针对fiv感染的免疫接种材料和方法

专利名称：针对fiv感染的免疫接种材料和方法
技术领域：
本发明在国家卫生研究院(National Institutes of Health)基金No.NIHAI30904支持的研究计划下由政府资助完成。政府在本发明中拥有一定的权利。
相关申请的交叉参考本申请要求2003年5月12日递交的美国临时申请Serial No.60/470,066的权利，该申请连同其所有的附图
、核酸序列、氨基酸序列和表格在此被全文引入为参考。
背景技术：
家猫易受若干逆转录病毒的感染，这包括猫白血病病毒(FeLV)、猫肉瘤病毒(FeSV)、内源C型致癌RNA病毒(RD-114)和猫合胞体形成病毒(FeSFV)。在这些病毒中，FeLV为最重要的病原体，其引起多种症状，包括淋巴网状内皮细胞和骨髓瘤、贫血、免疫介导的紊乱和与人获得性免疫缺陷综合症(AIDS)相似的免疫缺陷综合症。最近，称为FeLV-AIDS的特殊复制缺陷型FeLV突变体更特别与免疫抑制性质相关。
Pedersen等人(1987)最初报道了猫T-嗜淋巴细胞慢病毒(现在称为猫免疫缺陷病毒，FIV)的发现。FIV的特征已经在Yamamoto等人(1988a)、Yamamoto等人(1988b)和Ackley等人(1990)中报道。血清流行病学数据表明FIV感染为全世界家猫和野生猫固有的。多种症状与FIV感染有关，这包括流产、脱毛症、贫血症、结膜炎、慢性鼻炎、肠炎、齿龈炎、便血、神经异常、齿根骨膜炎和脂溢性皮炎。家猫感染FIV的免疫学标志为猫CD4+外周血淋巴细胞的慢性和进行性缺失、CD4∶CD8细胞比例的降低和一些情况下形成CD8的淋巴细胞增加。基于分子、生化和免疫病理学特征，现在认为猫的FIV感染为是比FeLV-FAIDS更好的猫AIDS模型。
Olmsted等人(1989a)、Olmsted等人(1989b)和Talbott等人(1989)报道了FIV的克隆和序列分析。Hosie和Jarrett(1990)描述了猫感染FIV的血清学反应。根据基于每一株系引起的交叉中和抗体水平的免疫类型可将FIV病毒亚型分类(Murphy和Kingsbury，1990)。最近根据基于核苷酸序列同源性的基因型对病毒亚型分类。虽然HIV和FIV亚型分类是基于基因型(Sodora等人，1994；Rigby等人，1993和Louwagie等人，1993)，但是关于亚型的基因型和免疫类型之间的相互关系还了解的很少。FIV病毒分离物分为四种FIV亚型A、B、C和D(Kakinuma等人，1995)。已经描述了除C亚型外所有FIV亚型的传染性分离物和传染性分子克隆(Sodora等人，1994)。C亚型FIV仅从加拿大猫的细胞DNA中鉴定出来(Sodora等人，1994；Rigby等人，1993；Kakinuma等人，1995)。本领域鉴定的FIV株系包括(株系亚型示于括号内)Petaluma(A)、Dixon(A)、UK8(A)、Dutch113(A)、Dutch19K(A)、UK2(A)、SwissZ2(A)、Sendai-1(A)、USCAzepy01A(A)、USCAhnky11A(A)、USCAtt-10A(A)、USCAlemy01(A)、USCAsam-01A(A)、PPR(A)、FranceWo、Netherlands、Bangston(A/B)、Aomori-1(B)、Aomori-2(B)、USILbrny03B(B)、TM2(B)、Sendai-2(B)、USCKlgri02B(B)、Yokohama(B)、USMAsboy03B(B)、USTXmtex03B(B)、USMCglwd03B(B)、CABCpbar03C(C)、CABCpbar07C(C)、CABCpady02C(C)、Shizuoka(D)和Fukuoka(D)。
在疫苗中使用FIV衍生免疫原的一个顾虑是兽医也许不能辨别测试为FIV抗体或FIV蛋白质阳性的猫是否已经感染了FIV或者抗体是来自针对FIV使用FIV衍生免疫原接种的猫。因此，本领域还需要这样的疫苗，其预防FIV感染但允许兽医确定FIV抗体是猫感染还是免疫接种的结果。
发明概述本发明涉及使用来自灵长类动物免疫缺陷病毒(包括HIV和SIV)的免疫原预防猫科动物感染FIV的方法和组合物。本文描述了用受试疫苗组合物接种猫科动物的方法和组合物。当用FIV攻击时，根据本发明的方法和组合物接种的猫科动物表现出对FIV的保护性免疫应答。
本发明也涉及选择免疫缺陷病毒中进化保守的表位的方法。使用本发明的方法鉴定的免疫缺陷病毒中进化保守的表位也构成本发明的一部分。本发明还涉及预防人和其他动物感染免疫缺陷病毒(如HIV和FIV)的方法。
序列简述SEQ ID.NO1为HIV-1UCD1包膜蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO2为HIV-1UCD1gag蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO3为编码包膜蛋白的HIV-1UCD1多核苷酸的核苷酸序列。
SEQ ID NO4为编码gag蛋白质的HIV-1UCD1多核苷酸的核苷酸序列。
SEQ ID.NO5为HIV-1IIIB包膜蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO6为HIV-1IIIBgag蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO7为编码包膜蛋白的HIV-1IIIB多核苷酸的核苷酸序列。
SEQ ID NO8为编码gag蛋白质的HIV-1IIIB多核苷酸的核苷酸序列。
发明详述本发明涉及通过给动物施用来自灵长类动物免疫缺陷病毒(如人免疫缺陷病毒(HIV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)的免疫原预防猫科动物感染FIV的材料和方法。在一个实施方案中，给猫科动物施用有效数量的包含来自灵长类动物免疫缺陷病毒免疫原的组合物。此外，本文所述的多种免疫原组合物可分开和彼此组合使用。
有利的是，本发明能够预防FIV感染，其中动物中针对FIV的免疫应答的产生允许兽医或本领域其他技术人员确定动物对FIV或者FIV免疫原或抗原的免疫应答究竟是免疫接种以预防FIV感染的结果，还是否为动物感染FIV的结果。在一个实施方案中，使用本发明的疫苗组合物免疫接种的动物不产生与FIV gp95交叉反应的抗体。感染FIV或接受含FIV衍生的免疫原或抗原的疫苗的动物产生与FIV gp95结合的抗体。包括在本发明范围之内的猫科动物包括家猫、野生猫和包括美洲野猫、美洲豹、山狮、老虎、美洲虎、金钱豹、美洲狮、印度豹和狮子在内的其他野猫。
本发明也可用于使用来自灵长类动物免疫缺陷病毒(如HIV和SIV)的免疫原在猫科动物中产生针对FIV的细胞和/或体液免疫应答。在一个实施方案中，给猫科动物施用数量足以诱导针对FIV的免疫应答的免疫原。可用健康的未感染HIV的人PBMC作为指示细胞测试免疫猫的血清抗体针对HIV的病毒中和抗体活性。可测试免疫的猫的HIV特异性T辅助细胞(Th)和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性。可通过Th细胞因子和CTL细胞毒素的水平测量Th和CTL活性，其中所述的Th细胞因子和CTL细胞毒素由未免疫接种和免疫的猫的淋巴细胞应答于灭活的HIV全病毒体外刺激产生，灭活HIV全病毒可与免疫原株相同(同源)和不同(异源)。用于体外刺激的灭活异源株可来自与免疫原株相同或不同的亚型。优选的免疫原在具有来自免疫的猫的CD4+T淋巴细胞的培养物中产生高水平的Th细胞因子并且是指示性的。类似地，优选的免疫原通过免疫的猫的CD8+T淋巴细胞产生高水平的CTL细胞毒素。
