一相连续(w/o或o/w)的问题，使制备的琼脂糖整体柱具有3d双连续结构，兼顾了骨架机械强度和贯通的超大孔结构，孔内的对流传质使其在高流速下仍能保持不变的动态吸附容量。该整体柱在固定化酶(细胞)生物反应器以及病毒、质粒等生物大分子的快速分离纯化领域具有很大应用潜力。

2、本发明采用的技术方案是：

3、一种利用乳液模板制备3d双连续超大孔琼脂糖整体柱的方法，包括如下步骤：

4、(1)将琼脂糖干粉、水溶性表面活性剂和去离子水加入三口烧瓶中，搅拌，升温溶解得到水相a；其中琼脂糖质量浓度范围1％-20％，表面活性剂质量浓度范围0.5-10％；溶解温度90-100℃；

5、(2)将不溶于水的有机溶剂和油溶性表面活性剂加入烧杯中，搅拌溶解得到油相b，并将b在一定温度下加热保温；其中油溶性表面活性剂质量浓度范围0.5-10％；加热温度35-85℃；

6、(3)待步骤(1)中水相a冷却到乳化温度后，在机械搅拌条件下将步骤(2)中加热保温的油相b快速滴加到水相a中，继续搅拌至水油完全混合均匀，得到3d双连续mipe；

7、(4)用注射器将步骤(3)得到的3d双连续mipe转移到色谱柱管中，封口后在4℃下冷却5-48h；用蠕动泵向整体柱中依次泵入10个柱体积的50％乙醇溶液和去离子水，冲洗整体柱中的有机溶剂和表面活性剂，再向整体柱中循环泵入化学交联剂与碱的混合液，在一定温度下进行化学交联反应，反应一段时间后依次用50％乙醇溶液和去离子水清洗整体柱，即可得到3d双连续超大孔琼脂糖整体柱。

8、步骤(1)中所述的水溶性表面活性剂选自聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯(如吐温20、吐温40、吐温60、吐温80、吐温85)、脂肪醇聚氧乙烯醚(如aeo-7、aeo-9、aeo-15、aeo-20、aeo-23、平平加o-10、平平加o-15、平平加o-20、平平加o-25)、烷基酚聚氧乙烯醚(如op-9、op-10、op-15、op-20、op-30)、聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物(如f68、f88、f127、f108)的至少一种。

9、步骤(2)中所述的油相有机溶剂选自环己烷、正己烷、正庚烷、乙酸乙酯、乙酸丁酯、二氯乙烷、三氯甲烷、四氯化碳、甲苯、二甲苯、氯苯、溴苯、液体石蜡、橄榄油、异辛醇中的至少一种。

10、步骤(2)中所述的油溶性表面活性剂选自失水山梨醇脂肪酸酯(如司班40、司班60、司班65、司班80)、脂肪醇聚氧乙烯醚(如aeo-3、aeo-4、aeo-5、aeo-6)、烷基酚聚氧乙烯醚(如op-4、op-5、op-6、op-7)、聚氧丙烯-聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(如rpe1720、1740、2520)中的至少一种。

11、步骤(3)中水相与油相体积比为2:1-1:3；乳化温度35-90℃；搅拌速度50-3000rpm；乳化时间10-120min。

12、步骤(3)中水相与油相混合后，混合乳化剂的hlb范围为4-15，混合乳化剂的hlb值根据质量分数法计算。

13、步骤(4)中所述的化学交联剂可选用环氧氯丙烷、环氧氯丙烷-多元醇衍生物、1，4-丁二醇二缩水甘油醚、二环氧丁烷、乙二醇二缩水甘油醚、单环氧基或多环氧基的化合物及含有活泼卤素化合物等多官能团化合物的一种或至少两种的混合物。

14、步骤(4)中所述的碱选用氨水、氢氧化钠、氢氧化锂、氢氧化钾和氢氧化钡中的至少一种或是它们的混合物，浓度0.1-5m；交联剂质量浓度15-50％；交联温度15-75℃；交联反应时间2-48h。

15、本发明还公开了，通过上述方法制备的3d双连续超大孔琼脂糖整体柱，所述整体柱具有3d骨架和孔道结构，且骨架和孔道双连续。整体柱孔隙率50-75％，超大孔孔径2-30μm，比表面积5-50m2/g。

16、本发明的有益之处在于：

17、本发明通过油水两相表面活性剂以及多糖分子链在界面上的相互协同作用(靠近油相一侧是疏水作用，靠近水相一侧是氢键作用)，自组装形成弹性边界层从而制备得到3d双连续mipe，以其为模板通过冷却降温和后续化学交联，得到3d双连续超大孔琼脂糖整体柱。该整体柱具有3d双连续的骨架和孔道结构，渗透性能良好，骨架结构均匀，骨架强度也明显高于hipe法制备得到的整体柱。可用于细胞培养、酶固定化以及生物大分子快速分离领域。