包括在本发明范围内的灵长类动物免疫缺陷病毒包括HIV和SIV。就HIV而言，该病毒可为HIV-1或HIV-2。在一个实施方案中，HIV为HIV-1。本领域描述了若干不同HIV-1株，包括HIV-1IIIB、HIV-1UCD1、HIV-1LAV和HIV-1BRU。在本文所述的代表性实施方案中，本发明的免疫原来自称为HIV-1IIIB和/或HIV-1UCD1的HIV-1株。包括在本发明范围内的SIV株为SIVsyk、SIVsmm、SIVmac、SIVmnd、SIVl’hoest、SIVagm和SIVcpz(Whetter等人，1999)。科学文献中描述了很多HIV和SIV基因的核苷酸序列，存储于序列数据库(如NCBI Genbank)中，并在出版的专利申请书和发行的专利中公开。例如HIV-1和HIV-2分离物的全基因组序列公开在Genbank登录号NC 001802和NC 001722中。类似地，HIV和SIV基因编码的蛋白质的氨基酸序列已经公开并为本领域所熟知。HIV的序列也公开于可在网站http//www.hiv.lanl.gov/content/index获得的数据库中。编码蛋白质的灵长类动物免疫缺陷病毒基因包括env、gag、pol和nef。
来自灵长类动物免疫缺陷病毒的免疫原可为孤立的形式或在任何适当的组合物中提供。优选地，灵长类动物免疫缺陷病毒免疫原在组合物中提供并以在猫科动物中诱导对免疫原强烈的细胞介导和体液免疫应答的方式施用。在一个实施方案中，可以病毒感染细胞或无细胞全病毒的形式提供免疫原。可以灭活或减毒病毒的方式处理病毒感染细胞中的病毒或无细胞病毒。灭活或减毒病毒的方法为本领域已知并包括例如用多聚甲醛、福尔马林、苯酚、紫外线、提高的温度等处理。美国专利No.6,503,753描述了HIV逆转录酶的光灭活方法，其从而灭活HIV病毒。灵长类动物免疫缺陷病毒也可制备成复制缺陷的。美国专利No.6,500,623描述了HIV复制缺陷病毒颗粒并设想生产这样的病毒颗粒。产生灭活、减毒和复制缺陷病毒的其他技术为本领域已知。
在另一个实施方案中，本发明的免疫原来源于灵长类动物免疫缺陷病毒的病毒蛋白质或免疫原性片段或其变体。本发明中可用作免疫原的蛋白质包括(但不限于)env、gag、pol、tat、rev和/或nef基因编码的蛋白质。在一个实施方案中，可用于本发明的env基因编码的包膜蛋白包括包膜蛋白gp120和gp160，这包括其片段、gp120和gp160的融合物以及gp120和gp160变体，包括糖基化变体，其包括未糖基化的gp120和/或gp160蛋白质。胞内蛋白质将gp160切割成gp41和gp120部分。gp41部分包含包膜蛋白的跨膜结构域，其中gp120位于感染的细胞或病毒体表面。gp120分子由大约60kd的多肽核心组成，但是N连接的糖基化可使蛋白质的分子量增加到大约120kd。与本发明组合使用的病毒包膜蛋白可为未修剪的或修剪的(见例如美国专利No.5,849,533)。包膜蛋白变体描述于美国专利No.5,846,546。免疫学模拟的HIV gp120和/或gp160包膜蛋白合成肽也可用于本发明(见例如美国专利No.5,763,160)。在代表性的实施方案中，组合HIV-1IIIB的gp120和gp160包膜蛋白作为免疫原。在一个实施方案中，HIV-1UCD-1的包膜多肽包含SEQ ID NO1中展示的氨基酸序列。在一个实施方案中，HIV-1IIIB的包膜多肽包含SEQ ID NO5中展示的氨基酸序列。
也可根据本发明使用灵长类动物免疫缺陷病毒gag基因编码的蛋白质，如HIV的p17基质蛋白、p24衣壳蛋白、p7核壳体蛋白和SIV的p27蛋白质以及它们的片段和变体。在代表性的实施方案中，用HIV-1UCD-1的p24蛋白质作为免疫原。在一个实施方案中，HIV-1UCD-1的p24多肽包含SEQ ID NO2的132-362氨基酸。在一个实施方案中，HIV-1IIIB的p24多肽包含SEQ ID NO6的132-363氨基酸。美国专利No.5,700,469中描述了p24蛋白质的免疫片段。灵长类动物免疫缺陷病毒pol基因编码的蛋白质(如HIV的逆转录酶(RT)蛋白酶(PR)和Rnase H以及它们的片段和变体)也可用于本发明。也可根据本发明使用HIV的内切核酸酶蛋白质p31以及其片段和变体，其为HIV pol基因3’末端编码的蛋白质。美国专利No.5,401,628中描述了HIV的p31蛋白质的免疫肽片段。灵长类动物免疫缺陷病毒的tat和rev基因编码的调节蛋白和灵长类动物免疫缺陷病毒的nef、vif、vpr、vpu和vpx基因编码的辅助蛋白以及这些蛋白质的片段和变体也可用于本发明。
可通过重组方法合成或制备与灵长类动物免疫缺陷病毒免疫原或抗原区域对应的肽并用于本发明的方法中。在一个实施方案中，可制备与灵长类动物免疫缺陷病毒蛋白质重叠片段对应的肽并用于本发明的方法中。任何多肽片段的适当组合可用于根据本发明的方法免疫接种动物。例如，与病毒蛋白质羧基端区域对应的肽片段可以和与蛋白质的氨基端区域和跨膜区域对应的肽片段一同使用。
重组病毒或基于病毒载体的表达构建体也可考虑用于本发明，其中所述的病毒或表达构建体包含灵长类动物免疫缺陷病毒核苷酸序列，例如HIV或SIV env、gag、pol、tat、rev、nef、vif、vpu、vpr、gag/pol或env-gag/pol序列它们的片段或变体。考虑将任何可用于制备重组载体/HIV或重组载体/SIVA构建体的适当病毒载体用于本发明。例如来源于腺病毒、禽痘、猫疱疹病毒、痘苗、金丝雀痘、昆虫痘、猪痘和其他本领域已知的病毒载体可用于本发明的组合物和方法。可使用本领域已知的标准基因工程技术构建编码并且可在适当宿主细胞中表达HIV或SIV元件的重组多核苷酸载体。
包含编码一种或多种灵长类动物免疫缺陷病毒蛋白质或者其片段或变体的核酸的DNA或RNA疫苗也可考虑用于本发明。核酸可以质粒或真核表达构建体形式提供。DNA疫苗和制剂在例如出版的专利申请20040076632、20040047878、20040009941、20020156037、20020032165和20010004531中有所描述。
正如在此使用的，术语“表达构建体”指核酸序列的组合，以提供有效连接的核酸序列的转录。正如在此使用的，术语“有效连接”指所述元件的并列，其中元件之间的关系允许们以其预期方式发挥作用。总之，有效连接的元件为相邻关系。
本发明的表达构建体通常也包括在用于表达表达构建体的目的宿主细胞中发挥作用的调节元件。因此，本领域的技术人员可选择调节元件用于例如细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、植物宿主细胞、昆虫宿主细胞、哺乳动物宿主细胞和人宿主细胞的调节元件。调节元件包括启动子、转录终止序列、翻译终止序列、增强子和多腺苷酸化元件。
本发明的表达构建体可包含与编码本发明肽的多核苷酸序列有效连接的启动子序列。启动子可使用本领域已知的标准技术整合到多核苷酸中。多拷贝启动子和复合启动子可用于本发明的表达构建体中。在优选的实施方案中，启动子与转录起始位点的距离可与天然遗传环境中相同。在基本不降低启动子活性的前体下允许此距离一定的改变。转录起始位点一般包含在表达构建体中。
就在动物细胞中表达而言，本发明的表达构建体可包含能驱动多核苷酸序列转录的适当启动子。如果细胞为哺乳动物细胞，那么表达载体中可使用这样的启动子，如肌动蛋白启动子、金属硫蛋白启动子、NF-κB启动子、EGR启动子、SRE启动子、IL-2启动子、NFAT启动子、骨钙蛋白启动子、SV40早期启动子和SV40晚期启动子、Lck启动子、BMP5启动子、TRP-1启动子、鼠乳腺肿瘤病毒长末端重复启动子、STAT启动子或免疫球蛋白启动子。
本发明的表达构建体可任选地含有转录终止序列、翻译终止序列、信号肽序列和/或增强子元件。转录终止区域一般可从真核或病毒基因序列的3’非翻译区获得。转录终止序列可位于编码序列的下游以提供有效的终止。信号肽为一组短的氨基端序列，其编码负责把有效连接的肽移到一系列翻译后细胞目的地的信号，这个范围从特定细胞器区室到蛋白质作用位点和胞外环境。通过使用有效连接的信号肽序列引导肽到预期细胞和/或胞外目的地被设想用于本发明的免疫原。化学增强子为增加基因转录的顺式作用元件，并可包括在表达构建体中。化学增强子为本领域已知并包括(但不限于)细胞巨化病毒(CMV)早期启动子增强子元件和SV40增强子元件。表达构建体中也可包括指导结构基因编码的mRNA多腺苷酸化的DNA序列。
表达构建体的5’和3’端可包括独特的限制性内切酶位点以允许插入多核苷酸载体。正如在此使用的，术语“载体”指任何遗传元件，其包括例如质粒、粘粒、染色体、噬菌体、病毒等等，当与适当控制元件联系时，其能复制并且可在细胞间转移多核苷酸序列。载体含有允许载体在所选宿主细胞中复制的核苷酸序列。可获得许多可进行表达和/或克隆的载体，包括(但不限于)pBR322、pUC系列、M13系列和pBLUESCRIPT载体(Stratagene，La Jolla，CA)。
本发明的多核苷酸、载体和表达构建体也可通过脂质转染法体内引入(经由合成阳离子脂质制备的脂质体转染DNA)(Felgner等人，1987)。合成阳离子脂质(LIPOFECTIN，Invitrogen Corp.，La Jolla，CA)可用于制备脂质体来包裹本发明的多核苷酸、载体和表达构建体。本发明的多核苷酸、载体和表达构建体也可以裸DNA，使用本领域已知的方法(如转染、显微注射、电穿孔法、磷酸钙沉淀)和生物射弹法引入。
正如在此使用的，术语“核酸”和“多核苷酸序列”指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸聚合体并且除非另有限制，包括已知的可以天然存在核苷酸相似方式发挥作用的天然核苷酸类似物。多核苷酸序列包括转录成RNA的DNA链序列和翻译成蛋白质的RNA序列。多核苷酸序列包括全长序列以及来源于全长序列的较短序列。应该理解，特定的多核苷酸序列包括天然序列或可引入以在特定宿主细胞中提供密码子偏好性的序列的简并密码子。进入本发明范围之内的多核苷酸序列还包括与代表性序列特异杂交的序列。多核苷酸包括如单链或双链体的正义和反义链。
本发明的方法考虑用本发明的疫苗组合物初次免疫。随后的或二次的免疫也考虑为本方法的范围之内。用于二次免疫的疫苗组合物可与用于初次免疫的组合物相同或不同。例如，动物的初次免疫可使用基于重组载体的HIV或SIV构建体，具有单一或多个株系的组分，然后用疫苗组合物二次加强，二次加强的疫苗组合物包含HIV或SIV感染的细胞系或者HIV或SIV多肽、或者无细胞HIV或SIV病毒，也具有单一或多个株系的组分。初次免疫也可使用HIV和/或SIV DNA疫苗。在一个实施方案中，重组载体构建体用于初次免疫，而蛋白质或蛋白质加上重组载体构建体、亚单位疫苗组合物用于二次加强。此外，本发明考虑这样的方法，其中用于初次免疫的免疫原为HIV或SIV来源的免疫原，例如HIV p24蛋白质，用于二次免疫的免疫原来源于FIV，例如FIV gp95和/或gp36蛋白质或者全FIV病毒或FIV感染的细胞。用本发明的疫苗组合物免疫接种的其他方法是本领域的技术人员显而易见的，并考虑为在本发明的范围之内。
在一个实施方案中，将来源于多种灵长类动物免疫缺陷病毒蛋白质的免疫原组合施用给动物。在代表性的实施方案中，给猫科动物施用包含HIV-1p24免疫原和HIV-1gp120及gp160免疫原的组合物。在另一个代表性实施方案中，给猫科动物施用包含HIV-1 p24作为唯一免疫原的组合物。
本发明也涉及预防猫科动物感染FIV或通过给动物施用组合物以产生针对FIV的免疫应答的材料和方法，其中所述的组合物包含来源于灵长类动物免疫缺陷病毒的免疫原和来源于FIV的免疫原。FIV衍生的免疫原在本领域已有所描述。见例如美国专利No.5,118,602、5,565,319、5,510,106、5,275,813、5,037,753和4,861,720。可根据本发明使用的FIV免疫原可来自FIV的单一亚型或株系，或者免疫原可来源于FIV的多种亚型。多亚型FIV免疫原已在美国专利No.5,846,825、6,254,872和6,447,993中描述。
在本发明方法的一个实施方案中，给猫科动物施用的免疫原包含在灵长类动物免疫缺陷病毒和FIV之间保守的表位。在另一个实施方案中，保守的表位存在于免疫缺陷病毒的包膜蛋白中。具有与本发明表位拓扑学等价的构象并且与结合保守表位的抗体结合相同的抗原结合区的分子(模拟表位)也考虑在本发明范围之内。一般地，模拟表位为肽分子，但是模拟表位也可从其他非肽分子制备。
本发明也涉及来自灵长类动物免疫缺陷病毒的免疫原，其中免疫原为蛋白质或肽并且包含在灵长类动物免疫缺陷病毒和FIV之间保守的表位。在代表性实施方案中，免疫原包含HIV-1IIIB的gp120和gp160蛋白质，任选地包含HIVUCD1的p24蛋白质。在另一个实施方案中，免疫原包含HIVUCD1的p24蛋白质。本发明也涉及编码蛋白质或肽的多核苷酸，其中所述的蛋白质或肽包含来自免疫缺陷病毒的免疫原的保守表位。
本发明还涉及与来自灵长类动物免疫缺陷病毒和FIV的免疫原的表位交叉反应的抗体。抗体可为多克隆或单克隆形式。抗体可来源于能产生针对所述表位的抗体的任何动物，包括例如人、猿、猴子、小鼠、大鼠、山羊、绵羊、猪、奶牛和猫科动物。非人类抗体也考虑在本发明范围之内，其与来自灵长类动物免疫缺陷病毒和FIV的免疫原的表位交叉反应，但是已经使用本领域已知的标准技术“人源化”，如使用美国专利No.5,530,101、5,585,089、5,693,762、6,180,370和6,407,213中所述的技术“人源化”。
本发明的肽和/或多肽免疫原也可以多抗原肽(MAP)构建体形式提供。Tam(1988)中描述了MAP构建体的制备。MAP构建体利用多拷贝的免疫原合成其上的赖氨酸残基核心基质(Posnett等人，1988)。多MAP构建体可根据本发明的方法以疫苗组合物的形式制备和施用，每一个构建体含有相同或不同的免疫原。在一个实施方案中，MAP构建体连同一种或多种佐剂提供和/或施用。
灵长类动物免疫缺陷病毒蛋白质的天然、重组或合成多肽和其肽片段也可根据本发明方法用作疫苗组合物。在一个实施方案中，不同的多肽以组合制品施用给猫科动物。在代表性的实施方案中，给猫科动物施用HIV-1gp120/160和HIV-1 p24多肽。在另一个实施方案中，来自不止一种HIV株的HIV多肽组合到疫苗组合物中并用于接种宿主动物。例如，基于至少两个HIV-1株系的HIV包膜糖蛋白的多肽可组合到疫苗中。多肽可包含“杂合”或“嵌合”多肽，其氨基酸序列来自至少两种不同HIV株的多肽的连接。制备HIV多肽的方法为本领域熟知。例如，可使用固相合成方法(Merrifield，1963)合成HIV多肽。也可使用重组DNA技术产生HIV多肽，其中编码HIV蛋白质或肽的多核苷酸分子在宿主细胞(如细菌、酵母或哺乳动物细胞系)中表达，并使用本领域标准技术纯化。
根据本发明的方法，本文所述的免疫原组合物以诱导针对随后FIV对宿主感染或攻击的保护性免疫的有效数量和方式给易感宿主(一般为家猫)施用。免疫原一般通过注射肠胃外施用，例如皮下、腹膜内、肌内，或者通过口腔或鼻内施用，或者通过此类途径的任何组合施用。免疫原通常给宿主动物施用至少两次，两次施用间隔一周或几周。然而，也考虑起始或加强施用免疫原的其他用药法，并且可依赖于医生的判断和待治疗的具体宿主动物。
可根据本发明使用的免疫原可与可药用载体或稀释剂一起提供。用于本发明的化合物和组合物可根据制备可药用组合物的已知方法制备。制剂在大量本领域技术人员熟知并且易于获得的资料中详细描述。例如，E.W.Martin，Easton Pennsylavania编写的《Remington’s PharmaceuticalScience》(Mack Publishing Company，第19版，1995)描述了可结合本发明使用的制剂。总之，配制本发明的组合物以便有效数量的免疫原与适当的载体组合，以促进组合物的有效施用。用于本发明方法的组合物也可为多种形式。这些形式包括例如固体、半固体和液体剂型，如片剂、丸剂、粉末剂、液体溶液或悬浮液、栓剂、可注射和输注的溶液和喷雾剂。优选的形式依赖于目的施用方式和治疗应用。组合物也优选地包含本领域技术人员已知的常规可药用载体和稀释剂。与目的肽模拟物一起使用的载体或稀释剂的实例包括(但不限于)水、盐水、油(包括矿物油)、乙醇、二甲基亚砜、明胶、环糊精、硬脂酸镁、葡萄糖、纤维素、糖、碳酸钙、甘油、铝、淀粉以及等价载体和稀释剂，或者任何这些物质的混合物。本发明免疫原的制剂也可包含悬浮剂、保护剂、润滑剂、缓冲液、防腐剂和稳定剂。为在所需治疗处理中施用此类药剂，本发明的药用组合物有利地包含以包括载体和稀释剂的总组合物的重量计0.1-45％，尤其是1-15％的免疫原。
可通过本领域已知的方法制备本发明的免疫原组合物。例如，免疫原一般制备成可注射剂，例如液体溶液或悬浮液。免疫原以与剂量形式相容的方式并在接受者中治疗有效和致免疫的数量施用。本领域技术人员可容易地确定特定免疫原制剂的最佳剂量和施用方式。
如上面提到的，免疫原制剂中的病毒和细胞可使用本领域已知的方法灭活或减毒。疫苗制剂中无细胞完整或部分病毒的数量通常为约0.1-5mg，更通常的为约0.2-2mg。包含病毒感染的细胞系的制剂的剂量通常每剂量含有约106-108个细胞，更通常地每剂量含有约5×106-7.5×107个细胞。依赖于接受药剂的动物的大小、年龄等，用于猫科动物的一剂中蛋白质或肽免疫原的数量为约0.1-10000μg，或者约1-5000μg，或者约10-1000μg，或者约25-750μg，或者约50-500μg，或者约100-250μg。
在一个实施方案中，本发明的免疫原与一种或多种增加动物对免疫原免疫应答的佐剂一起提供。本发明的免疫原可与任何适当的佐剂或本领域已知的佐剂一起提供和/或施用。可用于本发明免疫原制剂的佐剂包括苏氨酰胞壁酰二肽(MDP)(Byars等人，1987)、Ribi佐剂系统组分(Corixa Corp.，Seattle，WA)(包括细胞壁骨架(CWS)成分、弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂或其组合)。多种适合用于本发明方法和疫苗的其他佐剂(如铝、氢氧化铝和皂苷)为本领域所熟知并考虑用于本发明。细胞因子(γ-IFN、GM-CSF、CSF等等)和淋巴因子(IL-I、IL-2等)也用作疫苗组合物的佐剂和/或添加物并考虑为在本发明的范围之内。包含本发明免疫原的组合物中可包含一种或多种不同的细胞因子和淋巴因子。在一个实施方案中，本发明的免疫原与淋巴因子白细胞介素-12(IL-12)组合施用给动物，其中所述的白细胞介素-12与另一种佐剂组合。同样特别考虑为本发明范围之内的为淋巴因子白细胞介素-18(IL-18)用作佐剂组合物的部分。在一个实施方案中，用于本发明的佐剂组合物包含IL-12和IL-15，或IL-15和IL-18，或IL-12和IL-18，或IL-12、IL-15和IL-18的组合。优选地，细胞因子为在猫科动物中具有生物活性的种类。更优选地，细胞因子为猫科动物细胞因子，例如猫IL-12、猫IL-15、猫IL-18等等。在代表性的实施方案中，灵长类动物来源的免疫原与包括CWS和IL-12和/或IL-18在内的Ribi佐剂系统组分组合施用。
下面列出了本文所用的FIV株缩写株(亚型) 缩写Petaluma(A)FIVPetDixon(A) FIVDixUK8(A) FIVUK8Bangston(B)FIVBangAomori-1(B)FIVAom1株(亚型) 缩写Aomori-2(B)FIVAom2Fc1(B) FIVFC1Shizuoka(D)FIVShiDutch113(A)FIVDut113Dutch19K(A)FIVDut19UK2(A) FIVUK2SwissZ2(A) FIVSwiZ2Sendai-1(A)FIVSen1Sendai-2(B)FIVSen2USCAzepy01A(A) FIV
USCAhnky11A(A) FIVUSC11USCAtt-10A(A)FIVUSC10USCAlemy01(A)FIVUSCAsam-01A(A) FIVPPR(A) FIVPPRFranceWo FIVFraNetherlands FIVNetUSILbrny03B(B) FIVUSI03TM2(B) FIVTM2USCKlgri02B(B) FIVUSC02Yokohama(B) FIVYokUSMAsboy03B(B) FIVUSMA03USTXmtex03B(B) FIVUST03USMCglwd03B(B) FIVUSMC03CABCpbar03C(C) FIVCAB03CABCpbar07C(C) FIVCAB07CABCpady02C(C) FIVCAB02Fukuoka(D) FIVFuku本发明也涉及使用动物模型筛选免疫缺陷病毒(如HIV和FIV)间保守表位的方法，其中所述的表位可用于免疫接种免疫缺陷病毒感染的人或动物。在本方法的一个实施方案中，HIV从HIV感染的病情长期稳定患者分离。如本文所用的，术语“病情长期稳定”指表现稳定的CD4计数达至少10年，表现低病毒载量(即血浆病毒水平低到RT-PCR检测不到的水平)并且一般表现很少或没有病症的HIV感染患者。制备经分离的HIV免疫原并用于免疫接种猫科动物(如家猫)。在本方法的一个实施方案中，用HIV蛋白质的肽片段作为免疫原。优选地，制备代表全长HIV蛋白质的重叠片段用作免疫原。在一个实施方案中，给不同的猫施用肽片段的不同组合以鉴定这样的片段，其含有针对FIV感染提供最强预防保护的表位。随后用FIV攻击免疫接种的猫。预防猫在FIV攻击时被感染的免疫原包含进化保守的表位并可用作免疫原免疫接种免疫缺陷病毒感染的人、猫科动物和其他哺乳动物。免疫原优选地预防猫感染一种以上亚型的FIV。可制备包含进化保守表位的免疫原片段并使用本发明方法检测以进一步分离表位。也可对片段测序以确定表位的一级氨基酸序列。在优选的实施方案中，包含用本发明方法筛选的进化保守表位的免疫原可用于免疫接种感染HIV的人。在本方法的一个实施方案中，用于免疫接种猫的免疫原为HIV p24蛋白质或其免疫原性片段。本发明也涉及用本发明方法鉴定的免疫缺陷病毒进化保守表位。
本发明也涉及这样的方法，其在人和其他动物中诱导针对包含免疫缺陷病毒(如HIV和FIV)中进化保守表位的免疫原、抗原或病毒的免疫应答。在一个实施方案中，以足够诱导针对免疫原或抗原和任何呈现免疫原的病毒或细胞的免疫应答的数量和持续时间向人或动物施用包含用本文所述方法鉴定的一种或多种免疫缺陷病毒进化保守表位的免疫原或抗原。所诱导的免疫应答可为体液介导或细胞介导或两者均有。在一个诱导针对HIV免疫应答的实施方案中，给人施用包含从HIV鉴定的进化保守表位的免疫原。考虑在本发明范围之内的免疫原包括(但不限于)HIV p24蛋白质或其免疫原性片段。在一个实施方案中，本方法所用的免疫原包括HIV-1UCD1p24蛋白质或其免疫原性片段。
本发明也涉及预防人和其他动物(如猫)感染免疫缺陷病毒(如HIV和FIV)的方法。在本方法的一个实施方案中，以足以免疫接种人或动物并为人或动物感染免疫缺陷病毒提供某种水平的预防的持续时间向人或动物施用包含一种或多种用本文所述方法鉴定的免疫缺陷病毒进化保守表位的有效数量的免疫原或抗原，，。在一个预防HIV感染的实施方案中，用包含从HIV鉴定的进化保守表位的免疫原免疫人。考虑在本发明范围之内的免疫原包括(但不限于)HIV p24蛋白质或其免疫原性片段。在一个实施方案中，本发明方法中使用的免疫原包括HIV-1UCD1p24蛋白质或其免疫原性片段。
免疫原一般通过注射(例如皮下、腹膜内或肌内注射)肠胃外施用。其他适当的施用方式包括口腔或鼻内施用。通常给人或其他动物至少施用两次免疫原，每一次施用之间间隔一周或数周。然而，也考虑起始和加强施用免疫原的其他方案，并可依赖于医生的判断和接受治疗的患者。
可通过本领域熟知的方法制备本发明的免疫原组合物。例如免疫原一般制备成可注射剂，例如液体溶液或悬浮液。免疫原以与给药制剂相容并在接受者中治疗有效和致免疫的数量施用。本领域的技术人员容易地确定特定免疫原制剂的最佳剂量和施用方式。
可根据本发明使用的免疫原可与可药用载体或稀释剂一起提供。在一个实施方案中，本发明的免疫原与一种或多种增强人或动物针对免疫原的免疫应答的佐剂一起提供。本发明的免疫原可与本领域已知的任何适当佐剂一起提供和/或施用。
本发明也涉及这样的组合物，其包含来源于灵长类动物免疫缺陷病毒的免疫原和猫细胞因子或淋巴因子。免疫原可来源于HIV，这包括HIV-1(例如HIV-1IIIB、HIV-1UCD1和HIV-1BRU)和HIV-2。组合物的HIV免疫原包括(但不限于)HIV gp160、gp120、gp41、p24、p31、p17、p7或HIVgag、pol、env、tat、rev、nef、vif、vpr、vpu或vpx基因编码的蛋白质、或者它们的片段或变体。在一个实施方案中，淋巴因子为猫IL-12、IL-15和或IL-18。在代表性实施方案中，免疫原为HIV-1 p24，淋巴因子为猫IL-18。组合物也可包含佐剂，如本文所述的佐剂之一。
本发明涉及这样的试剂盒和给药制剂，其在一种或多种容器中包含来源于灵长类动物免疫缺陷病毒本发明的免疫原和猫细胞因子或淋巴因子。免疫原可来源于HIV(例如HIV-1IIIB、HIV-1UCD1和HIV-1BRU)和HIV-2。组合物的HIV免疫原包括(但不限于)HIV gp160、gp120、gp41、p24、p31或HIV gag、pol、env、tat、rev、nef、vif、vpr、vpu或vpx基因编码的蛋白质、或者它们的片段或变体。在一个实施方案中，淋巴因子为猫IL-12、IL-15和或IL-18。在代表性实施方案中，免疫原为HIV-1 p24，淋巴因子为猫IL-18。试剂盒和给药制剂也可包括佐剂，如本文所述的佐剂之一。
本文所涉及或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物全部整体引入作为参考，但是引用的程度不应使它们与本说明书的明确教导不一致。
下列为描述实施本发明的方法的实施例。这些实施例不应解释为限制性的。除非另外注明，所有百分比以重量计，所有溶剂混合比例以体积计。
实施例1四只SPF猫的每一只(n＝4)用HIV-1疫苗制剂A或HIV-1疫苗制剂B以3周间隔免疫四次并在最后一次加强之后三周用15倍猫感染剂量(CID50)体内来源的FIVBangston接种物攻击。另外四只SPF猫(对照组)不接受免疫接种但是类似地用FIV攻击。HIV-1疫苗制剂A由混合于0.5mlRibi佐剂系统中的200μg HIV-1UCD1p24、25μg HIV-1IIIBgp120(ImmunoDiagnostics Inc.，Woburn，MA)和25μg HIV-1IIIBgp160(ImmunoDiagnostics Inc.)组成，其中所述的Ribi佐剂系统包含含有5μg重组人白细胞介素-12(rHuIL-12)的细胞壁骨架(CWS)组分(每剂25μg细胞壁骨架)(Corixa Corp.，Seattle，WA)。HIV-1疫苗制剂B由混合于含5μgrHuIL-12的0.5ml Ribi佐剂系统CWS组分的200μg HIV-1UCD1p24组成。重组HIV-1UCD1p24用QIAexpress pQE载体(Qiagen Inc.，Valencia，CA)在大肠杆菌(E.coli)表达系统中产生，所表达的6个组氨酸标记的p24产物通过Ni-NTA亲和层析(Qiagen Inc.)纯化。体内来源的FIV接种物由两只感染FIVBangston的猫的混合血浆组成，使用每对数稀释物3-4只SPF猫在体内滴定(Pu等人，2001)。
此研究结果显示于表1。作为额外的测定FIV感染状态的方法，使用逆转录酶RT测定法和原病毒PCR作为病毒检测系统进行病毒分离。用HIV-1疫苗制剂A免疫并随后用FIV攻击的四只猫中的一只(1/4)和用HIV-1疫苗制剂B免疫并随后用FIV攻击的四只猫中的两只(2/4)通过病毒分离为FIV阴性，并且在攻击后16周丧失抗FIV p24的抗体和不产生抗FIV gp95的抗体，而剩余的猫产生抗FIV gp95的抗体并产生较强的持续的抗FIV p24抗体反应。所有四只对照猫在攻击后16周产生抗FIV p24的抗体和抗gp95的抗体并且在攻击后13周为病毒分离物阳性。因此，表明HIV-1疫苗制剂B在预防猫受FIV攻击方面比HIV-1疫苗制剂A(仅有HIV-1 p24)具有更好或相等的效力，这表明HIV-1UCD1p24为可诱导针对FIV攻击的保护性免疫的疫苗组分。所有用HIV-1疫苗制剂A免疫的四只猫和用HIV-1疫苗制剂B免疫的四只猫中三只在第四次接种之后产生抗FIV p24的交叉反应抗体。
既然在HIV-1接种的表现对FIV保护性免疫应答的猫中没有抗FIVgp95的交叉反应抗体，那么FIV gp95的抗体的有无分别为动物是否为接种HIV或感染FIV的标志。此外，本研究结束时接种猫中FIV p24交叉反应抗体的丧失也表示接种的猫是受保护免于FIV攻击的。
实施例2在随后的研究中，四只无特异病原体(SPF)猫的每一只用HIV-1/UCD1(HIV-1UCD1)p24或HIV-1/LAV(HIV-1LAV)p24疫苗以每剂250μg免疫，其中疫苗溶于添加有每剂5μg重组人IL-12(rHuIL-12)的1ml Ribi佐剂(每剂25μg CWS(细胞壁骨架))中。另一组三只SPF猫接受无Ribi佐剂或rHuIL-12的HIV-1UCD1p24以评价佐剂的重要性。对照组猫接受Ribi佐剂或PBS。所有的猫以三(3)周间隔免疫接种三(3)次并于最后一次免疫后三周用15 CID50的体内来源的FIV-Bangston(FIVBang)攻击。如表2所示，四只用含佐剂的HIV-1UCD1p24免疫接种的猫中的四只(4/4)在所有四只对照猫攻击之后感染FIV的剂量下处不受FIV感染。用含佐剂的HIV-1UCD1p24免疫接种的受保护猫在攻击后54周为FIV感染阴性，因此它们为完全受保护的。表2显示的结果表明HIV-1UCD1p24疫苗(4只猫中的4只或者100％受保护)比HIV-1LAVp24疫苗(4只猫中的2只或者50％受保护)更有效。接受不含佐剂的HIV-1UCD1p24的组在用FIV攻击时具有最小的感染保护(3只猫中的1只或者33％受保护)。
实施例3进行另一项研究以确定HIV-1LAVp24疫苗诱导的保护是否为可重复的。在本研究中，三只SPF猫用每剂200μg的HIV-1LAVp24疫苗免疫，其中所述的疫苗在添加每剂5μg rHuIL-12的1ml Ribi佐剂(每剂25μgCWS(细胞壁骨架))中配制。此外，三只SPF猫的每一只用每剂200μg的FIVBangp24或FIV-Petaluma+Shizuoka(FIVPet/Shi)p24疫苗免疫，其中所述的疫苗在添加每剂5μgrHuIL-12的1ml Ribi佐剂(每剂25μgCWS(细胞壁骨架))中配制。FIVPet/Ship24疫苗由溶于添加rHuIL-12的Ribi佐剂中的130μg FIVPetp24和70μgFIVShip24组成。三只对照猫接受佐剂。免疫和攻击方案(包括攻击接种物的和剂量)与实施例2所述相同。如表3所示，用HIV-1LAVp24疫苗免疫接种的三只猫中的三只(3/3)受保护所有三只对照猫感染的剂量。用FIVBangp24免疫接种的3只猫中只有1只，用FIVPet/Ship24免疫接种的3只猫中有2只受保护。这些结果验证了HIV-1LAVp24疫苗也与FIV疫苗一样有效。而且，HIV-1 p24疫苗与FIVPet/Ship24疫苗同样有效并且可能比FIVBangp24疫苗抗FIVBang攻击更有效。
实施例4进行另一项研究以评价降低p24剂量和改变佐剂的细胞因子添加的影响。三只SPF猫用每剂200μg的HIV-1UCD1p24抗原免疫，其中所述的HIV-1UCD1p24抗原在添加重组猫IL-18(rFeIL-18；5μg/剂量)而非rHuIL-12的1ml Ribi佐剂中配制(每剂25μg CWS(细胞壁骨架))。为确定佐剂中细胞因子添加的影响，另外三只SPF猫用每剂200μg的HIV-1UCD1p24抗原免疫，其中所述的HIV-1UCD1p24抗原在无细胞因子添加的Ribi佐剂(每剂25μg CWS(细胞壁骨架))中配制。作为对照，两只SPF猫的每一只用添加rFeIL-18的Ribi佐剂、单独的Ribi佐剂或PBS免疫。除了稍微提高的25CID50攻击剂量外，免疫和攻击方案与实施例2和3相同。如表4所示，用在添加rFeIL-18的Ribi佐剂中配制的HIV-1UCD1p24疫苗免疫的三只猫中的两只(2/3)受保护，而用只有Ribi佐剂配制的HIV-1 p24疫苗免疫接种的三只猫中只有一只(1/3)受保护。所有对照猫在攻击后5-9周感染。因此，在Ribi/FeIL-18中配制的HIV-1UCD1p24疫苗展示了保护作用(3只猫中的两只)。此外，表明在Ribi/FeIL-18中配制的HIV-1UCD1p24疫苗比在只有Ribi佐剂(无FeIL-18)中配制的疫苗更有效(2/3受保护的猫对1/3受保护的猫)。
实施例5在另一项研究中，攻击株从FIVBang(其为A/B亚型)变为FIVFC1(其为B亚型)以检测HIV-1 p24疫苗是否会预防猫感染其他FIV攻击株。FIVBang具有基团特异性抗原(gag)、聚合酶(pol)和属于A亚型的被膜(env)基因序列的小部分(V1-V3区域)，而env基因的大部分(V4-V9区域)属于B亚型。因此，FIVBang为A和B亚型的重组体。另一方面，FIVFC1在gag、pol和env处具有B亚型基因序列并且完全为B亚型株。gag由基质-核心-核壳体组成并且核心基因为p24基因。因此，HIV-1UCD1和HIV-1LAVp24疫苗预防猫感染具有A亚型p24的FIVBang。此研究检测HIV-1 p24疫苗是否预防猫感染具有B亚型p24的FIVFC1。
四只SPF猫用每剂200mg的HIV-1UCD1p24免疫，其中所述的HIV-1UCD1p24溶于添加每剂5μg rHuIL-12的1ml Ribi佐剂(每剂25μgCWS(细胞壁骨架))中。为进行比较，另外四(4)只SPF猫用商业购买的溶于与疫苗一起提供的佐剂中的二元亚型(dual-subtype)FIVPet/Shi疫苗(FEL-O-VAX FIV；Forth Dodge Animal Health，Overland Park，Kansas)免疫。三只对照猫接受PBS免疫。除了FIVFC1的攻击接种物为15CID50外，免疫和攻击方案与实施例2和3所述相同。如表5所示的结果，用HIV-1UCD1p24疫苗免疫的四只猫中的三只(3/4)和所有四只FEL-O-VAXFIV免疫猫受保护于所有三只对照猫感染的剂量。因此，HIV-1 p24疫苗预防猫具有B亚型p24并与FIVBang攻击株显著不同的攻击株(FIVFC1)。
实施例6实施例1到实施例5所述研究的结果总结于表6中。总体上，用Ribi/rHuIL-12或Ribi/rFeIL-18佐剂中配制的HIV-1UCD1p24疫苗免疫的15只猫中有11只(73.3％)受保护。类似地，用Ribi/rHuIL-12中配制的HIV-1LAVp24免疫的7只猫中有5只(71.4％)受保护。仅用Ribi/rHuIL-12配制的HIV-1 p24的最初免疫分析表明HIV-1UCD1p24疫苗(7/8受保护的猫或者87％受保护)可能比HIV-1LAVp24疫苗(5/7受保护的猫或者71％受保护)更有效。但是，在用溶于Ribi/rHuIL-12或Ribi/rFeIL-18的HIV-1 p24疫苗免疫的22只猫中的16只(72.7％)的综合总数(combined total)中观察到了完全消除性保护(sterilizing protection)，其在保护方面基本高于用FIVp24疫苗免疫后的6只猫中的3只(50％)。
应理解为本文所述的实施例和实施方案仅为描述目的，建议本领域的技术人员在此基础上进行多种修饰或改变并且，并且这些修饰或改变包括在此申请的精神和范围，以及附属权利要求的范围之内。
表1.HIV-1蛋白质对FIVBang攻击感染的免疫原性和效力(研究1)

Pre＝接种前；V3＝第三次接种后；V4＝第四次接种后。
4、7、10、13、16和18wpc＝FIV攻击后的4、7、10、13、16和18周。
核心p24和被膜抗体阴性(-/-)(FIV gp95；HIV gp120/160)。
p24抗体阳性但是被膜抗体阴性(+/-)。
核心p24和被膜抗体阳性(+/+)。
H＝抗有高分子量(p70)蛋白质抗体但没有抗FIV被膜(gp95)抗体。
ND＝未测定表2.HIV-1蛋白质免疫原性(3X免疫接种)和抗A/B亚型FIVBang攻击感染(15CID50)的效力(研究2)

Pre＝接种前；V3＝第三次接种后；4、6、9、16、20、48和54wpc＝用FIV-Bang(A/B亚型)体内接种物(合并的感染血浆)攻击后4、6、9、16、20、48和54周。Ribi+IL-12由含每剂25μg细胞壁骨架的Ribi佐剂和每剂5μg人IL-12组成。
FIV免疫印迹中核心p24和被膜(FIV gp95)抗体阴性(-/-)表明仍为FIV感染阴性。FIV免疫印迹中p24抗体阳性但是被膜抗体阴性(+/-)。除非抗p24抗体效价强于以前的效价，接种的猫可能仍为病毒感染阴性。然而，对PBS对照来说，这样的免疫印迹反应性表明了FIV感染。FIV免疫印迹中核心p24和被膜抗体阳性(+/+)表明在接种组和PBS对照组中FIV感染阳性。
FIV病毒分离阴性(-)和阳性(+)基于RT和PCR。20/54wpc时FIV病毒分离阴性(-/-)代表了20wpc和54wpc时进行的分离。这些动物仍然存活并用于1年的加强攻击研究。20wpc时FIV病毒分离阳性并由于在20wpc时收获组织后对动物进行了安乐死而在48wpc未检测(+/T)。
表3.HIV-1和FIV p24蛋白质免疫原性(3x免疫接种)和抗A/B亚型FIVBang攻击感染(15CID50)的效力(研究3)

Pre＝接种前；V3＝第三次接种后；5、8、10、12、15和18wpc＝用FIV-Bang体内接种物(合并的感染血浆)攻击后5、8、10、12、15和18周。Ribi+IL-12由含每剂25μg细胞壁骨架的Ribi佐剂和每剂μg的人IL-12组成。
FIV免疫印迹中核心p24和被膜(FIV μg95)抗体阴性(-/-)表明仍然未FIV感染阴性。FIV免疫印迹中p24抗体阳性而被膜抗体阴性(+/-)。除非抗p24抗体效价强于以前的效价，接种的猫可能仍为病毒感染阴性。然而，对PBS对照来说，这样的免疫印迹反应性表明了FIV感染。FIV免疫印迹中核心p24和被膜抗体阳性(+/+)表明在接种组和PBS对照组中FIV感染阳性。
FIV病毒分离阴性(-)和阳性(+)基于RT和PCR。由于对麻醉的反应而在收获样品后意外死亡，cat#637缺少FIV免疫印迹和病毒分离(ND＝未进行)。
表4.HIV-1p24蛋白质免疫原性(3x免疫接种)和抗A/B亚型FIVBang攻击感染(25CID50)的效力(研究4)

Pre＝接种前；V3＝第三次接种后；5、7、9和12wpc＝用FIV-Bang(亚型A/B)体内接种物(混合感染血浆)攻击后5、7、9、12、16和19周。Ribi+FeIL-18由含每剂25μg细胞壁骨架的Ribi佐剂和每剂5μg猫IL-18组成。
FIV免疫印迹中核心p24和被膜(FIV gp95)抗体阴性(-/-)表明仍为FIV感染阴性。FIV免疫印迹中p24抗体阳性但是被膜抗体阴性(+/-)。除非抗p24抗体效价强于以前的效价，接种的猫可能仍为病毒感染阴性。然而，对PBS对照来说，这样的免疫印迹反应性表明了FIV感染。FIV免疫印迹中核心p24和被膜抗体阳性(+/+)表明在接种组和PBS对照组中FIV感染阳性。
FIV病毒分离阴性(-)和阳性(+)基于RT和PCR。
表5.HIV-1p24蛋白质的免疫原性(3x免疫接种)和抗B亚型FIVFC1攻击感染(15CID50)的和效力(研究5)

Pre＝接种前；V3＝第三次接种后；5，7，9和12wpc＝用FIV-FC1(B亚型)体内接种物(合并感染血浆)攻击后5、7、9、12和16周。Ribi+II-12由含每剂25μg细胞壁骨架的Ribi佐剂和每剂5μg人IL-18组成。
FIV免疫印迹中核心p24和被膜(FIV gp95)抗体阴性(-/-)表明仍为FIV感染阴性。FIV免疫印迹中p24抗体阳性但是被膜抗体阴性(+/-)。除非抗p24抗体效价强于以前的效价，接种的猫可能仍为病毒感染阴性。然而，对PBS对照来说，这样的免疫印迹反应性表明了FIV感染。
FIV免疫印迹中核心p24和被膜抗体阳性(+/±)表明Fel-O-Vax FIV组中抗体来自疫苗，并且这些猫未感染。
FIV免疫印迹中核心p24和被膜抗体阳性(+/+)表明在接种组和PBS对照组中FIV感染阳性。
FIV病毒分离阴性(-)和阳性(+)基于RT和PCR。
表6.总结表

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1.抑制或预防猫科动物感染猫免疫缺陷病毒(FIV)的方法，所述方法包括给所述动物施用有效数量的来源于灵长类动物免疫缺陷病毒的免疫原。
2.根据权利要求1的方法，其中所述灵长类动物免疫缺陷病毒为人免疫缺陷病毒(HIV)或猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。
3.根据权利要求2的方法，其中所述HIV为HIV-1或HIV-2。
4.根据权利要求3的方法，其中所述HIV-1选自HIV-1IIIB、HIV-1UCD1和HIV-1BRU。
5.根据权利要求1的方法，其中所述免疫原为病毒感染的细胞或无细胞全病毒。
6.根据权利要求5的方法，其中所述病毒以灭活或减毒病毒的方式处理或者该病毒为复制缺陷。
7.根据权利要求6的方法，其中所述病毒通过多聚甲醛、福尔马林、苯酚、紫外线或高温处理灭活或减毒。
8.根据权利要求1的方法，其中所述免疫原为所述灵长类动物免疫缺陷病毒的多肽或其免疫原性片段。
9.根据权利要求8的方法，其中所述多肽由所述灵长类动物免疫缺陷病毒的env、gag、pol、tat、rev、vif、vpr、vpu或nef基因编码。
10.根据权利要求8的方法，其中所述多肽为选自gp120和gp160的包膜蛋白或其免疫原性片段。
11.根据权利要求8的方法，其中所述多肽为包含SEQ ID NO1或SEQ ID NO5所示氨基酸序列的HIV包膜蛋白或其免疫原性片段。
12.根据权利要求8的方法，其中所述多肽为HIV的p24蛋白质或其免疫原性片段或者SIV的p27蛋白质或其免疫原性片段。
13.根据权利要求12的方法，其中所述p24蛋白质为HIV-1UCD1的p24蛋白质。
14.根据权利要求1的方法，其中所述免疫原为包含灵长类动物免疫缺陷病毒多核苷酸序列的重组病毒或重组表达构建体。
15.根据权利要求14的方法，其中所述多核苷酸序列为HIV-1、HIV-2或SIV序列。
16.根据权利要求14的方法，其中所述多核苷酸序列包含所述灵长类动物免疫缺陷病毒的一个或多个env、gag、pol、tat、rev、vif、vpr、vpu或nef基因或其免疫原性片段。
17.根据权利要求14的方法，其中所述多核苷酸序列编码HIV gp160、gp120、gp41、p31、p24、p17或p7多肽或者其免疫原性片段。
18.根据权利要求1的方法，其中所述方法还包括在施用来源于所述灵长类动物免疫缺陷病毒的所述免疫原后施用有效数量的来源于猫免疫缺陷病毒(FIV)的免疫原。
19.根据权利要求1的方法，其中所述免疫原与可药用载体或稀释剂一起提供或施用。
20.根据权利要求1的方法，其中所述免疫原与一种或多种增强所述动物对该免疫原免疫应答的佐剂一起提供或施用。
21.根据权利要求1的方法，其中所述免疫原经皮下、腹膜内、肌内、口腔施用或由鼻内施用。
22.根据权利要求20的方法，其中所述佐剂选自苏氨酰胞壁酰二肽(MDP)、包含细胞壁骨架(CWS)的Ribi佐剂系统、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、铝、氢氧化铝和皂苷。
23.根据权利要求1的方法，其中所述免疫原与细胞因子或淋巴因子组合施用。
24.根据权利要求23的方法，其中所述细胞因子或淋巴因子为猫细胞因子或淋巴因子。
25.根据权利要求1的方法，其中所述免疫原与白细胞介素-12、白细胞介素-15或白细胞介素-18组合施用。
26.根据权利要求1的方法，其中所述免疫原包含灵长类动物免疫缺陷病毒蛋白质的免疫原性或抗原性肽。
27.在猫科动物中抑制或产生针对FIV的免疫应答的方法，该方法包括给所述动物施用有效数量的来源于灵长类动物免疫缺陷病毒的免疫原。
28.根据权利要求27的方法，其中所述灵长类动物免疫缺陷病毒为人免疫缺陷病毒(HIV)或猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。
29.根据权利要求28的方法，其中所述HIV为HIV-1或HIV-2。
30.根据权利要求29的方法，其中所述HIV-1选自HIV-1IIIB、HIV-1UCD1和HIV-1BRU。
31.根据权利要求27的方法，其中所述免疫原为病毒感染的细胞或无细胞全病毒。
32.根据权利要求31的方法，其中所述病毒以灭活或减毒病毒的方式处理或者该病毒为复制缺陷。
33.根据权利要求32的方法，其中所述病毒通过用多聚甲醛、福尔马林、紫外线和高温处理灭活或减毒。
34.根据权利要求27的方法，其中所述免疫原为所述灵长类动物免疫缺陷病毒的多肽或者其免疫原性片段。
35.根据权利要求34的方法，其中所述多肽由所述灵长类动物免疫缺陷病毒的env、gag、pol、tat、rev、vif、vpr、vpu或nef基因编码。
36.根据权利要求34的方法，其中所述多肽为选自gp120和gp160的包膜蛋白或其免疫原性片段。
37.根据权利要求34的方法，其中所述多肽为HIV的p24蛋白质或者其免疫原性片段，或者为SIV的p27蛋白质或其免疫原性片段。
38.根据权利要求37的方法，其中所述p24蛋白质为HIV-1UCD1的p24蛋白质。
39.根据权利要求27的方法，其中所述免疫原为包含灵长类动物免疫缺陷病毒多核苷酸序列的重组病毒或重组表达构建体。
40.根据权利要求39的方法，其中所述多肽序列为HIV-1、HIV-2或SIV序列。
41.根据权利要求39的方法，其中所述多核苷酸序列包含该灵长类动物免疫缺陷病毒的一个或多个env、gag、pol、tat、rev、vif、vpr、vpu或nef基因或者其免疫原性片段。
42.根据权利要求39的方法，其中所述多核苷酸序列编码HIV gp160、gp120、gp41、p31、p24、p17或p7多肽或者其免疫原性片段。
43.根据权利要求27的方法，其中所述方法还包含在施用来源于所述灵长类动物免疫缺陷病毒的所述免疫原后施用有效数量的来源于猫免疫缺陷病毒(FIV)的免疫原。
44.根据权利要求27的方法，其中所述免疫原与可药用载体或稀释剂一起提供或施用。
45.根据权利要求27的方法，其中所述免疫原与一种或多种增强所述动物对该免疫原免疫应答的佐剂一起提供或施用。
46.根据权利要求27的方法，其中所述免疫原经皮下、腹膜内、肌内、口腔施用或由鼻内施用。
47.根据权利要求45的方法，其中所述佐剂选自苏氨酰胞壁酰二肽(MDP)、包括细胞壁骨架(CWS)的Ribi佐剂系统、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、铝、氢氧化铝和皂苷。
48.根据权利要求27的方法，其中所述免疫原与细胞因子或淋巴因子组合施用。
49.根据权利要求48的方法，其中所述细胞因子或淋巴因子为猫细胞因子或淋巴因子。
50.根据权利要求27的方法，其中所述与白细胞介素-12、白细胞介素-15或白细胞介素-18组合施用。
51.根据权利要求27的方法，其中所述免疫原包含灵长类动物免疫缺陷病毒蛋白质的免疫原性或抗原性肽。
52.根据权利要求27的方法，其中所述免疫应答为细胞免疫应答。
53.根据权利要求27的方法，其中所述免疫应答为体液免疫应答。
54.根据权利要求27的方法，其中所述免疫原诱导T-辅助细胞因子和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)细胞毒素的产生。
55.筛选病毒蛋白质表位的方法，其中所述表位在HIV和FIV间进化保守，该方法包括a)从感染所述HIV的长期病情稳定患者中分离HIV；b)用来源于所述HIV的免疫原免疫接种猫科动物；c)用感染性FIV攻击该猫科动物；d)确定该猫科动物是否预防感染所述FIV，其中预防该猫科动物感染的免疫原为包含所述HIV和FIV间进化保守表位的免疫原的标志。
56.组合物，其包含来源于灵长类动物免疫缺陷病毒的免疫原和猫细胞因子或淋巴因子。
57.根据权利要求56的组合物，其中所述猫淋巴因子为白细胞介素。
58.根据权利要求57的组合物，其中所述白细胞介素选自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21和IL-22。
59.根据权利要求57的组合物，其中所述白细胞介素选自IL-12、IL-15和IL-18。
60.根据权利要求57的组合物，其中所述灵长类动物免疫缺陷病毒为HIV或FIV。
61.根据权利要求60的组合物，其中所述HIV为HIV-1或HIV-2。
62.根据权利要求61的组合物，其中所述HIV-1病毒选自HIV-1IIIB、HIV-1UCD1和HIV-1BRU。
63.根据权利要求57的组合物，其中所述免疫原包含HIV env、pol、gag、tat、rev、vif、vpr、vpu、vpx或nef基因的多核苷酸序列。
64.根据权利要求57的组合物，其中所述免疫原包含HIV的gp160、gp120、gp41、p31、p24、p17或p7多肽或其免疫原性片段。
65.根据权利要求57的组合物，其中所述免疫原为HIV p24多肽或其免疫原性片段，并且所述白细胞介素选自猫IL-12、IL-15和IL-18。
66.试剂盒，其在一个或多个容器中包含a)来源于灵长类动物免疫缺陷病毒的免疫原；和b)猫细胞因子或淋巴因子。
67.根据权利要求66的试剂盒，其中所述猫淋巴因子为白细胞介素。
68.根据权利要求66的试剂盒，其中所述白细胞介素选自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21和IL-22。
69.根据权利要求66的试剂盒，其中所述白细胞介素选自IL-12、IL-15和IL-18。
70.根据权利要求66的试剂盒，其中所述灵长类动物免疫缺陷病毒为HIV或FIV。
71.根据权利要求70的试剂盒，其中所述HIV为HIV-1或HIV-2。
72.根据权利要求71的试剂盒，其中所述HIV-1病毒选自HIV-1IIIB、HIV-1UCD1和HIV-1BRU。
73.根据权利要求66的试剂盒，其中所述免疫原包含HIV env、pol、gag、tat、rev、vif、vpr、vpu、vpx或nef基因的多核苷酸序列。
74.根据权利要求66的试剂盒，其中所述免疫原包含HIV的gp160、gp120、gp41、p31、p24、p17或p7多肽或者其免疫原性片段。
75.根据权利要求66的试剂盒，其中所述免疫原为HIV p24多肽或其免疫原性片段，并且所述白细胞介素选自猫IL-12、IL-15和IL-18。
76.根据权利要求1的方法，其中所述免疫原诱导T-辅助细胞因子和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)细胞毒素的产生。
全文摘要
本发明涉及使用来源于灵长类动物免疫缺陷病毒(包括HIV和SIV)的免疫原预防猫科动物感染FIV的方法和组合物。描述了用受试疫苗组合物接种猫科动物的方法。在用FIV攻击时，根据本发明的方法和组合物接种的猫科动物表现出针对FIV的保护性体液和细胞免疫应答。
文档编号C07K14/155GK1812810SQ200480018243
公开日2006年8月2日 申请日期2004年5月12日 优先权日2003年5月12日
发明者J·K·亚马莫托 申请人:佛罗里达大学研究基金公司